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1、(10)申请公布号 CN 102716473 A (43)申请公布日 2012.10.10 CN 102716473 A *CN102716473A* (21)申请号 201210234670.0 (22)申请日 2012.07.06 A61K 39/00(2006.01) A61P 43/00(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 安徽农业大学 地址 230000 安徽省合肥市长江西路 130 号 (72)发明人 耿照玉 陈兴勇 何艳 姜润深 时丹 (74)专利代理机构 安徽汇朴律师事务所 34116 代理人 丁瑞瑞 。
2、(54) 发明名称 鹅产蛋的融合催乳素蛋白主动免疫调控方法 (57) 摘要 本发明公开了一种鹅产蛋的融合催乳素蛋白 主动免疫调控方法， 简略步骤包括 ： 提取、 酶切、 诱导、 纯化、 浓缩、 混合、 注射。本发明的优点在 于将重组表达的融合催乳素蛋白应用于鹅主动免 疫， 通过调控体内激素水平提高鹅的繁殖性能， 不 仅可解决常规选育难以剔除就巢性状的难题， 同 时， 也可避免人为注射性激素类物质所导致的药 物残留等问题。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1。
3、. 一种鹅产蛋的融合催乳素蛋白主动免疫调控方法， 其特征在于， 步骤包括 ： （1） 通过 RT-PCR， 从鹅下丘脑和垂体组织总 RNA 抽提物中扩增出全长 PRL 靶序列， 并插 入 EcoR 和 Hind 酶切位点 ； （2） 再插入 PMD19-T 载体， 与 pET32a 双酶切并连接， 转化 DH5 ； （3） 使用 IPTG 诱导 3 小时， 以分泌型表达 ； （4） 诱导表达后的菌珠经高压超声破碎， 离后上清溶液过 Ni- 亲和层析柱， 纯化产物 透析后冻干浓缩， 得到融合催乳素表达蛋白， 经蛋白定量后， 将浓缩蛋白分别稀释至 14mg/ ml ； （5） 将融合催乳素表达蛋白。
4、与佛氏完全佐剂以 1:0.81.2 的质量比混合 ； （6） 将混合物对鹅颈部皮下多点注射， 注射剂量为 1.52.5ml。 2. 根据权利要求 1 所述的鹅产蛋的融合催乳素蛋白主动免疫调控方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 中， 调节诱导后所表达蛋白产物浓度在 300350mg/L。 3. 根据权利要求 1 所述的鹅产蛋的融合催乳素蛋白主动免疫调控方法， 其特征在于， 所述步骤 （5） 中， 融合催乳素表达蛋白与佛氏完全佐剂以 1:1 的质量比混合。 4. 根据权利要求 1 所述的鹅产蛋的融合催乳素蛋白主动免疫调控方法， 其特征在于， 所述步骤 （6） 中， 注射剂量为 2ml。 5. 。
5、根据权利要求 1 所述的鹅产蛋的融合催乳素蛋白主动免疫调控方法， 其特征在于， 所述鹅选取皖西白鹅。 权 利 要 求 书 CN 102716473 A 2 1/3 页 3 鹅产蛋的融合催乳素蛋白主动免疫调控方法 技术领域 0001 本发明涉及一种鹅产蛋的融合催乳素蛋白主动免疫调控方法。 背景技术 0002 中国鹅多数为白羽中型鹅品种， 素以体型大、 早期生长发育快， 抗病力强， 耐粗饲、 耗料少， 肉质好等特点， 尤其产绒量高， 羽绒品质好而享誉国内外。 中国鹅为季节性产蛋， 但 就巢性极强， 导致其产蛋量低下。 采用产蛋量高的品种作为母本开展杂交， 从其综合生产性 能表现来看不能满足当地生产。
6、和市场对产品的需要， 而且还冲淡了地方鹅品种原有的优良 品质， 影响了养鹅的经济效益。因此消除就巢性是提高地方鹅种繁殖性能最有效的方式。 0003 研究表明， 家禽就巢性的发生是体内多种激素或因子共同作用的结果， 这种作 用发生在下丘脑 - 垂体 - 性腺轴的各个水平上。目前比较一致的观点是 ： 禽类的就巢 行为是由产蛋过程中卵巢产生的雌激素等作用于下丘脑， 促进下丘脑分泌血管活性肠肽 （vasoactive intestinal peptide， VIP） 等递质， 促进垂体分泌催乳素 （Prolactin, PRL） 所致。在此过程中， PRL 是促发就巢的最直接的激素。PRL 是动物垂体。
7、前叶分泌的一种激 素， 禽类的就巢性与血浆 PRL 水平变化有关。血浆 PRL 浓度上升到一定的程度可引发就巢。 就巢开始后， 就巢行为本身又促进 PRL 的分泌， 高 PRL 水平进而继续维持就巢行为 ； 产蛋期 火鸡注射 PRL 能使其迅速发生就巢行为 ； 人为终止火鸡的就巢行为将导致血浆 PRL 水平急 剧下降 ； 对矮脚鸡促 PRL 释放因子VIP 的被动免疫可降低就巢发生率。说明 PRL 在血 浆中的浓度变化是禽类就巢发生和维持的关键因素。因此， 可通过外源注射 PRL 的主动免 疫方法， 以提高地方鹅种就巢期 PRL 的抗体水平， 中断鹅的就巢行为， 达到提高产蛋性能的 目的。 发。
8、明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种鹅产蛋的融合催乳素蛋白主动免疫调控方 法， 降低鹅的就巢间隔， 并提高其产蛋量。 0005 本发明是通过以下技术方案来实现的。 0006 一种鹅产蛋的融合催乳素蛋白主动免疫调控方法， 步骤包括 ： 0007 （1） 通过 RT-PCR， 从鹅下丘脑和垂体组织总 RNA 抽提物中扩增出全长 PRL 靶序列， 并插入 EcoR 和 Hind 酶切位点 ； 0008 （2） 再插入 PMD19-T 载体， 与 pET32a 双酶切并连接， 转化 DH5 ； 0009 （3） 使用 IPTG 诱导 3 小时， 以分泌型表达 ； 0010 （4） 诱导表。
9、达后的菌珠经高压超声破碎， 离后上清溶液过 Ni- 亲和层析柱， 纯化 产物透析后冻干浓缩， 得到融合催乳素表达蛋白， 经蛋白定量后， 将浓缩蛋白分别稀释至 14mg/ml ； 0011 （5） 将融合催乳素表达蛋白与佛氏完全佐剂以 1:0.81.2 的质量比混合 ； 0012 （6） 将混合物对鹅颈部皮下多点注射， 注射剂量为 1.52.5ml。 说 明 书 CN 102716473 A 3 2/3 页 4 0013 进一步地， 上述步骤 （3） 中， 调节诱导后所表达蛋白产物浓度在 300350mg/L。 0014 进一步地， 上述步骤 （5） 中， 融合催乳素表达蛋白与佛氏完全佐剂以 1。
10、:1 的质量比 混合。 0015 进一步地， 上述步骤 （6） 中， 注射剂量为 2ml。 0016 进一步地， 上述鹅选取皖西白鹅。 0017 本发明的有益效果 ： 0018 将重组表达的融合催乳素蛋白应用于鹅主动免疫， 通过调控体内激素水平提高鹅 的繁殖性能， 不仅可解决常规选育难以剔除就巢性状的难题， 同时， 也可避免人为注射性激 素类物质所导致的药物残留等问题。 具体实施方式 0019 下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。 0020 一种鹅产蛋的融合催乳素蛋白主动免疫调控方法， 步骤包括 ： 0021 （1） 通过 RT-PCR， 从鹅下丘脑和垂体组织总 RNA 抽提物中扩增出全长。
11、 PRL 靶序列， 并插入 EcoR 和 Hind 酶切位点 ； 0022 （2） 再插入 PMD19-T 载体， 与 pET32a 双酶切并连接， 转化 DH5 ； 0023 （3）使用 IPTG 诱导 3 小时， 以分泌型表达， 调节诱导后所表达蛋白产物浓度在 300350mg/L ； 0024 （4） 诱导表达后的菌珠经高压超声破碎， 离后上清溶液过 Ni- 亲和层析柱， 纯化 产物透析后冻干浓缩， 得到融合催乳素表达蛋白， 经蛋白定量后， 将浓缩蛋白分别稀释至 14mg/ml ； 0025 （5） 将融合催乳素表达蛋白与佛氏完全佐剂以 1:0.81.2 的质量比混合， 优选 1:1 的。
12、质量比 ； 0026 （6） 将混合物对鹅颈部皮下多点注射， 注射剂量为 1.52.5ml， 优选 2ml。 0027 在本实施案例中， 鹅选取皖西白鹅作为实验对象。 0028 选择就巢期皖西白鹅 80 只， 分成 4 组， 组 1 注射 1mg/ml 融合催乳素蛋白， 组 2 注 射2mg/ml融合催乳素蛋白， 组3注射4mg/ml融合催乳素蛋白， 组4注射同体积的生理盐水。 10 天后融合催乳素蛋白与佛氏不完全佐剂混合完全， 继续以相应剂量注射各组鹅群。二次 加强免疫后统计各组鹅群产蛋和就巢情况， 其结果如下 ： 0029 a、 观察到组 1 就巢鹅占 18.78%， 产蛋鹅占 35.53。
13、% ； 组 2 就巢鹅点 23.5%， 产蛋鹅占 41.5% ； 组 3 就巢鹅占 20.56%， 36.11% ； 对照组 4 就巢鹅点 43.5%， 产蛋鹅占 25.5%（表 1） 。 0030 b、 二次加强免疫后 10 天内组 1 产蛋量为 70 枚， 组 2 产蛋量为 83 枚， 组 3 产蛋量 为 65 枚， 对照组 4 产蛋量为 51 枚 ； 二次加强免疫后 25 天内组 1 产蛋量为 115 枚， 组 2 产蛋 量为 126 枚， 组 3 产蛋量为 105 枚， 对照组 4 产蛋量为 63 枚 （表 1） 。 0031 表 1 皖西白鹅主动免疫产蛋情况比较 说 明 书 CN 1。
14、02716473 A 4 3/3 页 5 0032 0033 c、 2mg/ml 剂量组鹅群在二次加强免疫后， 血清中血管活性肠肽 （VIP） 含量从平均 90.57pg/ml 下降到 38.22pg/ml ； 血清催乳激素含量从平均 351.31ng/ml 下降至 76.84ng/ ml。 0034 采用上述方法进行主动免疫后， 以 2mg/ml 主动免疫剂量下， 可明显促进皖西白鹅 醒抱和产蛋。试验鹅群每组 20 只母鹅配 5 只公鹅， 二次免疫后皖西白鹅产蛋鹅占群体比例 达 41.5%， 明显高于对照组 （同法注射生理盐水） 25.5% ； 以 2mg/ml 剂量二次加强主动免疫后 10。
15、 天内的皖西白鹅产蛋量为 83 枚， 而对照组为 51 枚。二次加强免疫 10 天以后皖西白鹅产 蛋鹅仍占 8.6%， 而对照组仅为 2.53%。本发明重组表达的融合催乳素蛋白在经颈部皮下多 点注射的主动免疫后， 可以下调血清中催乳激素的含量， 起到调节皖西白鹅就巢和产蛋的 作用。 主动免疫用融合催乳素蛋白安全无毒， 无抗药性或药物残留等， 是一种理想的用于提 高皖西白鹅产蛋量的注射用生物试剂。 0035 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点， 其目的在于让熟悉此领域技术的 人士能够了解本发明内容并加以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围内。 说 明 书 CN 102716473 A 5 。