制备激活性Fc受体的选择性抗体的方法 本发明涉及制备包含ITAM基序(免疫受体基于酪氨酸的激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif))的激活性抗体Fc区域受体(FcR)的选择性抗体的方法，所述方法包括如下步骤：从杂交瘤、异种杂交瘤(hétérohybridome)或者任意动物、植物或人细胞系获得单克隆抗体，所述抗体的Fc区域的His310和His435位残基(Kabat编号)的每个残基用选自赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸的残基置换，然后选择与具有天然Fc区域的相同抗体相比与包含ITIM基序(免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif))的抑制性FcRs的结合降低至少30％、优选至少50％、70％、80％或至少90％的抗体。本发明还涉及通过本发明方法获得的抗体在制备特别用于治疗癌症和感染性疾病的药物中的应用。
背景技术
在市场上或在临床研发阶段存在大量用于治疗应用的细胞质或生物技术来源的抗体制品。研究了它们的性质以获得能够特异性结合其靶并有效募集免疫细胞的治疗工具。
最近这些年来，研究涉及改良抗体的效力，更特别涉及操作其恒定Fc区域。后者负责抗体的“效应物”性质，因为其允许效应免疫细胞和补体分子的迁移。这种能力由于在某些免疫细胞上存在糖蛋白即Fc受体或FcR而成为可能。这些受体能够结合抗体的恒定区，特别是一旦抗体通过其可变区结合靶抗原。与这些细胞接触，抗体引发不同的细胞机制如吞噬作用和ADCC(依赖抗体地细胞介导细胞毒性)。
然而，存在不同的人FcR类别。后者由8个均位于1号染色体的人基因编码。这些基因中某些基因显示等位基因多态性，产生不同的受体同种异型并具有不同的IgG结合性质(Hulett M.D.& Hogarth P.M.，Advances inImmunology，vol.57，pp.1-127，1994)导致不同的效应物性质(Carton et al(2002)Blood，vol.99，no.3，754-758)。鉴定的主要人FcR类别是FcγRI(CD64，具有A和B同种型)，FcγRII受体(CD32，具有A和B同种型)和FcγRIII受体(CD16，具有A和B同种型)。FcγRI和FcγRIII受体以及FcγRIIA受体是鉴定为“激活”的受体，因为其通过其序列或结合链的序列包含的ITAM基序的激活可以引发效应物功能如裂解靶细胞。相反，FcγRIIB受体是鉴定为“抑制”的受体，因为其通过其序列包含的ITIM基序抑制激活受体的转导途径并负调节效应物机制如通过激活FcR或其它表面分子如B-细胞抗原受体(BCR)或生长因子受体如c-kit诱导的ADCC的那些机制。
因此，FcR受体的多样性、特别是在相同细胞上表达的激活FcR和抑制性FcR的存在能够调节治疗抗体的效力，抑制性FcR的结合平衡了激活性FcR的结合。
因此，本发明的目的是提供效力即激活效应免疫细胞的能力根本不被或者仅略微被FcR受体的多样性、特别是被抑制性FcR调节的治疗抗体。
WO2005/040216的申请人描述了一级序列被修饰的抗体，特别用于IgG4置换治疗，或者用于防止移植物排斥，或者作为抗破伤风、抗白喉药物或针对某些疾病的药物或衍生毒素。
然而，本申请人令人惊奇地发现如此修饰的抗体保留了其诱导依赖于激活受体的效应物功能的能力，而其不再具有募集抑制性受体的能力。
本申请人因此意图开发可以提供治疗抗体的方法，所述抗体的效力即激活效应免疫细胞的能力根本不被或者仅略微被FcR受体的多样性、特别是被抑制性FcR调节。
发明详述
本发明首先涉及制备具有募集激活性FcR的能力但是与具有天然Fc区域的相同抗体相比其募集抑制性FcR的能力降低的抗体(即其Fc区域选择性结合激活性抗体Fc区域受体(FcR))的方法，包括如下步骤：
a)从杂交瘤、异种杂交瘤或者任意动物、植物或人细胞系获得单克隆抗体，
b)用选自赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸的残基置换所述抗体的Fc区域的His310和His435残基(Kabat编号)的每一个，
c)选择其Fc区域与抑制性FcR的结合与具有天然Fc区域的相同抗体相比降低至少30％、优选至少50％、70％、80％或至少90％的抗体。
为了本发明的目的，“抗体”是指任何抗体，无论其特异性及其同种型，只要其包含Fc区域或具有与Fc区域相同的功能和相同的特征的区域。因此，其可以是完整抗体或抗体片段，例如Fc抗体片段或在其一个末端包含Fc区域的融合分子。而且，本发明方法中使用的抗体可以是IgG，即任何IgG1、任何IgG2、任何IgG3(G3m(s)或G3m(st)同种异型)和任何IgG4、IgM、IgE、IgA或IgD，或者是其一或多种的混合物。而且，本发明方法中使用的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在其是单克隆抗体时，这些抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或动物来源的抗体。
而且，术语“抗体”也指抗体组合物，其由具有相同氨基酸序列、在相同生物学系统中表达的抗体分子组成，并包含至少一种赋形剂或药物可接受的载体，以便配制所述组合物以给药用于预防和/或治疗目的。
在步骤b)结束时，编码本发明的修饰的抗体的序列在适当的生物学系统中表达(阶段b’)。
为本发明的目的，“相同抗体”是指本发明方法的步骤b)的非修饰的抗体，并且在相同生物学生产系统中产生的本发明的修饰的抗体。“相同抗体”具有相同的天然一级序列(除了在本发明抗体中已被修饰的His310和His435残基)并以进行了与本发明方法获得的抗体相同的翻译后修饰，因为其在相同的生物学系统中产生。
为本发明的目的，步骤a)的抗体以单克隆抗体组合物的形式获得。每种单克隆抗体组合物由具有相同的氨基酸序列并因此具有相同的特异性、在相同生物学系统中表达的抗体分子组成。如果适当的，这些组合物可以含有至少一种赋形剂或药物可接受的载体，以便配制这些组合物以给药用于预防和/或治疗目的。
步骤a)的抗体包括天然Fc区域，即其在Fc区域的第310和435位(Kabat编号)具有组氨酸残基。优选地，这种抗体的Fc区域结合激活性受体并结合抑制性受体。为本发明目的，“抗体的天然Fc区域”是指在His310和His435残基未被任何化学或生物技术方法修饰的Fc区域。更特别地，“抗体的天然Fc区域”是指其His310和His435残基未通过化学或生物技术方法被选自赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸的残基置换的Fc区域。
例如，本发明所用的抗体可以选自抗Ep-CAM抗体、抗KIR3DL2抗体、抗EGFR抗体、抗VEGFR抗体、抗HER1抗体、抗HER2抗体、抗GD抗体、抗GD2抗体、抗GD3抗体、抗CD20抗体、抗CD-23抗体、抗CD-25抗体、抗CD-30抗体、抗CD33抗体、抗CD38抗体、抗CD44抗体、抗CD52抗体、抗CA125抗体及抗蛋白C抗体、抗HLA-DR抗体、抗病毒：HBV、HCV、HIV和RSV的抗体，及更特别地，选自表1的抗体：
表1
为本发明目的，“激活性抗体Fc区域受体(FcR)的选择性抗体”或“其Fc区域选择性结合激活性抗体Fc区域受体(FcR)的抗体”是指任何具有募集激活性FcR的能力但是与具有天然Fc区域的相同抗体相比，其与抑制性FcR结合的能力降低甚至是没有的抗体。
因此，本发明的抗体具有募集即通过其Fc区域结合激活性FcR受体的能力，但是与具有天然Fc区域的相同抗体相比，其结合即通过其Fc区域结合抑制性FoR受体的能力降低或者消除。
激活性FcR是指FcγRIIIA、FcγRIIIB、FcγRIIA、FcγRIA和FcγRIB、FcγR、FcγRI和在小鼠中描述的FcγRIV的人等价物。抑制性FcR是指FcγRIIB。
在步骤c)中，可以选择抗体即不同的抗体组合物，与具有天然Fc区域的相同抗体相比，其与FcR的结合降低。这种降低可以例如通过定量表达本发明抗体结合的FcR的细胞的数目或百分比并将这个数目或百分比与表达具有天然Fc区域的抗体结合的FcR的细胞的数目或百分比相比较来测量。
在本发明的优选实施方案中，在步骤c)中，根据与前述相似的本发明方法选择抗体即不同的抗体组合物，与具体天然Fc区域的相同抗体相比较，其与抑制性FcγR的结合被消除。因此，根据本发明方法制备的抗体具有结合激活性FcR但是不结合抑制性受体的Fc区域，而通过相同生物学系统产生的、具有未被本发明方法修饰的Fc区域的相同抗体通过其Fc区域结合激活性FcγR以及抑制性FcγR。
在本发明的优选实施方案中，用赖氨酸残基置换His310和His435残基。
在本发明的优选实施方案中，通过定点诱变或分子进化置换His310和His435残基。
在另一个实施方案中，通过化学处理手段例如用DEPC(焦碳酸二乙酯，其是组氨酸修饰剂)处理修饰His310和His435残基。
本申请人令人惊奇地发现位于抗体的CH2/CH3界面的两个特定组氨酸残基His310和His435通过选自赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸及优选赖氨酸的残基的突变对于如此修饰的抗体与抑制性FcR、特别是与FcγRIIB的结合具有显著影响，并对其与激活性FcR、特别是与FcγRIIIA的结合具有轻微作用。本申请人在体外结合测试中证实了本发明如此修饰的抗体不再或者几乎不再结合人抑制性FcγRIIB受体，而其与激活性FcγRIIIA和FcγRIIA受体的结合与非突变抗体相比仅非常少部分地被抑制(见下文)。这种突变的抗体是能够结合通过避免结合抑制性FcγRIIB而参与ADCC型细胞毒性的激活性受体(FcγRIIA和FcγRIIIA)的抗体。这种抗体因此可以诱导针对靶细胞(红细胞、肿瘤细胞、同种异体反应细胞、被微生物病原体感染的细胞)的ADCC，没有其，在FcγRIIB结合后ADCC被负调节。由于含有这种突变的抗体的免疫复合物只被树突细胞上表达的激活性FcγR捕获而不激活在这些细胞上也存在的抑制性FcγRIIB，所以这种抗体也可以最佳化树突细胞的抗原呈递。
激活性和抑制性受体这种“差异”性质是本发明抗体治疗性应用、特别是在癌症或感染性疾病应用中的必要特征。事实上，这种抗体能够通过激活FcγR而诱导ADCC机制，而后者不被抑制性FcγR负调节。而且，本申请人发现这种抗体只募集树突细胞上的激活性FcγR而不募集相同细胞表面上的抑制性FcγR。最近示出结合树突细胞表面上的抑制性FcγR对于这些细胞的成熟和其有效呈递抗原给效应T淋巴细胞而是这些树突细胞成为耐受原性的能力具有负作用。如果与抗原复合的这种抗体仅识别树突细胞表面上表达的激活性FcγR而不识别抑制性FcγR，则所获得的树突细胞抗原呈递将是最佳的以及获得最佳的特异性免疫应答的激活作用。
有利地，得自本发明方法的抗体的Fc区域结合激活性Fc受体而其不结合抑制性Fc受体。
有利地，本发明方法的抗体不募集抑制性Fc受体，特别是B淋巴细胞表达的抑制性Fc受体。
特别有利地，本发明方法的抗体不募集抑制性Fc受体但是结合B淋巴细胞表面的分子。
有利地，本发明的抗体不募集抑制性Fc受体但是结合治疗细胞表面特别是肿瘤B淋巴细胞表面的分子。
有利地，本发明的抗体不募集抑制性Fc受体但是结合B-CLL肿瘤淋巴细胞表面的分子。
有利地，本发明的抗体不募集抑制性Fc受体但是结合B-CLL肿瘤淋巴细胞表面的CD20分子。
特别有利地，本发明的抗体结合FcγRIII受体(A和B同种型)和/或FcγRIIA受体和/或FcγRI受体(A和B同种型)，而其不结合FcγRIIB受体(B1和B2同种型)。在特定的实施方案中，FcγRIIB受体是FcγRIIB1受体。
优选的，本发明方法中涉及的受体是人受体。
在本发明一个特定的实施方案中，抗体的Fc区域的受体位于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、NK细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞上。
在本发明一个特定的实施方案中，抗体的Fc区域的抑制性受体位于肿瘤细胞如恶性黑素瘤细胞、肿瘤B淋巴细胞如淋巴瘤、B-CLL(慢性B型淋巴细胞性白血病)细胞和骨髓瘤细胞。
有利地，本发明方法的抗体通过其可变区结合B-CLL肿瘤淋巴细胞表面上的CD20分子。本发明的这种抗体不募集抑制性Fc受体，特别是B-CLL肿瘤淋巴细胞表面上的受体。
有利地，本发明使用的抗体是单克隆抗体。这些单克隆抗体可以通过任何适当的生物学系统以单克隆抗体组合物的形式生产，所述组合物可以含有至少一种赋形剂或药物可接受的载体以便可以配制这些组合物以给药用于预防和/或治疗目的。“生物学系统”指为了表达所述抗体而使用一或多种载体转染的动物或植物细胞系、植物或非人转基因动物以及任何杂交瘤、异种杂交瘤。所述细胞可以是来自细胞系的细胞、使用包含编码所述抗体的基因的载体转染的细胞例如真核或原核细胞，特别是哺乳动物、昆虫、植物、细菌或酵母细胞。优选地，使用大鼠骨髓瘤细胞如YB2/0(ATCC No.CRL 1662)。
也可以使用CHO细胞，特别是CHO-K、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHOPro-5、CHO dhfr-或来自Wi1-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag14和P3X63Ag8.653、PERC6或BHK的其他细胞系。
本发明的另一个目的是其Fc区域的His310和His435残基(Kabat编号)的每个均被选自赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸的残基置换的抗体或本发明方法产生的抗体在制备用于抗感染或抗肿瘤药物中的应用，本发明所述抗体在只被抗原呈递细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、表皮朗格汉斯细胞、B淋巴细胞)的激活性FcγR结合的免疫复合物中。
优选地，为制备这种药物，使用用赖氨酸残基置换了Fc区域的His310和His435残基(Kabat编号)的每一个的抗体。
本发明另一个目的是其His310和His435残基(Kabat编号)的每个均被选自赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸的残基置换的抗体或本发明方法产生的抗体在制备用于治疗癌症、更特别是治疗淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、实体肿瘤如乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、眼瘤、甲状腺瘤、ORL球形瘤(tumeurs de lasphère ORL)、恶性黑素瘤、神经肿瘤如成胶质细胞瘤和成神经细胞瘤的药物中的应用。
优选地，为制备这种药物，使用用赖氨酸残基置换了Fc区域的His310和His435残基(Kabat编号)的每一个的抗体。
本发明另一个目的是其His310和His435残基(Kabat编号)的每个均被选自赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸的残基置换的抗体或本发明方法产生的抗体在制备用于治疗感染性疾病如HIV感染、HBV感染、HCV感染、RSV(呼吸道合胞病毒)感染、SARS病毒感染、轮状病毒感染、流感病毒感染、天花、细菌感染如科赫菌(bacille de Koch)、脑膜炎球菌、新型隐球菌(Criptococcus neoformans)、梭菌、导致中毒、炭疽、破伤风、结核和肠球菌感染的细菌导致的感染的药物中的应用。
优选地，为制备这种药物，使用用赖氨酸残基置换了Fc区域的His310和His435残基(Kabat编号)的每一个的抗体。
最后，本发明的最后一个方面涉及一种抗体组合物，其与抑制性FcR的结合与具有天然Fc区域的相同抗体相比降低至少30％，优选至少50％、70％、80％或至少90％或100％。
优选地，本发明的组合物是具有与具有天然Fc区域的相同抗体相比其结合抑制性受体的能力已被消除的抗体的Fc区域的组合物。
特别有利地，本发明的组合物是抗CD20抗体组合物。
本发明的其他方面和优点在以下的实施例中描述，其仅是说明目的而不是限制本发明的范围。
附图简述
图1：通过焦碳酸二乙酯修饰抗RhD mAb T125(YB2/0)的组氨酸对于抗体募集人FcγR的能力的作用。
图2：抗RhD mAb T125(YB2/0)的组氨酸310和435的突变为赖氨酸对于抗体结合人FcγR的能力的作用。
图3：抗RhD mAb T125(YB2/0)的组氨酸310和435的突变对于mAb诱导产生依赖于人FcγRIIIA的IL-2的能力的作用。
图4：比较T125(YB2/0)、双突变体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys和T125(CHO)与人FcγRIIIA和FcγRIIB的结合。
图5：与在YB2/0中产生的天然(野生型)抗体和在CHO中产生的天然(野生型)抗体相比，抗RhD单克隆抗体T125(YB2/0)的组氨酸310和435的突变对于单克隆抗体诱导依赖于人FcγRIIIA的能力的作用。
图6：在存在锌的T125(YB2/0)的Fc片段(A)和双突变体T125H310K-H435K(YB2/0)(B)晶体结构表面的图像。
实施例
实施例1：获得携带双突变His310-435Lys的抗体
转染细胞系YB2/0(大鼠骨髓瘤系ATCC No.CRL 1662)并产生EMAB5抗体(在WO 2005/040216中描述)，其是针对Rh(D)抗原的人IgG1(γ)，适应于在无血清培养基中培养。
EMAB5通过亲和层析在Sépharose-蛋白A上纯化。
通过HPCE-LIF，示出大多数聚糖结构是二分枝型寡糖，含有大约25％的岩藻糖。
制备Fc片段
纯化的EMAB5抗体对50mM Tris缓冲液pH8.0透析过夜。将调节至50mM CaCl2和10mM半胱氨酸的抗体溶液在37℃保温30分钟，然后加入酶/底物比为1/25的胰蛋白酶溶液(1mg/ml)。在37℃保温5小时后，加入氟磷酸二异丙酯(终浓度1mM)终止反应。将水解产物对50mM咪唑缓冲液pH7.8透析过夜。
为纯化Fc片段，将透析的水解产物以1ml凝胶/3.6mg抗体的比例与蛋白L-Affarose接触。在室温搅拌保温4小时后，将凝胶上样在柱中并用50mM的咪唑缓冲液pH7.8洗涤。组合含有Fc片段的流出液和洗涤缓冲液并通过在Vivaspin20上使用厂商描述的条件离心而浓缩。
定点诱变
含有编码抗Rh(D)抗体EMAB5的重链的氨基酸序列的cDNA的表达载体作为通过PCR进行双定点诱变(基于PCR的定点诱变)的基质。导入如下4个核苷酸取代：
-C1229A和C1301G以改变His338残基为Lys(Kabat编号的310位)，即CAC→AAG；
-C1674A和C1676G以突变His463残基为Lys(Kabat编号的435位)，即CAC→AAG。
对于核苷酸序列，突变抗体的重链具有序列SEQ ID NO：1，肽序列为SEQ ID NO：2(序列SEQ ID NO：2中第338和463位的突变的氨基酸分别为氨基酸Lys310和Lys435)。编号考虑了前导序列(338和463)或没有(在后一种情况中，其是所谓的Kabat编号，其使用：310和435)。
YB2/0细胞通过电穿孔共转染了突变载体EMAB5-H-K338-K463-1和编码EMAB5抗体轻链的载体EMAB5-dhfr-K-SpeI，在补加了5％透析的FCS、0.5％ G418和25nM甲氨蝶呤(MTX)的RPMI培养基中培养。分泌最高水平人IgG的克隆在24孔板中在没有MTX的培养基中培养。培养7天后收集上清用于进行下述测试。
实施例2：通过焦碳酸二乙酯(DEPC)修饰抗RhD单克隆IgG1的CH2/CH3界面处的组氨酸对于人IgG1/FcγR相互作用的影响
为研究修饰人IgG1的组氨酸对于人IgG1/FcγR相互作用的影响，抗RhD单克隆抗体T125(YB2/0)用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理。DEPC通过在组氨酸环的氮原子和DEPC分子的碳原子之间产生共价键而修饰组氨酸残基。用DEPC处理或未被处理的单克隆抗体在蛋白A-Sepharose柱上分级分离。组氨酸435对于IgG结合蛋白A是重要的，用DEPC处理的单克隆抗体和未保留在蛋白A上的级分相应于至少His435残基被修饰的IgG1。
比较了用DEPC处理或未被处理和未保留在蛋白A上的单克隆抗体T125(YB2/0)其与不同类型人FcRγ的结合(图1)。通过间接免疫荧光分析了用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理或未被处理的抗RhD单克隆抗体T125(YB2/0)与人FcγRIIIA(A)、FcγRIIA(B)、FcγRIIB1(C)和FcγRI
(D)(hFcγR)的结合。指示细胞Jurkat-huFcγRIIIA(A)、K562(B)、IIA.1.6-huFcγRIIB1(C)和Tf2-13(D)与用DEPC处理或未被处理的不同浓度的T125(YB2/0)的保温。通过与FITC偶联的小鼠抗人IgG(H+L)的F(ab’)2检测单克隆抗体的结合。在低浓度(0.05μg/ml)，T125(YB2/0)结合FcγRIIIA，在0.5μg/ml，显示了非常显著的结合(95％阳性细胞)。当这种单克隆抗体用DEPC处理时，其在高浓度(1和5μg/ml之间)的结合被降低(大约在1μg/ml降低90％)，在低浓度(在0.025μg/ml和0.05μg/ml之间)为少量(图1A)。
用DEPC处理也诱导T125(YB2/0)与FcγRIIA的结合(分别在50μg/ml和100μg/ml)降低76％和64％(图1B)。相似地，用DEPC处理的T125(YB2/0)与FcγRIIB1的结合也降低：在50μg/ml，用DEPC处理的T125(YB2/0)的结合是少量的，而相同浓度的未被处理的T125(YB2/0)大约40％的细胞是阳性的(图1C)。另一方面，通过DEPC修饰mAb对于其与FcγRI的结合具有轻微作用。用DEPC处理在0.5μg/ml和1μg/ml时诱导T125(YB2/0)与FcγRI的结合降低15％。(图1D)
总之，通过DEPC阻断T125(YB2/0)中存在的组氨酸降低了其与FcγRIIIA(图1A)、FcγRIIA(图1B)、FcγRIIB(图1C)的结合，并且在较低程度上降低了与人FcγRI的结合(图1D)。
实施例3：抗RhD单克隆IgG1的His435和His310残基的突变对于人IgG1/FcγR相互作用的影响
前述结果表明单克隆IgG1的His残基的修饰影响了其和人FcγR的相互作用。然而，用DEPC处理不能确定哪个His被修饰。
结构研究示出位于IgG1的铰链区任一侧的His435和His310残基在IgG1/FcγR相互作用中是重要的。我们因此研究了T125(YB2/0)的His435和His310残基的突变为赖氨酸对于单克隆抗体与人FcRγ的结合的作用(图2)。通过间接免疫荧光分析了单克隆抗体T125(YB2/0)或双突变体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys与人FcγRIIIA(A)、FcγRIIA(B)、FcγRIIB1(C)和FcγRI(D)(hFcγR)的结合。指示细胞Jurkat-huFcγRIIIA(A)、K562(B)、IIA.1.6-huFcγRIIB1(C)和Tf2-13(D)与不同浓度的T125(YB2/0)或双突变体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys保温。通过与FITC偶联的小鼠抗人IgG(H+L)的F(ab’)2片段检测mAb的结合。双突变体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys与Jurkat-CD16细胞表达的人FcγRIIIA的结合与非突变单克隆抗体的结合相比略微降低(图2A)。当用表达人FcγRIIA的指示细胞(K562)进行实验时，这种结合也是降低的(图2B)。相反，T125(YB2/0)的His435和His310残基的突变完全消除了这种抗体与人FcγRIIB1的结合(图2C)。T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys与人FcγRI的结合不被影响(图2D)。
实施例4：抗RhD单克隆IgG1的His435和His310残基的突变对于其效应物性质的影响
我们分析了T125(YB2/0)的His435和His310残基的突变对于这种抗体的激活效应功能之一的影响。
通过ELISA比较了双突变体和非突变体单克隆抗体诱导由Jurkat-huFcγRIIIA FcγRIIIA+细胞产生IL-2的能力(图3)。为标准化来自3个不同实验的结果，不同剂量的单克隆抗体诱导产生的IL-2表示为10μg/ml的T125(YB2/0)诱导的百分比。这个剂量的T125(YB2/0)相应于在所有实验中检测到的IL-2的最大生成。由1、5和10μg/ml的突变的T125(YB2/0)诱导的IL-2生成与相同剂量的非突变单克隆抗体诱导的IL-2释放相比分别降低了61％、53％和54％(图3)。Jurkat-huFcγRIIIA(FcγRIIIA+)细胞在37℃用不同浓度的T125(YB2/0)或双突变体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys在存在兔抗人IgG(H+L)的F(ab’)2片段下刺激15小时以使抗RhD人单克隆抗体聚集。然后通过ELISA检测由Jurkat-huFcγRIIIA细胞诱导的IL-2生成。在存在不同浓度的两种mAb下诱导的IL-2生成表示为10μg/ml的T125(YB2/0)诱导的百分比。
这些结果表明在单克隆IgG1的CH2/CH3界面上的His435和His310残基的修饰部分降低了这种mAb与人FcγRIIIA的结合以及其诱导生成依赖于这些激活性FcγR的细胞因子的能力。不过，双突变单克隆抗体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys也能够募集激活性FcγRIIIA及诱导依赖于这些受体的激活性效应物功能。
实施例5：T125(YB2/0)、双突变体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys和T125(CHO)的人FcγR的结合谱的比较
前述实验示出双突变单克隆抗体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys是能够结合激活性受体(FcγRIIA和FcγRIIIA)的抗体，但是其结合抑制性FcγRIIB的能力被消除。为更好地鉴定这种单克隆抗体的性质，我们比较了其与人FcγRIIIA和FcγRIIB的结合与已被精确限定结果特征以及和不同类型的FcγR的结合谱的T125(CHO)的结合(图4)。(A)和(C)，通过间接免疫荧光分析了mAb T125(YB2/0)、T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys和T125(CHO)与人FcγRIIIA(A)和FcγRIIB1(C)的结合。指示细胞Jurkat-huFcγRIIIA(A)或IIA.1.6-huFcγRIIB1(C)与不同浓度的T125(YB2/0)、T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys和T125(CHO)保温。通过与FITC偶联的小鼠抗人IgG(H+L)的F(ab’)2片段检测单克隆抗体的结合。
(B)和(D)，比较了单克隆抗体T125(YB2/0)、T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys和T125(CHO)抑制3G8-PE抗体(抗人FcγRIIIA/IIIB)(B)或AT10-FITC(抗人FcγRIIA/IIB)(D)的结合的能力。指示细胞Jurkat-huFcγRIIIA(B)或IIA.1.6-huFcγRIIB1(D)与不同浓度的T125(YB2/0)或T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys或T125(CHO)保温，然后分别用40ng/ml的3G8-PE(B)或40ng/ml的AT10-FITC(D)保温。计算作为竞争性单克隆抗体浓度的函数的3G8-PE或AT10-FITC结合的抑制百分比：T125(CHO)，其比T125(YB2/0)更加岩藻糖基化，能够诱导依赖于FcγRIIB1的抑制功能。另一方面，其仅微弱结合人FcγRIIIA并且是依赖于FcγRIIIA的激活功能的差的诱导物。
间接免疫荧光实验示出尽管双突变单克隆抗体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys与FcRγIIIAs的结合相对于T125(YB2/0)略微降低，其仍保留比T125(YB2/0)大得多的结合(图4A)。我们通过使用40ng/ml的阻断人FcγRIIIA和FcγRIIIB结合位点的3G8-PE进行的竞争实验证实了在T125(YB2/0)的双突变体和T125(CHO)之间与人FcγRIIIA结合中的这种差异(图4B)。为诱导50％抑制单克隆抗体3G8-PE与Jurkat-huFcγRIIIA细胞表面上表达的FcγRIIIA的结合，T125(YB2/0)需要大约15μg/ml的浓度，T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys需要40μg/ml的浓度。相反，T125(CHO)的剂量需要高于100μg/ml(大约130μg/ml)才能50％抑制3G8-PE的结合。间接免疫荧光实验示出双突变体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys与IIA.1.6-huFcγRIIB1(FcγRIIB1+)指示细胞的结合被完全消除，而T125(CHO)的结合则保留了，尽管这后一种mAb结合FcγRIIB1的能力相对于T125(YB2/0)降低(图4C)。相似地，无论测试浓度为何，双突变体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys不能抑制40ng/ml的AT10-FITC抗体(抗人FcγRIIA/FcγRIIB mAb)与IIA.1.6-huFcγRIIB1细胞的结合，而T125(CHO)能够诱导抑制AT10-FITC抗体与FcγRIIB1的结合，尽管后者比T125(YB2/0)诱导的要少(图4D)。
因此，这些免疫荧光实验示出根据与FcγR的相互作用，双突变体T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys具有与T125(CHO)不同的性质：T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys有效募集激活性FcγRIIIA。另一方面，这种单克隆抗体不能结合FcγRIIB。
实施例6：用T125抗体(YB2/0)、双突变体T125抗体(YB2/0)His310Lys/His435Lys和T125抗体(CHO)获得的ADCC的比较
对于不同的抗D抗体，比较了诱导在存在单核的细胞(效应细胞来源)和Tégéline(2500μg/ml)时由不同抗Ds诱导的恒河猴阳性红细胞的ADCC裂解的能力。AD1抗体是不引发ADCC应答的抗D抗体，因此作为阴性对照。T125抗体在两种不同的细胞类型中表达：YB2/0(产生T125抗体(YB2/0))和CHO(产生T125抗体(CHO))。而且，突变T125抗体以用赖氨酸残基置换其His310和His435残基(T125(YB2/0)His310Lys/His435Lys)。
结果示于图5：突变的组氨酸抗体(H310K H435K)诱导恒河猴阳性红细胞的ADCC，略微低于用非突变的T125抗体(YB2/0)获得的，但是远高于用AD1获得的。应注意在这些实验条件下，CHO中表达的抗D对照抗体如果诱导也诱导非常少的ADCC(结果未示出)。
实施例7：突变组氨酸310和435为赖氨酸的结果影响
比较T125(YB2/0)的Fc片段和T125H310K-H435K(YB2/0)的晶体结构(参见实施例6)示出组氨酸310和435突变为赖氨酸没有修饰Fc片段的大体构象。
在WO2005/040216(在此并入本文参考)中，申请人示出非突变的抗体(因此携带His310和His435残基)具有结合锌阳离子(Zn2+)的能力；然而，这些残基的侧链位置以及其尺度与T125(YB2/0)的Fc片段的组氨酸残基的重叠。这个事实在这种类型的抗体在人治疗中应用是重要的，因为这提示T125抗体H310K-H435K(YB2/0)与FcnR的结合，因此其分解代谢不被修饰。
相反，组氨酸310和435残基突变为赖氨酸对于Fc片段的CH2结构域的方向有影响。事实上，比较T125(YB2/0)的Fc片段(存在锌)和双突变体T125 H310K-H435K(YB2/0)的晶体结构示出后者具有更紧密的构象，其中两个CH2结构域与T125(YB2/0)的Fc片段的CH2结构域相比互相更接近。这种构象上的差异可能是H310K和H435K突变影响抗体与人FcγR的结合(参见实施例3、4和5)的来源。