鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用.pdf

本发明涉及免疫学领域，具体地说是一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用。鳗利斯顿氏菌lahcp基因核酸碱基序列如序列表SEQ IDNO：1所示，其编码的蛋白即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO：2所示。所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白具有激发鱼体对鳗利斯顿氏菌病的免疫力。本发明表达蛋白可激发鱼体产生特异性抗体，抵抗鳗利斯顿氏菌的感染，可用于水产鱼类养殖中鳗利斯顿氏菌引起疾病的预防中。该表达蛋白制备方法简单，可应用于大规模工业化生产。

权利要求书
1.  一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白，其特征在于：鳗利斯顿氏菌lahcp基因核酸碱基序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO：2所示。

2.  一种按权利要求1所述的鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白的应用，其特征在于：所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白具有激发鱼体对鳗利斯顿氏菌病的免疫力。

3.  按权利要求2所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白的应用，其特征在于：将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以20μg蛋白/g鱼体重～0.2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于鱼体。

说明书鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用。
背景技术
鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)是一种革兰氏阴性杆状细菌，是淡水和海水养殖鱼类和野生鱼类的病原菌，引起鱼类的出血性败血症，造成世界范围鱼类养殖的重大经济损失。在我国，鳗利斯顿氏菌不仅是养殖对虾红腿病症的病原，还是鲈鱼、牙鲆、大菱鲆、石斑鱼和欧洲鳗鲡等鱼类的皮肤肌肉溃烂、出血症病原，对我国养殖鱼类的危害巨大。
VI型分泌系统(Type VI Secret System，T6SS)是最近确定的一种新的细菌分泌系统，它参与细菌的致病作用，并已经在多个植物或动物的病原菌中发现。目前的研究表明，革兰氏阴性细菌的T6SS基因簇结构比较保守，一般由12至25个基因组成，其中包括一个基质蛋白基因hcp。hcp基因在不同细菌中具有较高的保守性，它编码的蛋白在T6SS的分泌过程中具有重要作用，研究表明它可能作为T6SS的基质蛋白参与组装分泌通道，hcp基因的缺失可以阻断T6SS的分泌。但目前还没有关于HCP蛋白具有免疫保护效果的文献报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白：鳗利斯顿氏菌1ahcp基因核酸碱基序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO：2所示。
鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白的应用：所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白具有激发鱼体对鳗利斯顿氏菌病的免疫力。
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以20μg蛋白/g鱼体重～0.2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于鱼体。
本发明所具有优点如下：
1.hcp基因在细菌中的保守性较高，本发明以lahcp基因的表达蛋白制备的亚单位疫苗可以拓宽疫苗保护谱、增加疫苗的免疫协同作用，诱导水产养殖动物的非特异性和特异性免疫应答，并提供保护效应。
2.本发明表达蛋白可激发鱼体产生特异性抗体，抵抗鳗利斯顿氏菌的感染，可用于水产鱼类养殖中鳗利斯顿氏菌引起疾病的预防中。
3.本发明的抗原蛋白制备方法简单，可应用于大规模工业化生产。
附图说明
图1为本发明鳗利斯顿氏菌lahcp基因核酸电泳图。
图2为本发明鳗利斯顿氏菌LAHCP表达纯化蛋白SDS-PAGE电泳图。
图3为本发明鳗利斯顿氏菌LAHCP表达纯化蛋白质谱分析结果。
图4为使用本发明疫苗免疫牙鲆后鳗利斯顿氏菌感染牙鲆死亡情况图。
图5为使用本发明疫苗免疫蓝鳗龙后鳗利斯顿氏菌感染蓝鳗龙死亡情况图。为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆血清抗鳗利斯顿氏菌抗体效价变化情况图。
图6为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆血清抗LAHCP抗体效价变化情况图。
具体实施方式
下面根据附图说明和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
根据鳗利斯顿氏菌T6SS基质蛋白基因lahcp的核酸序列，以及载体pETDuet(购自Novagen公司)的酶切图谱设计扩增引物：
lahcp-for-EcoRI：5’-GGCGAATTCATGCCAACTGCATG-3’(下划线碱基序列为限制性内切酶EcoRI的识别位点)；
lahcp-rev-SalI：5’-ATCGGTCGACTTACGCTTCAACAG3’(下划线碱基序列为限制性内切酶SalI的识别位点)。
以鳗利斯顿氏菌基因组DNA为模板进行PCR扩增反应(PCR仪购自Takara公司，型号TP600)，反应体系与反应参数如下：(试剂尽量用中文表示)
PCR反应体系(25μL)
10×PCR buffer                        2.5μL
dNTP混合液                            0.5μL(各0.2mM)
MgCl2                                 2.0μL(1.5mM)
引物lahcp-for-EcoRI                   0.5μL(0.5μM)
引物lahcp-rev-SalI                    0.5μL(0.5μM)
鳗利斯顿氏菌基因组DNA                 1.0μL(30ng)
Taq酶                                 0.25μL(5U/μL)
灭菌双蒸水                            17.75μL
反应体系                              25.0μL
PCR反应参数
95℃                                  3min

72℃                        15min
end
反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得一个519bp的DNA片段(参见图1)。使用PCR产物纯化试剂盒(Invitrogen公司)回收目的片断，将目的片断与pGMT(tiangen公司)载体连接，连接反应体系如下：
连接反应体系(10μL)
10×ligation buffer     1μL
聚乙二醇                1μL
pGM-T                   1μL
PCR产物                 3μL
T4连接酶                1μL
灭菌双蒸水              3μL
反应体系                10μL
反应混合物于16℃恒温过夜。取全部连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用抗生素(氨苄青霉素)与α互补实验筛选目标重组质粒阳性大肠杆菌单菌落，提质粒，将此重组质粒命名为pGMT-lahcp，对其进行测序(上海博亚公司)，测序结果表明获得了序列正确的鳗利斯顿氏菌lahcp基因片断(参见序列表SEQ ID NO：1)。
SEQ ID NO：1
ATGCCAACTGCATGTTATATCTCTATCGAAGGCGAAACTCAGGGCCTGATCACTGCTGGTGCTCTGTCTACTGATTCACTCGGTGATGCGTTCGTTGAAGGTCATGAAGACCAAATGTTGGTTCAACAATTTGACCACGTTGTAACTGTACCGACTGATCCACAATCAGGTCAGCCTTCTGGTCAACGTGTTCACAAACCATTTAAATTCACCGTAGCGCTAAACAAAGCGGTTCCTCTTCTTTATAACGCACTGGCGTCTGGCGAGAAGATGAAATCGGTTGAGCTAAAATGGTACCGCACTTCTATCGAAGGTAAGCAAGAGAACTTCTTCACTACTACACTCGAAAGCGCGTCTATCGTGGACATTCACTGTGAAATGCCACACTGCCAAGATCCAGCGAACGGCGACTTCACACAAAACGTTACGGTTTCTATGTCTTACCGTAAAATCCTGTGGGATCACGTGAATGCGGGTACTTCAGGCTCTGACGACTGGCGCAAGCCTGTTGAAGCGTAA
a)序列特征：
·长度：519bp
·类型：碱基序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：双链DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：鳗利斯顿氏菌
将pGMT-lahcp用限制性内切酶EcoR和SalI(Takara公司)进行双酶切，酶切体系如下：
H-buffer            1μL
质粒(Plasmid)       1μL
EcoRI&SalI          各0.5μL
超纯水(DDw)         7μL
反应总体系          10μL
将酶切产物用T4DNA连接酶(Takara公司)连接入载体pETDuet的EcoRI和SalI酶切位点之间，连接反应体系如下：
连接反应体系(10μL)
10×ligation buffer        1μL
PEG4000                    1μL
pETDuet                    1.5μL
酶切产物                   4.5μL
T4连接酶                   1μL
灭菌双蒸水                 1μL
反应体系                   10μL
反应混合物于16℃恒温过夜。取全部连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用抗生素(氨苄青霉素)筛选目标重组质粒阳性大肠杆菌单菌落，提质粒，将此重组质粒命名为pETDuet-lahcp。
将构建好的质粒pETDuet-lahcp，转化入大肠杆菌表达工程菌BL21(DE3)中，采用抗生素(氨苄青霉素)筛选阳性大肠杆菌菌落，接种于5ml LB液体培养基中，在37℃下培养12小时，然后按照1∶100的比例将菌液接种于含0.1mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养3-4小时至OD600达0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，在相同条件下继续培养4小时。培养结束后，离心收集菌体，用PBS洗涤两遍，完全除去培养液，最后重悬于PBS；用超声波裂解细菌，超声5s间隔10s，200W，破菌时间为90min-120min，直至菌液澄清。
因重组蛋白N端存在6个连续的组氨酸His序列，用镍鳌合的琼脂糖柱Ni-Sepharose(购自Qiagen公司)进行亲合纯化，纯化步骤依照产品说明书进行。首先将初步纯化的蛋白溶液加到平衡好的Ni-Sepharose上，以清洗液(50mM磷酸缓冲液，200mM氯化钠，pH7.8)洗3～5个柱体积；然后以含有梯度浓度咪唑的洗涤液(50mM磷酸缓冲液，200mM氯化钠，10-400mM咪唑，pH7.8)各洗3个柱体积，释放重组蛋白。进行SDS-PAGE电泳检测纯化结果(参见图2)。通过蛋白质质谱分析，得纯化的表达蛋白LAHCP，即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白(参见图3和序列表2)。
SEQ ID NO：2
MPTACYISIEGETQGLITAGALSTDSLGDAFVEGHEDQMLVQQFDHVVTVPTDPQSGQPSGQRVHKPFKFTVALNKAVPLLYNALASGEKMKSVELKWYRTSIEGKQENFFTTTLESASIVDIHCEMPHCQDPANGDFTQNVTVSMSYRKILWDHVNAGTSGSDDWRKPVEA
(a)序列特征：
·长度：172氨基酸残基
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：双链DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：鳗利斯顿氏菌
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂(Sigma)，按体积1∶1比例将其混合，而后以2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于牙鲆体内，免疫后30天仍按上述的剂量进行加强免疫，同时将上述完全弗氏佐剂采用不完全弗氏佐剂(Sigma)替换，仍按按体积1∶1比例将其与鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白混合，按：2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于牙鲆体内。
实施例2
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于大菱鲆体内。
实施例3
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以20μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于蓝鳗龙体内。
实施例4
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与不完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于蓝鳗龙体内。
实施例5
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与不完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以0.2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于蓝鳗龙体内。
应用例1
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于牙鲆体内，免疫后30天进行加强免疫。再将上述蛋白与不完全弗氏佐剂按体积1∶1比例将其混合，而后以蛋白注射用量：2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于牙鲆体内。
第二次免疫后第30天取免疫牙鲆，以鳗利斯顿氏菌进行注射攻毒实验，鳗利斯顿氏菌的感染浓度为1.28×107cells/mL，每尾注射0.1mL，持续观察8天，记录各组死亡情况(参见图4)。
应用例2
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与不完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以0.2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于蓝鳗龙体内。免疫后第30天取免疫鱼，以鳗利斯顿氏菌进行注射攻毒实验，鳗利斯顿氏菌的感染浓度为2.13×104cells/mL，每尾注射0.1mL，持续观察8天，记录各组死亡情况(参见图5)。
应用例3
将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂，按1∶1比例将其混合，而后以2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于大菱鲆体内，分别于免疫后的第7、14、21、28天，采集免疫大菱鲆的血液制备血清，通过ELISA方法检测抗体效价(参见图6)。
序列表.txt
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
<120>鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用
<130>
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>519
<212>DNA
<213>鳗利斯顿氏菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(519)
<223>
<400>1
atg cca act gca tgt tat atc tct atc gaa ggc gaa act cag ggc ctg       48
Met Pro Thr Ala Cys Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Glu Thr Gln Gly Leu
1               5                   10                  15
atc act gct ggt gct ctg tct act gat tca ctc ggt gat gcg ttc gtt       96
Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val
            20                  25                  30
gaa ggt cat gaa gac caa atg ttg gtt caa caa ttt gac cac gtt gta       144
Glu Gly His Glu Asp Gln Met Leu Val Gln Gln Phe Asp His Val Val
        35                  40                  45
act gta ccg act gat cca caa tca ggt cag cct tct ggt caa cgt gtt       192
Thr Val Pro Thr Asp Pro Gln Ser Gly Gln Pro Ser Gly Gln Arg Val
    50                  55                  60
cac aaa cca ttt aaa ttc acc gta gcg cta aac aaa gcg gtt cct ctt       240
His Lys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro Leu
65                  70                  75                  80
ctt tat aac gca ctg gcg tct ggc gag aag atg aaa tcg gtt gag cta       288
Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu
                85                  90                  95
aaa tgg tac cgc act tct atc gaa ggt aag caa gag aac ttc ttc act       336
Lys Trp Tyr Arg Thr Ser Ile Glu Gly Lys Gln Glu Asn Phe Phe Thr
            100                 105                 110
act aca ctc gaa agc gcg tct atc gtg gac att cac tgt gaa atg cca       384
Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser Ile Val Asp Ile His Cys Glu Met Pro
        115                 120                 125
cac tgc caa gat cca gcg aac ggc gac ttc aca caa aac gtt acg gtt       432
His Cys Gln Asp Pro Ala Asn Gly Asp Phe Thr Gln Asn Val Thr Val
    130                 135                 140
tct atg tct tac cgt aaa atc ctg tgg gat cac gtg aat gcg ggt act       480
Ser Met Ser Tyr Arg Lys Ile Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr
145                 150                 155                 160
tca ggc tct gac gac tgg cgc aag cct gtt gaa gcg taa                   519
Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val Glu Ala
                165                 170
<210>2
<211>172
<212>PRT
<213>鳗利斯顿氏菌
<400>2
Met Pro Thr Ala Cys Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Glu Thr Gln Gly Leu
1               5                   10                  15
Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val
            20                  25                  30
Glu Gly His Glu Asp Gln Met Leu Val Gln Gln Phe Asp His Val Val
        35                  40                  45
Thr Val Pro Thr Asp Pro Gln Ser Gly Gln Pro Ser Gly Gln Arg Val
    50                  55                  60
His Lys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro Leu
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Trp Tyr Arg Thr Ser Ile Glu Gly Lys Gln Glu Asn Phe Phe Thr
            100                 105                 110
Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser Ile Val Asp Ile His Cys Glu Met Pro
        115                 120                 125
His Cys Gln Asp Pro Ala Asn Gly Asp Phe Thr Gln Asn Val Thr Val
    130                 135                 140
Ser Met Ser Tyr Arg Lys Ile Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val Glu Ala
                165                  170
<210>3
<211>172
<212>PRT
<213>鳗利斯顿氏菌
<220>
<221>PRT
<222>(1)..(172)
<223>
<400>3
Met Pro Thr Ala Cys Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Glu Thr Gln Gly Leu
1               5                   10                  15
Ile Thr Ala Gly Ala Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val
            20                  25                  30
Glu Gly His Glu Asp Gln Met Leu Val Gln Gln Phe Asp His Val Val
        35                  40                  45
Thr Val Pro Thr Asp Pro Gln Ser Gly Gln Pro Ser Gly Gln Arg Val
    50                  55                  60
His Lys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro Leu
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Trp Tyr Arg Thr Ser Ile Glu Gly Lys Gln Glu Asn Phe Phe Thr
            100                 105                 110
Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser Ile Val Asp Ile His Cys Glu Met Pro
        115                 120                 125
His Cys Gln Asp Pro Ala Asn Gly Asp Phe Thr Gln Asn Val Thr Val
    130                 135                 140
Ser Met Ser Tyr Arg Lys Ile Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val Glu Ala
                165                 170