猪流行性腹泻SSUB1/SUB蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210523652.4	申请日：	2012.12.06
公开号：	CN103194472A	公开日：	2013.07.10
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/62申请日:20121206\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/62; C07K19/00; C12N15/63; C12N1/21; A61K48/00; A61K39/215; A61P31/14; C12R1/11(2006.01)N	主分类号：	C12N15/62
申请人：	武汉华扬动物药业有限责任公司
发明人：	张金林; 马立保; 胡晓芬
地址：	430205 湖北省武汉市东湖高新技术开发区关南东二园黄龙山路15号
优先权：	2011.12.16 CN 201110424704.8
专利代理机构：	北京市德权律师事务所 11302	代理人：	刘丽君
PDF下载：	PDF下载

内容摘要

本发明公开了猪流行性腹泻S1蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用。本发明将猪流行性腹泻病毒S糖蛋白的S1抗原位点和细胞壁锚定序列连接得到SEQ ID No.1所示的抗原融合基因。本发明进一步的构建了含有该抗原融合基因的分泌表达载体，将其转化到巨大芽孢杆菌中在其细胞壁或其表面表达重组蛋白。免疫印迹试验表明，所表达的重组蛋白能够与PEDV免疫血清发生反应，表明本发明所制备的重组蛋白与PEDV天然抗原一样具有相同的抗原性。诱导表达后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的重组蛋白定位于菌体的表面。实验结果表明，本发明所制备的重组蛋白能够用于制备成防治猪流行性腹泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。

权利要求书

权利要求书
1.   猪流行性腹泻S1蛋白抗原融合基因，其特征在于：其多核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示。

2.   由权利要求1所述融合基因编码的蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ IDNo.2所示。

3.   含有权利要求1所述融合基因的重组表达载体。

4.   含有权利要求3所述重组表达载体的重组宿主株。

5.   按照权利要求4所述的重组宿主株，其特征在于：所述的重组宿主株是重组巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium)菌株，其微生物保藏号是：CCTCC No:M2011445。

6.   权利要求1所述的猪流行性腹泻S1蛋白抗原融合基因在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。

7.   权利要求2所述的蛋白在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。

8.   权利要求3所述的表达载体在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。

9.   权利要求4或5所述的重组宿主株在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。

10.   按照权利要求6‑9所述的用途，其特征在于：所述的疫苗是粘膜免疫活菌疫苗。

说明书

说明书猪流行性腹泻S1蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用
技术领域
本发明涉及抗原融合基因以及含有该抗原融合基因的重组菌株，尤其涉及猪流行性腹泻S1蛋白融合基因以及含有该融合基因的表达载体，本发明进一步涉及含有该表达载体的重组巨大芽孢杆菌菌株以及它们在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的应用，属于猪流行性腹泻的防治领域。
背景技术
猪流行性腹泻（PEDV）是由冠状病毒引起猪的一种急性高度接触性传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征，该病在世界范围内广泛分布，危害严重，给养猪业带来重大经济损失。病毒主要通过肠道感染猪，具有明显的肠道组织嗜性的特点，在抗PEDV感染免疫过程中除体液免疫和细胞免疫外，局部肠粘膜免疫系统发挥着不可替代的作用。
PEDV具有典型的冠状病毒结构，由4种主要结构蛋白组成，分别为磷酸化的核衣壳蛋白（N）、膜蛋白（M）、糖基化的纤突蛋白（S）和小囊膜蛋白（E）其中S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇能够诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的重要结构蛋白，因此，S蛋白对病毒感染、发挥其致病性和决定宿主细胞亲嗜性方面起关键作用。PEDV感染具有明显的嗜肠性，分泌型IgA抗体是保护猪体不受PEDV感染和免于发病的关键因素，口服免疫后，在肠液和血清中均可检出sIgA抗体，而非口服途径接种则检测不到sIgA。仔猪可通过初乳获得母源sIgA，产生对流行性腹泻的被动免疫保护。
常规的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治这两种疾病中起到了积极作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些问题，如灭活疫苗免疫原性差，不能有效诱导slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接种后的动物机体排散病毒、病毒毒力可能返强等，另外必须通过注射途径免疫。针对猪流行性腹泻的特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径，但是如何避免胃肠道对抗原的破坏并有效诱导免疫应答成为关键。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种猪流行性腹泻S1蛋白抗原融合基因及其编码的蛋白；
本发明的目的之二是提供含有上述猪流行性腹泻S1蛋白抗原融合基因的表达载体；
本发明的目的之三提供含有上述表达载体的重组宿主菌株。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种由PEDV糖蛋白S的S1抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列（CWAM6）连接得到的融合基因，其多核苷酸序列为SEQID No.1所示。
本发明根据Genbank登录的PEDV全基因序列AF353511，找出编码S糖蛋白的22‑505aa段序列，通过柔性的Linker((GGGGS)3)将PEDV的S1抗原位点基因和细胞壁锚定序列（CWAM6）连接起来，将该序列命名为MLS1（SEQ ID No.1）。考虑到巨大芽孢杆菌密码子的偏嗜情况，本发明为了提高异源基因在宿主菌中的表达，并保证翻译后的氨基酸不变的情况下，对稀有密码子苏氨酸（ACG）、组氨酸（CAC）、精氨酸（CGG、CGA）、丙氨酸（GCG）和亮氨酸（CTC、CTG）等进行改变。此外，在MLS1的上游和下游分别引入BglⅡ酶切位点和SphI酶切位点。
本发明的另一方面是提供由SEQ ID No.1所示融合基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。。
本发明的又一方面是提供含有所述猪流行性腹泻S1蛋白融合基因的表达载体；例如，将本发明SEQ ID No.1所示的抗原融合基因与表达载体pHIS1525进行可操作性的连接，得到可以在巨大芽孢杆菌的外表面或其细胞壁表达融合基因的分泌表达载体。
针对PEDV经黏膜感染和sIgA在抵抗疾病中具有重要作用的特点，本发明构建了表达PEDV S1蛋白的重组巨大芽孢杆菌表达系统，作为一种口服疫苗，通过刺激肠道黏膜免疫系统产生的特异性sIgA，达到阻止病原感染的目的。
由此，本发明的再一方面是提供一株表达猪流行性腹泻S1蛋白融合基因的重组巨大芽孢杆菌菌株，能够用其制备成防治猪流行性腹泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。
本发明将SEQ ID No.1所示的融合基因与分泌表达载体pHIS1525进行双酶切、连接并经原生质体转化转入宿主菌巨大芽孢杆菌WH320细胞，获得含有重组质粒的重组巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）菌株（WH320‑pHIS1525‑MLS1）；其微生物保藏号是：CCTCC No:M2011445；分类命名是：巨大芽孢杆菌WH320‑pHIS1525‑MLS1(Bacillus megaterium WH320‑pHIS1525‑MLS1)；保藏时间是2011年12月5日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：中国武汉武汉大学。
进一步的，本发明将重组巨大芽孢杆菌菌株（WH320‑pHIS1525‑MLS1）用加入终浓度为0.2%木糖进行诱导，使融合基因在菌体表面进行表达；免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性，能够用于制备成防治猪流行性腹泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。间接免疫荧光检测也证实表达蛋白存在于菌体上，诱导表达后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的蛋白初步定位于菌体的表面，存在菌体表面的目的蛋白，为抗原物质有效刺激免疫系统，提高抗体水平奠定了重要的物质基础。
本发明在实验设计上以阻断肠道传染病疾病病原感染的第一道防线为目的，使用安全无毒的巨大芽孢杆菌表达系统，巨大芽孢杆菌不产细胞内毒素，不产胞外碱性蛋白酶，有利于所表达蛋白的稳定积累，质粒稳定，可以稳定高效地表达蛋白，比较适合工业化发酵生产。同时芽孢杆菌在肠道定植后，能消耗大量的游离氧，造成厌氧环境，可减少需氧菌对肠道的定植。也有利于乳酸杆菌和双歧杆菌等厌氧菌的生长，致使体内的有益菌增加而致病菌减少，保持肠道微生态系统平衡。
为了检验本发明重组巨大芽孢杆菌或该重组巨大芽孢杆菌所表达的融合蛋白MLS1作为防治猪传染性胃肠炎口服疫苗的可行性，本发明将构建的重组巨大芽孢杆菌WH320‑pHIS1525‑MLS1口服免疫小鼠，不同时间测定肠道粪便中特异性抗体sIgA的水平；试验结果发现，重组巨大芽孢杆菌WH320‑pHIS1525‑MLS1在连续3次免疫后诱导小鼠产生了明显的抗PEDV‑S蛋白的分泌性sIgA抗体反应。重组菌组后期采样抗体一直上升，各时间点采样抗体水平均明显高于免疫之初及对照菌（免疫空载体转化菌WH320‑pHIS1525）组和PBS组（p<0.05），重组菌组38d时抗体水平达到顶峰（p<0.05），之后下降，至60d时抗体水平仍明显高于对照组（p<0.05）。
试验结果表明，本发明所构建的重组巨大芽孢杆菌或所表达的融合蛋白MLS1能有效的刺激小鼠肠道免疫系统产生特异性免疫应答，能将其制备成防治猪传染性胃肠炎的口服疫苗。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“重组宿主菌株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605‑2608(1985);Rossolini et al.,Mol Cell.Probes 8:91‑98(1994)）。
术语“表达”为外源基因在宿主中的转录或/和翻译。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白（即抗原），其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
附图说明
图1PCR产物电泳结果；1‑3、MLS1PCR产物；M、DL2000。
图2表达质粒pHIS1525的酶切检测；1‑2、质粒pHIS1525酶切产物；M、DL2000。
图3PCR产物电泳结果；1‑3：BglII和SphI双酶切，得到的片段分别约为7500bp、1920bp；M1：DL2000；M2：DL15000。
图4表达产物的SDS‑PAGE和Western‑blot分析；M：蛋白质分子量标准；1：重组巨大芽孢杆菌WH320‑pHIS1525诱导后的蛋白质；2‑4、重组巨大芽孢杆菌WH320‑pHIS1525‑MLS1诱导后的蛋白质；5：重组巨大芽孢杆菌WH320‑pHIS1525‑MLS1诱导后的蛋白质的免疫印迹。
图5表达产物的间接免疫荧光检测（×40）；A：WH320‑pHIS1525‑MLS1重组菌的IFA试验结果，菌体细胞散发了强烈的黄绿色荧光；B：WH320‑pHIS1525重组菌的IFA试验结果，没有荧光，菌体呈红色。
图6重组巨大芽孢杆菌免疫小鼠后不同时间点小鼠粪便特异性sIgA测定结果。
图7重组巨大芽孢杆菌免疫小鼠后不同时间点小鼠粪便特异性sIgA测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1  MLS1基因巨大芽孢杆菌分泌表达载体的构建及鉴定
1抗原表位序列MLS1的设计与合成
根据Genbank登录的PEDV全基因序列AF353511，找出编码S糖蛋白的22‑505aa段序列，通过柔性的Linker((GGGGS)3)将PEDV的S1抗原位点基因和细胞壁锚定序列（CWAM6）连接起来，该序列命名为MLS1（SEQ ID No.1）。对稀有密码子苏氨酸（ACG）、组氨酸（CAC）、精氨酸（CGG、CGA）、丙氨酸（GCG）和亮氨酸（CTC、CTG）等进行改变，但不改变其所编码的氨基酸。在MLS1的上游和下游分别引入BglⅡ酶切位点和SphI酶切位点。将设计好的MLS1序列进行人工合成，构建了重组质粒pMD18‑MLS1。
pMDl8‑T Simple Vector购自TaKaRa(大连)公司，pMD18‑MLS1的具体构建过程如下：
PCR扩增目的基因,在PCR反应管中按照表1所示加入试剂和溶液。
表1MLS1的PCR反应体系

P1：5'‑GA AGA TCT ATGGATGTCACTAGGTGCCAGT  3'
P2：5'‑ACAT GCA TGC GTTTTCTTCTTTGCGTTTTACA 3'
混匀并离心后放置于PCR仪中，94℃预变性5min后，进行如下循环：94℃，30s；54℃，30s；72℃，30s。30个循环后72℃延伸10min。PCR扩增完成后，取5μL产物用l％琼脂糖凝胶电泳观察。并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物，参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收PCR反应产物，操作步骤如下：
将100μL PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外线灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，加入3个凝胶体积的DE‑A（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂）溶液，混合均匀后于75℃加热融化。加0.5个DE‑A体积的DE‑B（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂）溶液，混合均匀。取以上混合液，转移至DNA制备管中离心弃滤液。将制备管置回离心管，加0.5ml W1（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂）溶液，12000rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，加0.7ml W2（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂）溶液，12000rpm离心30s，弃滤液，重复此步骤一次。将制备管置回离心管中，12000rpm离心1min。将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜正中央加适量（20μL）水或洗脱液室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱DNA。取回收产物1μL 1％琼脂糖凝胶中进行电泳，检测回收结果。并于‑20℃保存备用。
PCR产物与克隆载体的连接及转化
按pMDl8‑T Simple Vector说明书将回收的PCR产物与pMDl8‑T Simple Vector连接。连接体系见表2：
表2连接反应体系

混匀后离心，置于16℃水浴连接4h，4℃过夜。连接后，含有MLS1序列的质粒命名为pMD18‑MLS1。
2重组表达载体的构建
将pMD18‑MLS1质粒和分泌表达的载体质粒pHIS1525（质粒pHIS1525购于MoBiTec公司）分别用BglⅡ+SphI双酶切后回收，用T4DNA ligase连接起来构建成重组质粒pHIS1525‑MLS1。
2.1MLS1序列的酶切与回收
酶切反应体系见表3。
表3  Bgl Ⅱ、SphI双酶切反应体系

将100μL酶切产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物，参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收PCR反应产物，操作步骤如下：
将100μL PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外线灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，加入3个凝胶体积的DE‑A溶液，混合均匀后于75℃加热融化。加0.5个DEA体积的DE‑B溶液，混合均匀。取以上混合液，转移至DNA制备管中离心弃滤液。将制备管置回离心管，加0.5ml Wl溶液，12000rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液，12000rpm离心30s，弃滤液，重复此步骤一次。将制备管置回离心管中，12000rpm离心1min。将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜正中央加适量（20μL）水或洗脱液室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱DNA。取回收产物1μL 1%琼脂糖凝胶中进行电泳，检测回收结果，核苷酸片段大小与预期结果相符约1920bp（图1）。
2.2巨大芽孢杆菌分泌表达的载体pHIS1525的酶切与回收
将巨大芽孢杆菌分泌表达的载体pHIS1525的大量酶切，酶切反应体系见表4。
表4Bgl Ⅱ、SphI双酶切反应体系

将100μL酶切产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物，具体步骤参考以上，取回收产物1μL 1％琼脂糖凝胶中进行电泳（图2），检测回收结果。并于‑20℃保存备用。
2.3MLS1基因巨大芽孢杆菌分泌表达载体的构建
将以上步骤制备的酶切纯化产物进行连接，连接体系见表5。
表5  MLS1基因分泌表达的载体pHIS1525连接反应体系

16℃水浴连接4h后，4℃过夜。
连接产物的纯化：将连接产物转移至1.5ml离心管中，加入2.0μL的3mol/L醋酸钠（pH5.2）和50μL的无水乙醇轻轻混匀，置于‑20℃、1h后，4℃、12000rpm离心30min，小心移去上清，加入500μL的70％乙醇，4℃、12000rpm离心5min，小心移去上清，风干至无乙醇气味，加入4μL灭菌去离子水溶解沉淀，‑20℃保存备用。
2.4pHIS1525‑MLS1质粒的双酶切、PCR鉴定
（1）将上述所回收的质粒，用BglⅡ、SphI双酶切，酶切反应体系见表6。
表6  pHIS1525‑MLS1质粒的双酶切反应体系

轻轻混匀以上组分，37℃水浴4h，取5μL酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察。能切出目的片段和pHIS1525载体大小一致的质粒鉴定为阳性。
（2）将上述所提取的质粒用灭菌蒸馏水稀释100倍，取2μL作为模板，进行PCR鉴定，取回收产物1μL 1%琼脂糖凝胶中进行电泳，检测回收结果，核苷酸片段大小与预期结果相符约1920bp（图3），表明MLS1基因己插入到表达载体pHIS1525的酶切位点Bgl Ⅱ、SphI之间，将获得的阳性重组质粒命名为pHIS1525‑MLS1。将获得的阳性重组菌株命名为WH320‑pHIS1525‑MLS1菌株。
实施例2MLS1基因巨大芽孢杆菌的转化及表达鉴定
1巨大芽孢杆菌原生质体制备
挑取一环巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）WH320（购于MoBiTec公司）在LB平板上划线，37℃过夜培养，从上述平板挑取一单菌落接种到1×AB3液体培养基中，200r/min 37℃过夜培养；取上述种子液1ml转入装有50ml 1×AB3培养基的250ml 三角瓶，200r/min37℃培养至OD600≈1.0离心收集菌体，加入5ml SMMP溶液悬浮菌体；将菌液转入100ml三角瓶中，加入终浓度为0.1mg/ml的溶菌酶，置37℃水浴保温30min，其间用显微镜观察原生质体的形成，使原生质体的形成在一半左右为宜；离心10min收集原生质体，用适量的SMMP缓冲液洗脱一次，最后用5ml SMMP溶液悬浮菌体。
2巨大芽抱杆菌原生质体转化
取100μL原生质体于1.5ml EP管内，依次加入约1μg重组表达载体质粒、300μLpEG‑P，室温下保温2min；加入1ml SMMP溶液缓慢混合均匀；室温下3000r/min离心10min，轻轻去掉上清液，此时一般看不到任何沉淀；加入500μL SMMP溶液于EP管内，将其置37℃培养90min；将2.5ml CR5‑top上层琼脂置于60℃水浴中备用（该琼脂用5ml离心管装）；90min后取200μL菌液加到预先预热的CR5‑top上层琼脂，混合均匀后将其倒入LB平板上（含10μg/ml四环素），用玻棒涂布均匀，37℃培养过夜。同时，以不含目的基因的空载体按以上步骤进行转化作为阳性对照。
3重组巨大芽孢杆菌MLS1基因的诱导表达及鉴定
WH320‑pHIS1525与WH320‑pHIS1525‑MLS1接种10ml LB液体培养基，37℃剧烈振荡培养过夜，再分别以5%接种量接种到50ml LB液体中进行扩增培养，培养4h后取出一瓶WH320‑pHIS1525‑MLS1作为诱导前的样品，其余加入终浓度为0.2%木糖诱导6‑9h，分别取工程菌WH320‑pHIS1525‑MLS1诱导前、诱导后6‑9h上清液及阳性对照菌株（WH320‑pHIS1525）上清液6ml，经4倍体积的丙酮沉淀后获得上清液蛋白，加入40μL2×上样buffer混匀后煮沸5min后，离心取20μL上清液进行SDS‑PAGE电泳检测。
4表达产物的免疫印记（western‑blot）分析
将上述电泳结束后的凝胶经转印装置将蛋白转移到经转印缓冲液平衡的硝酸纤维素膜上，接通电源，0.5‑1mA/cm2转印1h。转印结束后，兔抗PEDV血清作为第一抗体,以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG作为第二抗体，4‑氯‑1‑萘酚底物显色溶液中显色20min，检测表达产物的抗原活性。
结果表明，重组巨大芽孢杆菌WH320‑pHIS1525‑MLS1在约64kDa处有表达带，目的基因在工程菌中得到了有效的表达（如箭头所示）（图4），随着诱导时间的增加，上清液中目的蛋白的含量也逐步增加，而阳性对照菌上清液中不含目的蛋白。通过Western‑blot检测表明重组蛋白具有与PEDV全病毒制备的抗血清发生反应的能力，并具有良好的特异性，即反应原性。
5间接免疫荧光
取12h培养的阳性重组菌和空载体对照菌液体培养物0.5mL离心去上清后，分别用PBS低速离心洗3次，加入兔源抗TGEV抗血清，悬浮混合后37℃作用30min，离心去上清，PBS离心洗菌体3次，加入稀释的含有伊文思蓝的抗兔荧光标记二抗，悬浮混合后37℃作用30min，离心去上清，PBS离心洗菌体3次，菌体沉淀物悬浮在200μL PBS，取适量涂片，自然干燥，冷丙酮固定30min，干燥后荧光显微镜观察。
以WH320‑pHIS1525‑MLS1重组菌和WH320‑pHIS1525对照菌所进行的间接免疫荧光实验结果表明，重组菌WH320‑pHIS1525‑MLS1荧光显微镜检查可见明显的黄绿色荧光，由此也表明，重组菌所表达的外源蛋白是存在于菌体的表面位置；WH320‑pHIS1525未发现绿色荧光，菌体被染成红色（图5）。
试验例1  重组巨大芽孢杆菌的免疫保护效力试验
1.试验方法
1.1供试菌株：本发明实施例1所构建的重组菌WH320‑pHIS1525‑MLS1；
1.2实验动物分组及免疫
实验动物：体重18‑20g 6‑8周龄清洁级BALB/c小鼠30只，购自湖北省实验动物研究中心。
免疫组别：将实验动物随机分成3组，每组10只，即重组菌组（WH320‑pHIS1525‑MLS1）、对照菌（WH320‑pHIS1525）组和PBS对照组，重组菌组和对照菌组每只小鼠以2×1010个/mL细菌口服接种0.1mL，PBS对照组口服同体积的PBS液。
免疫程序：免疫3次，每隔2周免疫一次，每次连续免疫3d，每天1次。
1.3样品采集与处理
分别于18d、32d、38d、46d、60d收集免疫小鼠新鲜粪便样品。－70℃冻存备用。
粪便样品处理：检测前，每0.1g粪便加入1mL粪便提取液，置于振荡器上，振荡30min，4℃浸润过夜。10000r/min离心5min，收集上清用作检测样品。
1.4免疫小鼠粪便特异性sIgA测定
采用间接ELISA方法进行。以PEDV全病毒抗原包被96孔聚苯乙烯微量板37℃反应2h，0.01mol/L PBST液洗3次。用含有0.5%聚乙烯醇的0.01mol/L PBS液37℃封闭4h，0.01mol/L PBST液洗3次。分别加入处理好的粪便上清，37℃反应1h，0.01mol/L PBST洗3次。加入1：2000稀释的HRP标记羊抗鼠IgA（购自华美生物工程有限公司），37℃反应1h，0.01mol/L PBST液洗3次。加OPD‑H2O2底物显色液避光显色15min。加终止液后，自动酶标测定仪在波长492nm处测定每孔的光吸收（OD490）值。
2试验结果
试验结果见图6、图7和表7。重组巨大芽孢杆菌WH320‑pHIS1525‑MLS1在连续3次免疫后诱导小鼠产生了明显的抗PEDV‑S蛋白的分泌性sIgA抗体反应。重组菌组后期采样抗体一直上升，各时间点采样抗体水平均明显高于免疫之初及对照菌组和PBS组（p<0.05），重组菌组38d时抗体水平达到顶峰（p<0.05），之后下降，至60d时抗体水平仍明显高于对照组（p<0.05）。免疫空载体转化菌WH320‑pHIS1525的小鼠和阴性对照组小鼠在免疫前后分泌性sIgA抗体水平未出现明显差别。
试验结果表明，本发明重组巨大芽孢杆菌或其所表达的融合蛋白MLS1可有效的刺激小鼠肠道免疫系统产生特异性免疫应答，证明了将重组巨大芽孢杆菌或其所表达的融合蛋白MLS1作为防治猪传染性胃肠炎口服疫苗的可行性。
表7  重组巨大芽孢杆菌免疫小鼠特异性sIgA测定

注：*表示重组菌组后期采样与0天采样比较（P<0.05）；#表示重组菌组与对照菌及PBS组比较（P<0.05）。

资源描述

《猪流行性腹泻SSUB1/SUB蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪流行性腹泻SSUB1/SUB蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用.pdf（23页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 103194472 A (43)申请公布日 2013.07.10 CN 103194472 A *CN103194472A* (21)申请号 201210523652.4 (22)申请日 2012.12.06 CCTCC No:M2011445 2011.12.05 201110424704.8 2011.12.16 CN C12N 15/62(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 39/215(2006.01) A61P。

2、 31/14(2006.01) C12R 1/11(2006.01) (71)申请人武汉华扬动物药业有限责任公司地址 430205 湖北省武汉市东湖高新技术开发区关南东二园黄龙山路 15 号 (72)发明人张金林马立保胡晓芬 (74)专利代理机构北京市德权律师事务所 11302 代理人刘丽君 (54) 发明名称猪流行性腹泻S1蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用 (57) 摘要本发明公开了猪流行性腹泻S1蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用。本发明将猪流行性腹泻病毒 S 糖蛋白的 S1抗原位点和细胞壁锚定序列连接得到 SEQ ID No.1 所示的抗原融合基因。本。

3、发明进一步的构建了含有该抗原融合基因的分泌表达载体，将其转化到巨大芽孢杆菌中在其细胞壁或其表面表达重组蛋白。免疫印迹试验表明，所表达的重组蛋白能够与 PEDV 免疫血清发生反应，表明本发明所制备的重组蛋白与 PEDV 天然抗原一样具有相同的抗原性。诱导表达后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的重组蛋白定位于菌体的表面。实验结果表明，本发明所制备的重组蛋白能够用于制备成防治猪流行性腹泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。 (66)本国优先权数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 10 页序列表 9 页附图 2 页 (19)中华。

4、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书10页序列表9页附图2页 (10)申请公布号 CN 103194472 A CN 103194472 A *CN103194472A* 1/1 页 2 1.猪流行性腹泻S1蛋白抗原融合基因，其特征在于：其多核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示。 2. 由权利要求 1 所述融合基因编码的蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为 SEQ IDNo.2 所示。 3. 含有权利要求 1 所述融合基因的重组表达载体。 4. 含有权利要求 3 所述重组表达载体的重组宿主株。 5. 按照权利要求 4 所述的重组宿主株，其特征在。

5、于：所述的重组宿主株是重组巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium) 菌株，其微生物保藏号是： CCTCC No:M2011445。 6. 权利要求 1 所述的猪流行性腹泻 S1 蛋白抗原融合基因在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。 7. 权利要求 2 所述的蛋白在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。 8. 权利要求 3 所述的表达载体在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。 9. 权利要求 4 或 5 所述的重组宿主株在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。 10. 按照权利要求 6-9 所述的用途，其特征在于：所述的疫苗是粘膜免疫活菌疫苗。权利要求书 CN 。

6、103194472 A 2 1/10 页 3 猪流行性腹泻S1蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用技术领域 0001 本发明涉及抗原融合基因以及含有该抗原融合基因的重组菌株，尤其涉及猪流行性腹泻 S1蛋白融合基因以及含有该融合基因的表达载体，本发明进一步涉及含有该表达载体的重组巨大芽孢杆菌菌株以及它们在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的应用，属于猪流行性腹泻的防治领域。背景技术 0002 猪流行性腹泻（PEDV）是由冠状病毒引起猪的一种急性高度接触性传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征，该病在世界范围内广泛分布，危害严重，给养猪业带来重大经济损失。病毒主要通过肠道感染猪。

7、，具有明显的肠道组织嗜性的特点，在抗 PEDV 感染免疫过程中除体液免疫和细胞免疫外，局部肠粘膜免疫系统发挥着不可替代的作用。 0003 PEDV 具有典型的冠状病毒结构，由 4 种主要结构蛋白组成，分别为磷酸化的核衣壳蛋白（N）、膜蛋白（M）、糖基化的纤突蛋白（S）和小囊膜蛋白（E）其中 S 糖蛋白携带主要的 B 淋巴细胞抗原决定簇能够诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的重要结构蛋白，因此， S 蛋白对病毒感染、发挥其致病性和决定宿主细胞亲嗜性方面起关键作用。PEDV 感染具有明显的嗜肠性，分泌型 IgA 抗体是保护猪体不受 PEDV 感染和免于发病。

8、的关键因素，口服免疫后，在肠液和血清中均可检出 sIgA 抗体，而非口服途径接种则检测不到 sIgA。仔猪可通过初乳获得母源 sIgA，产生对流行性腹泻的被动免疫保护。 0004 常规的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治这两种疾病中起到了积极作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些问题，如灭活疫苗免疫原性差，不能有效诱导 slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接种后的动物机体排散病毒、病毒毒力可能返强等，另外必须通过注射途径免疫。针对猪流行性腹泻的特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径，但是如何避免胃肠道对抗原的破坏并有效诱导免疫应答成为关键。发明内容 0005 本发明。

9、的目的之一是提供一种猪流行性腹泻 S1蛋白抗原融合基因及其编码的蛋白； 0006 本发明的目的之二是提供含有上述猪流行性腹泻 S1蛋白抗原融合基因的表达载体； 0007 本发明的目的之三提供含有上述表达载体的重组宿主菌株。 0008 为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种由PEDV糖蛋白S的S1抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列（CWAM6）连接得到的融合基因，其多核苷酸序列为 SEQID No.1 所示。 0009 本发明根据 Genbank 登录的 PEDV 全基因序列 AF353511，找出编码 S 糖蛋白的 22-505aa 段序列，通过柔性的 Linker(。

10、GGGGS)3) 将 PEDV 的 S1抗原位点基因和细胞壁锚定序列（CWAM6）连接起来，将该序列命名为 MLS1（SEQ ID No.1）。考虑到巨大芽孢杆菌密码子说明书 CN 103194472 A 3 2/10 页 4 的偏嗜情况，本发明为了提高异源基因在宿主菌中的表达，并保证翻译后的氨基酸不变的情况下，对稀有密码子苏氨酸（ACG）、组氨酸（CAC）、精氨酸（CGG、 CGA）、丙氨酸（GCG）和亮氨酸（CTC、 CTG）等进行改变。此外，在 MLS1的上游和下游分别引入 Bgl 酶切位点和 SphI 酶切位点。 0010 本发明。

11、的另一方面是提供由 SEQ ID No.1 所示融合基因编码的蛋白，其氨基酸序列为 SEQ ID No.2 所示。。 0011 本发明的又一方面是提供含有所述猪流行性腹泻S1蛋白融合基因的表达载体；例如，将本发明 SEQ ID No.1 所示的抗原融合基因与表达载体 pHIS1525 进行可操作性的连接，得到可以在巨大芽孢杆菌的外表面或其细胞壁表达融合基因的分泌表达载体。 0012 针对 PEDV 经黏膜感染和 sIgA 在抵抗疾病中具有重要作用的特点，本发明构建了表达 PEDV S1蛋白的重组巨大芽孢杆菌表达系统，作为一种口服疫苗，通过刺激肠道黏膜免疫系统产生的特。

12、异性 sIgA，达到阻止病原感染的目的。 0013 由此，本发明的再一方面是提供一株表达猪流行性腹泻 S1 蛋白融合基因的重组巨大芽孢杆菌菌株，能够用其制备成防治猪流行性腹泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。 0014 本发明将 SEQ ID No.1 所示的融合基因与分泌表达载体 pHIS1525 进行双酶切、连接并经原生质体转化转入宿主菌巨大芽孢杆菌 WH320 细胞，获得含有重组质粒的重组巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）菌株（WH320-pHIS1525-MLS1）；其微生物保藏号是： CCTCC No:M2011445 ；分类命名是。

13、：巨大芽孢杆菌 WH320-pHIS1525-MLS1(Bacillus megaterium WH320-pHIS1525-MLS1) ；保藏时间是2011年12月5日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：中国武汉武汉大学。 0015 进一步的，本发明将重组巨大芽孢杆菌菌株（WH320-pHIS1525-MLS1）用加入终浓度为 0.2% 木糖进行诱导，使融合基因在菌体表面进行表达；免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与 TGEV 免疫血清发生反应，表明重组蛋白与 TGEV 天然抗原一样具有相同的抗原性，能够用于制备成防治猪流行性腹。

14、泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。间接免疫荧光检测也证实表达蛋白存在于菌体上，诱导表达后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的蛋白初步定位于菌体的表面，存在菌体表面的目的蛋白，为抗原物质有效刺激免疫系统，提高抗体水平奠定了重要的物质基础。 0016 本发明在实验设计上以阻断肠道传染病疾病病原感染的第一道防线为目的，使用安全无毒的巨大芽孢杆菌表达系统，巨大芽孢杆菌不产细胞内毒素，不产胞外碱性蛋白酶，有利于所表达蛋白的稳定积累，质粒稳定，可以稳定高效地表达蛋白，比较适合工业化发酵生产。同时芽孢杆菌在肠道定植后，能消耗大量的游离氧，造成厌氧环境，可减少需氧菌对。

15、肠道的定植。也有利于乳酸杆菌和双歧杆菌等厌氧菌的生长，致使体内的有益菌增加而致病菌减少，保持肠道微生态系统平衡。 0017 为了检验本发明重组巨大芽孢杆菌或该重组巨大芽孢杆菌所表达的融合蛋白 MLS1作为防治猪传染性胃肠炎口服疫苗的可行性，本发明将构建的重组巨大芽孢杆菌 WH320-pHIS1525-MLS1口服免疫小鼠，不同时间测定肠道粪便中特异性抗体 sIgA 的水平；试验结果发现，重组巨大芽孢杆菌 WH320-pHIS1525-MLS1在连续 3 次免疫后诱导小鼠产生了明显的抗 PEDV-S 蛋白的分泌性 sIgA 抗体反应。重组菌组后期采样抗体一直上升，各时间点。

16、采样抗体水平均明显高于免疫之初及对照菌（免疫空载体转化菌 WH320-pHIS1525）组说明书 CN 103194472 A 4 3/10 页 5 和 PBS 组（p 武汉华扬动物药业有限责任公司猪流行性腹泻 S1 蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用 DQXL-0018 2 PatentIn version 3.5 1 1920 DNA Artifical sequence CDS (1)(1920) 1 aug gat gtc act agg tgc cag tct act act aac ttt agg cgt ttc ttt 48 Met Asp Val Thr Arg。

17、 Cys Gln Ser Thr Thr Asn Phe Arg Arg Phe Phe 1 5 10 15 tca aaa ttt aat gtt cag gca cct gcc gtc gtc gtt ttg ggt ggt tac 96 Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val Leu Gly Gly Tyr 20 25 30 cta cct agt atg aac tct tct agc tgg tac tgt ggc aca ggc att gaa 144 Leu Pro Ser Met Asn Ser Ser Ser Trp T。

18、yr Cys Gly Thr Gly Ile Glu 35 40 45 act gct agt ggc gtt cat ggt att ttt ctc agc tac atc gat tct ggt 192 Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Leu Ser Tyr Ile Asp Ser Gly 50 55 60 cag ggc ttt gag att ggc att tct caa gag cct ttt gat cct agt ggt 240 序列表 CN 103194472 A 13 2/9 页 14 Gln Gly Phe Glu Ile Gl。

19、y Ile Ser Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly 65 70 75 80 tac cag ctt tat tta cat aag gcc act aat ggt aac act aat gct att 288 Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Ile 85 90 95 gca cgt ctg cgc att tgc cag ttt ccc gat aat aaa aca ttg ggc cct 336 Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro A。

20、sp Asn Lys Thr Leu Gly Pro 100 105 110 act gtt aat gat gtt aca aca ggt cgt aac tgc cta ttc aac aaa gcc 384 Thr Val Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala 115 120 125 att cca gct tat atg cgt gat gga aaa gat att gtt gtc ggc ata aca 432 Ile Pro Ala Tyr Met Arg Asp Gly Lys Asp Ile Val V。

21、al Gly Ile Thr 130 135 140 tgg gat aat gat cgt gtc act gtt ttt gct gac aag atc tat cat ttt 480 Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ala Asp Lys Ile Tyr His Phe 145 150 155 160 tat ctt aaa aat gat tgg tcc cgc gtt gct aca aga tgt tac aat cgc 528 Tyr Leu Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr Arg Cys Tyr A。

22、sn Arg 165 170 175 aga agt tgt gct atg caa tat gtt tat aca cct acc tac tac atg ctt 576 Arg Ser Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Thr Pro Thr Tyr Tyr Met Leu 180 185 190 aat gtt act agt gca ggt gag gat ggc att tat tat gaa ccc tgt aca 624 Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Tyr Tyr Glu Pro Cys Thr 195 2。

23、00 205 gct aat tgc act ggt tac gct gcc aat gtt ttt gcc act gat tcc aat 672 Ala Asn Cys Thr Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala Thr Asp Ser Asn 210 215 220 序列表 CN 103194472 A 14 3/9 页 15 ggc cat ata cca gaa ggt ttt agt ttt aat aat tgg ttt ctt tta tcc 720 Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp 。

24、Phe Leu Leu Ser 225 230 235 240 aat gac tcc act ttg ttg cat ggt aaa gtt gtt tcc aac caa ccc ttg 768 Asn Asp Ser Thr Leu Leu His Gly Lys Val Val Ser Asn Gln Pro Leu 245 250 255 ttg gtc aat tgt ctt ttg gcc att cct aag att tat gga cta ggc caa 816 Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Leu 。

25、Gly Gln 260 265 270 ttt ttc tca ttc aat cac act atg gat ggc gtt tgt aat gga gct gct 864 Phe Phe Ser Phe Asn His Thr Met Asp Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala 275 280 285 gtt gat cgt gcc cca gag gct ctg agg ttt aat att aat gac acc tcc 912 Val Asp Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser 290 。

26、295 300 gtc att ctt gct gaa ggc tca att gtt ctt cat act gct tta gga aca 960 Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His Thr Ala Leu Gly Thr 305 310 315 320 aat ctt tct ttt gtt tgc agt aat tcc tca gat cct cat tta gcc atc 1008 Asn Leu Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asp Pro His Leu Ala Ile 325 330 335。

27、 ttt gcc ata cct ctg ggt gct act gaa gtt ccc tac tat tgc ttt ctt 1056 Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Glu Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu 340 345 350 aaa gtt gat act tac aac tcc act gtt tat aaa ttc ttg gct gtt tta 1104 Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu 355 360 365 cct cct a。

28、ct gtc agg gaa att gtc atc acc aag tat ggt gat gtt tat 1152 Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr 370 375 380 序列表 CN 103194472 A 15 4/9 页 16 gtc aat ggt ttt ggc tat ttg cat ctc ggt ttg ttg gat gct gtc aca 1200 Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly Leu Leu Asp Ala Val Th。

29、r 385 390 395 400 att aat ttc act ggt cat ggc act gac gat gac gtt tca ggt ttc tgg 1248 Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp 405 410 415 acc ata gca tct act aat ttt gtt gat gca ctc atc gag gtt caa gga 1296 Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly 420 。

30、425 430 act tcc att cag cgt att ctt tat tgt gat gat cct gtt agc caa ctc 1344 Thr Ser Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu 435 440 445 aag tgt tct cag gtt gct ttt gac ctt gac gat ggt ttt tac ccc atc 1392 Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile 450 455 460 tc。

31、t tct aga aac ctt ctg agt cat gaa cag cca att tct ttt gtt act 1440 Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr 465 470 475 480 ttg cca tca ttt aat ggt ggc ggt ggc tct ggc gga ggt ggg agc ggc 1488 Leu Pro Ser Phe Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 485 490 495 ggt ggt 。

32、ggc agc aaa gct tta gaa gaa gca aac agc aaa tta gct gct 1536 Gly Gly Gly Ser Lys Ala Leu Glu Glu Ala Asn Ser Lys Leu Ala Ala 500 505 510 ctt gaa aaa ctt aac aaa gag ctt gaa gaa agc aag aaa tta aca gaa 1584 Leu Glu Lys Leu Asn Lys Glu Leu Glu Glu Ser Lys Lys Leu Thr Glu 515 520 525 aaa gaa aaa gct ga。

33、g cta caa gca aaa ctt gaa gca gaa gca aaa gca 1632 Lys Glu Lys Ala Glu Leu Gln Ala Lys Leu Glu Ala Glu Ala Lys Ala 序列表 CN 103194472 A 16 5/9 页 17 530 535 540 ctc aaa gaa caa tta gcg aaa caa gct gaa gaa ctt gca aaa cta aga 1680 Leu Lys Glu Gln Leu Ala Lys Gln Ala Glu Glu Leu Ala Lys Leu Arg 545 550。

34、 555 560 gct gga aaa gca tca gac tca caa acc cct gat gca aaa cca gga aac 1728 Ala Gly Lys Ala Ser Asp Ser Gln Thr Pro Asp Ala Lys Pro Gly Asn 565 570 575 aaa gtt gtt cca ggt aaa ggt caa gca cca caa gca ggt aca aaa cct 1776 Lys Val Val Pro Gly Lys Gly Gln Ala Pro Gln Ala Gly Thr Lys Pro 580 585 590 a。

35、ac caa aac aaa gca cca atg aag gaa act aag aga cag tta cca tca 1824 Asn Gln Asn Lys Ala Pro Met Lys Glu Thr Lys Arg Gln Leu Pro Ser 595 600 605 aca ggt gaa aca gct aac cca ttc ttc aca gcg gca gcc ctt act gtt 1872 Thr Gly Glu Thr Ala Asn Pro Phe Phe Thr Ala Ala Ala Leu Thr Val 610 615 620 atg gca aca。

36、 gct gga gta gca gca gtt gta aaa cgc aaa gaa gaa aac 1920 Met Ala Thr Ala Gly Val Ala Ala Val Val Lys Arg Lys Glu Glu Asn 625 630 635 640 2 640 PRT Artifical sequence 2 Met Asp Val Thr Arg Cys Gln Ser Thr Thr Asn Phe Arg Arg Phe Phe 1 5 10 15 Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val Leu Gly G。

37、ly Tyr 序列表 CN 103194472 A 17 6/9 页 18 20 25 30 Leu Pro Ser Met Asn Ser Ser Ser Trp Tyr Cys Gly Thr Gly Ile Glu 35 40 45 Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Leu Ser Tyr Ile Asp Ser Gly 50 55 60 Gln Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys A。

38、la Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Ile 85 90 95 Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Asp Asn Lys Thr Leu Gly Pro 100 105 110 Thr Val Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala 115 120 125 Ile Pro Ala Tyr Met Arg Asp Gly Lys Asp Ile Val Val Gly Ile Thr 130 135 140 Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr 。

39、Val Phe Ala Asp Lys Ile Tyr His Phe 145 150 155 160 Tyr Leu Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr Arg Cys Tyr Asn Arg 165 170 175 序列表 CN 103194472 A 18 7/9 页 19 Arg Ser Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Thr Pro Thr Tyr Tyr Met Leu 180 185 190 Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Tyr Tyr Glu Pro Cys Thr。

40、 195 200 205 Ala Asn Cys Thr Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala Thr Asp Ser Asn 210 215 220 Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser 225 230 235 240 Asn Asp Ser Thr Leu Leu His Gly Lys Val Val Ser Asn Gln Pro Leu 245 250 255 Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile Tyr Gly Leu。

41、 Gly Gln 260 265 270 Phe Phe Ser Phe Asn His Thr Met Asp Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala 275 280 285 Val Asp Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser 290 295 300 Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His Thr Ala Leu Gly Thr 305 310 315 320 Asn Leu Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asp Pro。

42、 His Leu Ala Ile 325 330 335 序列表 CN 103194472 A 19 8/9 页 20 Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Glu Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu 340 345 350 Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu 355 360 365 Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr 370 375 380 Val Asn Gl。

43、y Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr 385 390 395 400 Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp 405 410 415 Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly 420 425 430 Thr Ser Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu 435 440 445 Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp Gly Phe Tyr Pro 。

展开阅读全文