表征组织的方法.pdf

一种用于确定组织的结构和功能特征和/或病理状态的定量方法，包括如下步骤：基于已经暴露于生物标志物的组织或其部分的光学性质生成一段时间中动态光学曲线的数据和基于所述数据确定动态光学参数的值。将所述动态光学参数的值与已知和该组织的结构或功能特征和/或病理状态相关的动态光学参数的参考值进行比较；以及基于所述比较，确定组织或其部分的结构或功能特征和/或病理状态。一种计算机可读介质容纳用于实施该方法的计算机程序指令。可以通过测量来自已知的代表性组织样品的动态光学性质来计算参考值。优选的组织样品包括上皮和宫颈组织样品。优选的方法包括对瘤变和/或HPV感染进行诊断和/或分级和/或计算组织样品中细胞的核质比。

权利要求书
1.  一种用于确定组织的结构和功能特征和/或病理状态的定量方法，其包括：
基于已经暴露于生物标志物的组织或其部分的光学性质，生成在一段时间中动态光学曲线的数据；
基于所述数据，确定至少一个动态光学参数的值；
将所述至少一个动态光学参数的所述确定值与所述至少一个动态光学参数的至少一个参考值进行比较，其中已知所述至少一个参考值和所述组织的结构或功能特征和/或所述病理状态相关；以及
基于所述比较，确定所述组织或其部分的结构或功能特征和/或病理状态，其特征在于，所述组织的所述病理状态选自瘤变和HPV感染和/或所述组织的所述结构或功能特征选自核质比、细胞外酸度、被动扩散常数、复层上皮的细胞层数、调节细胞内pH方面的细胞功能障碍、脉管系统紊乱的存在、淋巴引流不良、细胞外pH、细胞外和细胞内pH梯度、跨细胞膜的渗透压差和细胞分化。

2.  权利要求1的方法，其中所述至少一个动态光学参数选自“积分”、“最大值”、“到最大值的时间”、“到最大值的面积”、“斜度A”和“斜度B”。

3.  根据任一项前述权利要求的方法，其中所述组织是宫颈组织和/或包含上皮细胞。

4.  权利要求3的方法，其中所述组织是宫颈上皮组织。

5.  根据任一项前述权利要求的方法，其中所述生物标志物是醋酸溶液。

6.  权利要求5的方法，其中所述醋酸溶液是3～5％的醋酸溶液。

7.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述组织的所述结构或功能特征是所述组织中细胞的核质比。

8.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是“最大值”，并且其中所述组织的所述结构或功能特征选自细胞外酸度、被动扩散常数、复层上皮的细胞层数和核质比。

9.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是“斜度A”或“斜度B”，并且其中所述组织的所述结构或功能特征选自调节细胞内pH方面的细胞功能障碍、脉管系统紊乱的存在和淋巴引流不良。

10.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是“斜度A”，并且其中所述组织的所述结构和功能特征选自细胞外pH、细胞外和细胞内pH梯度、跨细胞膜的渗透压差和细胞分化。

11.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是积分，并且大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示高级瘤变，并且其中所述参考值是在约480和约650之间的截止值，并且其中小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织。

12.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是积分，并且小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示存在HPV感染，并且其中所述参考值是在约420和约490之间的截止值。

13.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是最大值，并且大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示存在高级瘤变，并且其中所述参考值是在约70和约90之间的截止值，并且其中小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织。

14.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是最大值，并且小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示存在HPV感染，并且其中所述参考值是在约65和约90之间的截止值。

15.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是T最大值，并且大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示所述组织包含高级瘤变，并且其中所述参考值是在约80秒和约100秒之间的截止值，并且其中小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织。

16.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是到最大值的面积，并且大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示所述组织包含高级瘤变，并且其中所述参考值是在约120和约170之间的截止值，并且其中小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织。

17.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是斜度A，并且大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示所述组织包含高级瘤变，并且其中所述参考值是在约1.1(弧度)和约1.3(弧度)之间的截止值，并且其中小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织。

18.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是斜度B，并且小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示所述组织包含高级瘤变，并且其中所述参考值是在约-0.012和约-0.090之间的截止值，并且其中大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织。

19.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是“积分”并用于确定所述组织的功能或结构特征。

20.  权利要求1～6中任一项的方法，其中所述至少一个动态光学参数是“积分”或“最大值”，并且所述组织的结构特征是所述组织中细胞的核质比。

21.  权利要求20的方法，其中利用下式将核质比(NCR)与“积分”和“最大值”参数相关联：
和

22.  任一项前述权利要求的方法，其中通过以下步骤确定所述参考值：
基于组织或其部分的光学性质生成用于一段时间中第一动态光学曲线的第一数据，其中所述组织或其部分与进行试验的组织是相同类型，并且已知其具有特定的结构或功能特征和/或病理状态，并且已经暴露于生物标志物，
基于另一组织或其部分的光学性质生成用于一段时间中第二动态光学曲线的第二数据，其中所述另一组织或其部分与进行试验的组织是相同类型，并且已知其不具有特定的结构或功能特征和/或病理状态，并且已经暴露于生物标志物，
基于所述第一数据，从所述第一动态光学曲线确定至少一个动态光学参数的第一值，
基于所述第二数据，从所述第二动态光学曲线确定至少一个动态光学参数的第二值，以及
通过比较所述第一值和所述第二值，将所述至少一个动态光学参数与组织的特定结构或功能特征和/或病理状态进行关联。

23.  权利要求22的方法，其中利用已知具有特定结构或功能特征和/或病理状态的分开的组织样品来多次重复计算第一动态光学曲线和确定所述第一值的步骤，每次产生一组第一值；
其中利用已知不具有特定结构或功能特征和/或病理状态的分开的组织样品来多次重复计算第二动态光学曲线和确定所述第二值的步骤，每次产生一组第二值；以及
其中将所述至少一个动态光学参数和所述特定组织特征进行关联的步骤包括比较所述第一值的组和所述第二值的组以确定所述至少一个动态光学参数的参考值。

24.  任一项前述权利要求的方法，其中在施用生物标志物之前获取所述组织的参考图像。

25.  任一项前述权利要求的方法，其中计算与所述组织上单个点对应的每个像素处的动态光学曲线。

26.  任一项前述权利要求的方法，其中生成用于动态光学曲线的数据包括将获取的所述组织或其部分的图像对齐。

27.  任一项前述权利要求的方法，其中所述组织或其部分的所述确定的动态光学曲线/至少一个动态光学参数/结构或功能特征和/或病理状态用所述组织或其部分的伪彩图上的特定颜色来表示。

28.  任一项前述权利要求的方法，其中所述动态光学曲线表示在施用生物标志物之后从组织部位获得的光学性质的时间变化。

29.  一种容纳用于确定组织的结构和功能特征和/或病理状态的计算机程序指令的计算机可读介质，当由计算设备执行时，所述计算机可读介质使所述计算设备执行以下步骤：
从已经暴露于生物标志物的组织或其部分在一段时间中的光学性质计算动态光学曲线，
从所述动态光学曲线确定至少一个动态光学参数，
将所述至少一个动态光学参数的所述值与所述至少一个动态光学参数的至少一个参考值进行比较，所述至少一个参考值已知与所述组织的结构或功能特征和/或病理状态相关；以及
基于所述比较，提供与所述组织或其部分的结构或功能特征和/或病理状态有关的输出，
其特征在于，所述组织的病理状态选自瘤变和HPV感染，和/或所述组织的结构或功能特征选自核质比、细胞外酸度、被动扩散常数、复层上皮的细胞层数、调节细胞内pH方面的细胞功能障碍、脉管系统紊乱的存在、淋巴引流不良、细胞外pH、细胞外和细胞内pH梯度、跨细胞膜的渗透压差和细胞分化。

30.  权利要求29的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数选自“积分”、“最大值”、“到最大值的时间”、“到最大值的面积”、“斜度A”和“斜度B”。

31.  权利要求29或30的计算机可读介质，其中所述组织是宫颈组织和/或包含上皮细胞。

32.  权利要求31的计算机可读介质，其中所述组织是宫颈上皮组织。

33.  权利要求29～32中任一项的计算机可读介质，其中所述生物标志物是醋酸溶液，优选3～5％的醋酸溶液。

34.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述组织的所述结构或功能特征是所述组织中细胞的核质比。

35.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是“最大值”，并且其中所述组织的所述功能和结构特征选自细胞外酸度、被动扩散常数、复层上皮的细胞层数和核质比。

36.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是“斜度A”，并且其中所述组织的所述功能和结构特征选自细胞外pH、细胞外和细胞内pH梯度、跨细胞膜的渗透压差和细胞分化。

37.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是“斜度A”或“斜度B”，并且其中所述组织的所述功能和结构特征选自调节细胞内pH方面的细胞功能障碍、脉管系统紊乱的存在和淋巴引流不良。

38.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是积分，并且大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示高级瘤变，并且其中所述参考值是在约480和约650之间的截止值。

39.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是“积分”，并且其中小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织，并且其中所述参考值是在约480和约650之间的截止值。

40.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是积分，并且小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示存在HPV感染，并且其中所述参考值是在约420和约490之间的截止值。

41.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是最大值，并且大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示存在高级瘤变，并且其中所述参考值是在约70和约90之间的截止值。

42.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是最大值，并且小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织，并且其中所述参考值是在约70和约90之间的截止值。

43.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是最大值，并且小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示存在HPV感染，并且其中所述参考值是在约65和约90之间的截止值。

44.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是T最大值，并且大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示所述组织包含高级瘤变，并且其中所述参考值是在约80秒和约100秒之间的截止值。

45.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是T最大值，并且小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织，并且其中所述参考值是在约80秒和约100秒之间的截止值。

46.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是到最大值的面积，并且大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示所述组织包含高级瘤变，并且其中所述参考值是在约120和约170之间的截止值。

47.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是到最大值的面积，并且小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织，并且其中所述参考值是在约120和约170之间的截止值。

48.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是斜度A，并且大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示所述组织包含高级瘤变，并且其中所述参考值是在约1.1(弧度)和约1.3(弧度)之间的截止值。

49.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是斜度A，并且小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织，并且其中所述参考值是在约1.1(弧度)和约1.3(弧度)之间的截止值。

50.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是斜度B，并且小于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示所述组织包含高级瘤变，并且其中所述参考值是在约-0.012和约-0.090之间的截止值。

51.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述至少一个动态光学参数是斜度B，并且大于所述参考值的所述动态光学参数的确定值指示低级瘤变、不存在瘤变或健康组织，并且其中所述参考值是在约-0.012和约-0.090之间的截止值。

52.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述动态光学参数“积分”用于确定所述组织的功能和结构特征。

53.  权利要求29～33中任一项的计算机可读介质，其中所述动态光学参数是“积分”或“最大值”，并且所述组织的结构特征是核质比。

54.  权利要求53的计算机可读介质，其中利用下式将核质比(NCR)与“积分”和“最大值”参数相关联：
和

55.  权利要求29～53中任一项的计算机可读介质，所述计算机可读介质用于诊断和/或表征瘤变。

56.  权利要求29～55中任一项的计算机可读介质，其中通过以下步骤确定所述动态光学参数的所述参考值：
基于已经暴露于生物标志物的第一组织或其部分的光学性质计算一段时间中的第一动态光学曲线；其中所述第一组织已知具有特定的结构或功能特征和/或病理状态；
基于已经暴露于生物标志物的第二组织或其部分的光学性质计算一段时间中的第二动态光学曲线；其中所述第二组织已知不具有特定的结构或功能特征和/或病理状态；
基于所述第一动态光学曲线，确定至少一个动态光学参数的第一值，并且基于所述第二动态光学曲线，确定至少一个动态光学参数的第二值；以及
通过比较所述第一值和所述第二值，将所述至少一个动态光学参数与组织的特定结构或功能特征和/或病理状态进行关联。

57.  权利要求56的计算机可读介质，其中利用已知具有特定结构或功能特征和/或病理状态的分开的组织样品来多次重复计算第一动态光学曲线和确定所述第一值的步骤，每次产生一组第一值；
其中利用已知不具有特定结构或功能特征和/或病理状态的单独组织样品来多次重复计算第二动态光学曲线和确定所述第二值的步骤，每次产生一组第二值，并且其中对于所述第二值；以及
其中将所述至少一个动态光学参数和所述特定结构或功能特征和/或病理状态进行关联的步骤包括比较所述第一值的组和所述第二值的组以确定所述至少一个动态光学参数的参考值。

58.  权利要求29～57中任一项的计算机可读介质，其中所述动态光学曲线代表从组织部位获得的漫反射率的时间变化。

59.  权利要求1～28中任一项的方法或权利要求29～58中任一项的计算机可读介质，其中通过将多个所述至少一个动态光学参数与人工神经网络、统计学模式识别算法、贝叶斯分类或分类树的辅助相组合而将所述多个动态光学参数用于确定组织或其部分的结构和功能特征和/或病理状态。

60.  权利要求29～59中任一项的计算机可读介质，其中所述组织或其部分的所述确定的动态光学曲线/至少一个动态光学参数/结构或功能特征和/或病理状态用所述组织或其部分的伪彩图上的特定颜色来表示。

说明书表征组织的方法
技术领域
本发明涉及用于表征组织的方法，还涉及分别用于体内筛选和临床诊断的自动和半自动诊断方法。该方法依赖于在应用特异性生物标志物之后在组织中出现的动态光学现象的定量评价和动态光学参数预测值的确定。
背景技术
用于检测和分级上皮癌和癌前病变的现有诊断和筛选方法是定性的、主观的、多步骤的和劳动密集的，整体而言，它们的特征是成本效率低下。
对于子宫颈而言，开发用于预防癌症的筛选程序的目标是早期检测和鉴别它的可治愈前体，例如宫颈上皮内瘤样病变(CIN)。
巴氏试验(Pap-test)是宫颈瘤变的主要筛选方法。在该试验过程中，要从宫颈上皮获得大量细胞，并且在适当的固定和染色之后对该细胞进行细胞学检查。该方法的准确度受取样和读取误差限制，导致明显的假阴性率。在过去若干年中，已经进行了大量研究来确定巴氏试验的性能。研究人员一致认为其平均灵敏度是0.59，平均特异性是0.69-0.75[Nanda K et al.(2000)Annals of Internal Medicine，16；132(10)：810-819；Sankaranarayanana R，et al.(2005)InternationalJournal of Gynecology and Obstetrics，89：S4-S12；和Fahey MT et al.(1995)American Journal of Epidemiology，141：680-689]。还广泛认识到，巴氏试验不能同时获得高的特异性和灵敏度。例如，特异性在0.90-0.95范围内的可能增加会导致灵敏度降低到0.20-0.35范围[Fahey MT et al.(1995)American Journal of Epidemiology，141：680-689]。
通常地，灵敏度(SS)和特异性(SP)用作定量统计参数来描述诊断试验的性能。灵敏度表示真阳性(TP)的百分比，而特异性表示真阴性(TN)的百分比。例如，80％(或0.80)的灵敏度是指，借助于金标准试验，所述试验从100个诊断为该疾病阳性的病例中正确地诊断出80例。
在常规临床环境中，在异常Pap染色涂片(stained smear)之后是进行阴道镜检查，该检查涉及利用低倍显微镜检查子宫颈。根据以下标准评价宫颈组织：a)病变边缘的形态学；b)异常上皮的血管模式；和c)在局部施用标志物(如乙酸溶液)之后的染色程度。阴道镜分级主要基于肉眼检查，并且所检测的病变根据经验定性量表来分类。基于目视评价(阴道镜检查)的临床诊断表现出0.77的灵敏度和0.64的特异性[Mitchell MF，et al.(1998)Obstetrics & Gynecology，91：626-631]。常规的阴道镜检查不能诊断56％的微浸润性宫颈癌和30％的浸润性宫颈癌，导致不能在其可治愈状态下治疗病变。此外，在鉴别用于活组织检查的最不典型部位方面，两个不同医师之间存在高度分歧(77％)。研究人员已经报道了在通过阴道镜检查鉴别宫颈病变中观察者之间的显著变异性[Schiffman M，et al.(2003)Arch.Pathol.Lab.Med.，127：946-949；NHS Report.Cervical Screening Programme，England：2003-04 Statistical Bulletin 2004/20.October 2004.U.K；和Cantor SB，et al.(1998)Obstetrics & Gynecology，91；(2)：270-277]。这降低了阴道镜检查的重复性，其主要原因在于事实上阴道镜检查评价是定性的和主观的。
为了获得更准确的CIN诊断和评级，从可疑区域获得活组织检查样品，然后对其进行组织学检查。但是，活组织检查取样存在几个问题，例如：a)主观性和观察者之间的高度不一致性(>30％)，如以下研究中所揭示：Ismail等人[Ismail SM，et al.(1989)British MedicalJournal，298；(6675)：707-710]、Bellina等人[Bellina JH，et al.(1982)South Med.J.，75；(1)：6-8.56]和Robertson等人[Robertson AJ，et al.(1989)J.Clin.Pathol.，42；(3)：231-238]；和b)在选择用于活组织检查的异常部位中存在取样误差的风险。
宫颈瘤变的现有诊断链已经将发病率和死亡率降低到了历史性的低水平，但是利用现有诊断程序看起来不可能进一步显著降低发病率和死亡率。这一事实突显出需要更高效的替代技术，实现突出的(standalone)和单步骤的“即查即治”(see and treat)构思。
在过去十年中，已经进行了相当大的努力来开发能够提供改进的和客观的组织病理学信息的新型光学技术。这些方法通常基于如下事实：从正常到病理状态的组织变化改变组织的结构和功能性，并且这些改变可以通过利用光-组织相互作用现象来进行体内检测。对组织所发光之特征的测量和分析还可以提供关于不同分子存在性的信息或关于疾病进程中各种结构和功能变化的信息，由此提供一种用于对病变进行体内鉴定和分级的手段。
朝该方向的先前的尝试包括以检测体内生化和/或结构变化为目标的各种光谱分析和光谱成像技术。美国专利No 4,930,516清楚地公开了一种用于检测癌组织的方法，其中利用第一波长的激发光照射组织样品，从而响应所检测的激发光而产生荧光辐射。癌组织与正常组织之间的区别基于所发射的荧光辐射的波长和振幅。作为一个替代方案，正常组织的光谱振幅会与相同波长下癌组织的光谱振幅不同。
时间分辨光谱法基于监测荧光衰变时间，已知这种分析方法也具有区分被照射组织的类型或状态的潜力。例如，美国专利No 5,562,100公开了一种用于确定组织特征的方法，该方法基于利用特定波长的激发辐射的短脉冲照射靶组织，并检测靶组织响应于该激发所发射的荧光辐射。从记录的所发射辐射的振幅来确定组织特征。与之相似，美国专利No 5,467,767公开了一种利用时间分辨荧光光谱分析来确定组织恶性病症的方法。
另一些发明着重于结合两种或更多种测量技术来确定组织特征。例如，美国专利No 6,975,899公开了一种利用荧光和反射相组合以将癌组织中出现的生物化学变化与形态变化分开的设备和方法。该组合方法基于以下事实：当组织经历从正常状态到癌状态的变化时，荧光光谱分析在确定组织特征方面的有效性低于吸收光谱分析。
另一些专利，例如Utzinger等人的美国专利No 5,369,496公开了一种利用荧光、反射和偏振反射光谱分析来进行诊断性多光谱数字成像的方法和设备。在美国专利No 6,427,082中，提供了一种基于组织对激光激发的荧光响应(LIF)和对白光照射的反向散射响应来区分健康和病变宫颈组织的方法和系统。
一般而言，现有技术的光谱分析法着重于组织上有限个点处的组织特征，而光学成像法着重于对整个组织区域进行非时间依赖性的光学参数测量。而且，这些方法只提供关于生化或细胞组织结构变化的信息，而不提供关于上皮功能变化的信息。
C.Balas开发的另一种方法根本上不同于前述发明，其原因是它涉及定量测量施用生物标志物之后在组织中出现的动态现象(PCT公开号WO 01/72214 A1，[Balas C.(2001)IEEE Trans.on BiomedicalEngineering，48：96-104]和[Balas CJ，et al.(1999)SPIE 3568：31-37])。这种动态现象的测量能够潜在地提供关于组织的结构和功能特征的信息，有助于进行体内诊断。
在上述文献中公开的方法和装置依赖于施用病理区分剂(生物标志物)，其具有选择性增强异常细胞的结构和功能变化的可视化的性质，然后它在任意空间点和各种波长带下作为时间函数测量所发射的光。所记录的发射光强度(例如反向散射光的强度(IBSL)、漫反射率(DR)和荧光强度)作为时间的函数被定义为“动态光学曲线”(DOC)，它表达了在组织-生物标志物相互作用期间所产生之光学现象的时间特征。对所得DOC的建模和分析使得能够计算用于表征每个图像位置(像素或像素组)处生物标志物-组织相互作用动力学的各种动态光学参数(DOP)。这些参数的空间分布包括动力学图，其可以重叠到组织的彩色图像上。这些数据能够提供一种用于对病变进行体内检测、作图和分级以便诊断、筛选和跟踪并同时能够引导活组织取样和外科手术治疗的手段。
通常地，这种诊断技术的临床价值通过它在灵敏度(SS)和特异性(SP)的阳性和阴性预测值方面的性能来确定。如果SS和SP大于现有诊断方法的SS和SP，则可以认为该新技术适用于筛选和/或临床诊断目的。
发明内容
与在PCT公开No.WO 01/72214 A1；Balas C.(2001)IEEE Trans.on Biomedical Engineering，48：96-104和Balas CJ，et al.(1999)SPIE3568：31-37中公开的方法相比，本文所述的本发明提供了改进的方法。具体而言，本发明提供了基于选择适当DOP及其相应的截止值来用于筛选目的的自动诊断或用于阴道镜检查中的半自动临床诊断的方法，所述方法能够最佳地区分各种病理状态。这是通过将从DOC提取的DOP与定性和定量病理学相关联来实现的。本文公开的本发明还提供用于经过建立上皮转运现象的模型来评价活组织中的结构和功能特征以及它们与体内测量的动态光学特征的关联性的方法。
本发明提供用于表征(例如分级)组织例如(如宫颈、子宫、口腔、皮肤、呼吸和胃肠的)癌组织和/或癌前组织的方法，例如自动或半自动的方法。因此，在本发明的第一方面中，提供了一种用于确定组织的结构和功能特征和/或病理状态的方法，其包括：
基于已经暴露于生物标志物的组织或其部分的光学性质生成一段时间内动态光学曲线的数据；
基于所述数据，确定动态光学参数的值；
将该动态光学参数的值和已知与该组织的结构或功能特征和/或病理状态相关的动态光学参数的参考值进行比较；以及
基于该比较，确定所述组织或其部分的结构或功能特征和/或病理状态。本发明的方法可用于例如辅助组织的筛选、临床诊断、引导活组织取样或治疗。该组织可以是上皮癌前组织或者宫颈、子宫、口腔、皮肤、呼吸或胃肠的癌组织或癌前组织。该方法包括基于已经暴露于生物标志物的组织或其部分在一段时间中的反向散射光的强度绘制动态光学曲线；基于该动态光学曲线，确定动态光学参数，例如“积分”、“最大值”、“到最大值的时间”、“到最大值的面积”、“斜度A”和“斜度B”；基于一个或更多个所述动态光学参数或其亚组合的值来表征该组织。所述动态光学参数代表施用生物标志物之后从组织部位获得的反向散射光强度的时间变异，并且可以经过对一个或更多所述动态光学曲线的数学分析或经过对一个或更多所述动态光学曲线的经验、手工或视觉分析来产生所述动态光学参数。
在一个特别优选的实施方案中，所述试验组织是宫颈组织。在另一个实施方案中，所述方法优选用于诊断或表征瘤变和/或检测HPV感染。在又一个实施方案中，所述方法用于确定组织中细胞的核质比。所述试验组织优选包括上皮细胞。
本发明方法优选给出至少60％的灵敏度和至少60％的特异性，甚至更优选至少65％或70％的灵敏度和至少65％或70％的特异性，最优选至少75％、76％、77％、78％、79％或80％的灵敏度和至少75％、76％、77％、78％、79％或80％的特异性。
在一个实施方案中，生物标志物选自醋酸(例如3～5％的醋酸溶液)、甲酸、丙酸、丁酸、卢戈氏碘(Lugol’s iodine)、希尔氏碘(Shiller’siodine)、亚甲基蓝、甲苯胺蓝、渗透剂、离子剂和靛蓝胭脂红(indigocarmine)的溶液。
在另一个实施方案中，所述动态光学参数是积分(Integral)，并且至少约480～650的标准化值(无量纲)(例如，至少约480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640或650)指示所试验的宫颈组织为高级宫颈瘤变(例如，区分高级宫颈瘤变和非高级宫颈瘤变)。
在另一个实施方案中，所述动态光学参数是积分，并且至少约420～490的标准化值(无量纲)(例如，至少约420、430、440、450、460、470、480、485或490)指示HPV感染是所述宫颈癌组织的原因(例如，区分HPV感染和高级宫颈瘤变)。
在又一个实施方案中，所述动态光学参数是最大值(Max)，并且至少约70～90的已校准单位的值(例如，至少约70、75、80、85、86、87、88、89或90)指示所述宫颈组织是高级宫颈瘤变(例如，区分高级宫颈瘤变和非高级宫颈瘤变)。
在又一个实施方案中，所述动态光学参数是最大值，并且至少约65～90的已校准单位的值(例如，至少约60、65、70、75、80、85、86、87、88、89或90)指示HPV感染是所述宫颈组织的原因(例如，区分HPV感染和高级宫颈瘤变)。
在又一个实施方案中，所述动态光学参数是到最大值的面积(Areato Max)，并且至少约120～170的标准化值(无量纲)(例如，至少约120、130、140、150、160或170)指示所试验的宫颈组织为高级宫颈瘤变(例如，区分高级宫颈瘤变与非高级宫颈瘤变)。
在又一个实施方案中，所述动态光学参数是到最大值的时间(Timeto Max)，并且至少约80～100秒的值(例如，至少约80、85、90、95、100)指示所试验的宫颈组织为高级宫颈瘤变(例如，区分高级宫颈瘤变与非高级宫颈瘤变)。
在又一个实施方案中，所述动态光学参数是“到最大值的面积”，并且大于或约等于高级宫颈瘤变之“到最大值的面积”截止值的值指示所述宫颈组织是高级宫颈瘤变(例如，区分高级宫颈瘤变与非高级宫颈瘤变)，其中“到最大值的面积”截止值在标准化的约120和约170(无量纲)之间(例如，约120、130、140、150、160或170)。
在又一个实施方案中，所述动态光学参数是斜度A(SlopeA)，并且至少约1.1至1.3(弧度)(例如，至少约1.1、1.2或1.3弧度)的值指示所述宫颈组织为高级宫颈瘤变(例如，区分高级宫颈瘤变与非高级宫颈瘤变)。
在又一个实施方案中，所述动态光学参数是斜度B，并且至少约-0.012至-0.090(弧度)(至多约例如-0.012、-0.020、-0.025、-0.030、-0.040、-0.050、-0.060、-0.070、-0.080、或-0.090)的值指示所述宫颈组织为高级宫颈瘤变(例如，区分高级宫颈瘤变与非高级宫颈瘤变)。
在另一方面中，本发明提供了用于表征宫颈组织(例如宫颈癌)或癌前组织的方法，该方法是通过以下进行的：基于从已经暴露于生物标志物的成像宫颈组织或其部分在一段时间中所观察的光学性质(例如来自宫颈癌或癌前组织的反向散射光的强度)绘制动态光学曲线；基于该动态光学曲线，确定选自“积分”、“最大值”、“到最大值的时间”、“到最大值的面积”、“斜度A”和“斜度B”的动态光学参数；基于一个或更多所述动态光学参数或其亚组合的值来表征宫颈癌或癌前组织。
在另一方面中，本发明提供了用于表征组织的方法，包括以下步骤：通过例如施加器(applicator)将生物标志物施用到组织；在施用生物标志物之前和之后，并且施用生物标志物和开始获取图像之间适当同步化，在预定时间段内以时间顺序获取并对齐一系列光谱和彩色图像；从该系列光谱和彩色图像计算每个像点处的动态光学曲线，其表达预定光谱带中的发射光作为时间的函数；从所述动态光学曲线计算一个或更多个动态光学参数，并且以伪彩图的形式显示所述一个或更多动态光学参数，由此表征组织。
在另一个方面中，本发明提供了用于确定组织的体内功能和结构特征的方法。该方法包括通过例如施加器将生物标志物施用到组织；在施用生物标志物之前和之后，并且施用生物标志物和开始获取图像之间适当同步化，在预定时间段内以时间顺序获取并优选对齐一系列光谱和彩色图像；从该系列光谱和彩色图像计算选定像点或每个像点处的动态光学曲线，其表示组织在预定光谱带中的光学特征例如发射光作为时间的函数；从所述数据(即动态光学曲线)计算一个或更多个动态光学参数(例如“积分”、“最大值”、“到最大值的时间”、“到最大值的面积”、“斜度A”和“斜度B”)，并且以伪彩图的形式显示所述一个或更多个动态光学参数，由此确定组织的体内功能和结构特征。
已经证实，针对本发明各个方面所列出的所有实施方案加以必要修改后适用于本发明的其它相关方面，并且为了简明起见不再赘述。
在一个实施方案中，所述动态光学参数“积分”用于获得所述组织功能和结构特征的信息。在另一个实施方案中，动态光学参数是“最大值”，而组织的功能和结构特征选自细胞外酸度、被动扩散常数、复层上皮的细胞层数和核质比。
在又一个实施方案中，关联核质比(NCR)与“积分”和“最大值”的数学式为：和
在又一个实施方案中，所述动态光学参数是“斜度A”，组织的功能和结构特征选自在调节细胞内pH方面的细胞功能障碍、脉管系统紊乱的存在和淋巴引流不良。
在相关的方面中，本发明还提供容纳用于表征癌组织的计算机程序指令的计算机可读介质，当被计算设备执行时，该计算机可读介质使计算设备执行以下步骤：
施用生物标志物之后，从一系列光谱和彩色图像计算选定图像点处的动态光学曲线，该动态光学曲线表达预定光谱带中发射光作为时间的函数；
从所述动态光学曲线确定一个或更多个动态光学参数，以及
存储所述一个或更多个动态光学参数以用于表征癌组织。
在一个优选的实施方案中，经过将人工神经网络、统计学模式识别算法、贝叶斯分类或分类树的辅助与动态光学参数相结合，所述动态光学参数用于区分病理状态。
在另一个方面中，提供了一种容纳计算机可执行指令的计算机可读介质，该计算机可执行指令用于实施表征组织的方法，所述方法包括
从已经暴露于生物标志物的组织或其部分获得在一段时间中的光学性质确定动态光学曲线的数据；
基于所述数据，确定动态光学参数，以及
基于一个或更多个所述动态光学参数或其亚组合的值来表征所述组织。
相似地，本发明提供了一种容纳用于表征宫颈组织的计算机可执行指令的计算机可读介质，包括用于执行以下步骤的指令：
基于已经暴露于生物标志的宫颈组织或其部分在一段时间中的一个或更多光学性质绘制动态光学曲线；
基于所述动态光学曲线，确定选自“积分”、“最大值”、“到最大值的时间”、“到最大值的面积”、“斜度A”和“斜度B”的动态光学参数；以及
基于一个或更多个所述动态光学参数或其亚组合的值来表征所述宫颈组织。
还提供一种容纳用于执行表征组织之方法的计算机可执行指令的计算机可读介质，该方法包括以下步骤：
将生物标志物施用到组织；
在施用生物标志物之前和之后，并且在施用生物标志物和开始获取图像之间适当同步化，在预定时间段内按时间顺序获取一系列光谱和彩色图像；
从该系列光谱和彩色图像计算选定图像点处的动态光学曲线，该动态光学曲线在预定光谱带中将光学性质表达为时间的函数；
从所述动态光学曲线计算一个或更多个动态光学参数，以及
以伪彩图的形式显示所述一个或更多个动态光学参数，由此表征癌组织。
本文中还提供一种容纳计算机可执行指令的计算机可读介质，所述指令用于执行确定组织的体内功能和结构特征的方法，该方法包括以下步骤：
将生物标志物施用到组织；
在施用生物标志物之前和之后，并且在施用生物标志物和开始获取图像之间适当同步化，在预定时间段内以时间顺序获取并对齐一系列光谱和彩色图像；
从该系列光谱和彩色图像计算每个图像点处的动态光学曲线，该动态光学曲线表达预定光谱带中发射光作为时间的函数；
从所述动态光学曲线计算一个或更多个动态光学参数，以及
以伪彩图的形式显示所述一个或更多个动态光学参数，由此确定组织的体内功能和结构特征。
与本发明方法相关的所有合适的实施方案加以必要的修改后适用于本发明的计算机可读介质方面，反之亦然。
从以下详细说明和权利要求中，本发明的其它特征和优点是显而易见的。
附图说明
现在将参照以下附图和权利要求描述本发明的优选实施方案。在附图中，相同的附图标记用于表示各视图中的相同要素。
图1是本文所公开诊断方法的流程图的示意图。
图2显示从与醋酸相互作用的宫颈组织部位获得的典型DOC，其对应于人乳头瘤病毒(HPV)(经组织学分类)。
图3显示从与醋酸相互作用的宫颈组织部位获得的典型DOC，其对应于炎症(经组织学分类)。
图4显示从与醋酸相互作用的宫颈组织部位获得的典型DOC，其对应于宫颈上皮内瘤样病变I(CIN I)(经组织学分类)。
图5显示从与醋酸相互作用的宫颈组织部位获得的典型DOC，其对应于高级(HG)病变(CIN II、III，微浸润性癌)(经组织学分类)。
图6示出与典型DOC对应的DOP，其可用于诊断组织的各种病理状况。
图7示出对应于指示性DOP(积分)和“ROC曲线下面积”的受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线，其表达该特定DOP在区分低级和高级CIN中的性能。该结果是在310位妇女参与的临床环境中从与醋酸溶液相互作用的体内宫颈上皮获得的。
图8显示从与指示性DOP(积分)对应的ROC分析获得的灵敏度(灰色)和特异性(黑色)作图，其表达该特定DOP在区分低级和高级病变中的性能。选自480到650范围的积分值包括用于区分低级和高级宫颈瘤变的截止值，其中SS和SP均大于60％。该结果是在310位妇女参与的临床环境中从与3％醋酸溶液相互作用的体内宫颈上皮获得的。
图9A～E显示从DOC提取的5个不同DOP的带对应误差线的平均值。该结果是在310位妇女参与的临床环境中从与醋酸溶液相互作用的体内宫颈上皮获得的。
图10A和10B显示核质比(NCR)散点图和线性回归曲线，在组织样品中相对于活组织检查之前从相同样品获得的两个不同DOP(积分和最大值)对此进行了定量评价。该结果是在310位妇女参与的临床环境中从与醋酸溶液相互作用的体内宫颈上皮获得的。
图11显示从与醋酸相互作用的宫颈组织部位获得的典型DOC，其对应于健康(正常)组织(经组织学分类)。
图12显示了联合硬件设置的一个示例性实施方案通过本文所公开发明的软件执行所采用的步骤，用于获取图像组织数据。
具体实施方式
光学生物标志物是引发异常组织的光响应暂时性变化的化学物质。对于高效生物标志物而言，异常组织的结构、形态和功能变化表现在生物标志物组织相互作用期间产生的光学信号中，这有助于对病变进行鉴定和定位。
涉及施用生物标志物的典型诊断程序包括：
■局部或系统性施用一种或更多种生物标志物。
■检查生物标志物引发的组织光学性质变化。
■定位异常区域以进行诊断和治疗。
传统的涉及生物标志物的诊断方法存在主要与以下事实相关的几个缺点：不能有效地进行动态光学现象的视觉评价，其原因在于人体光学系统在检测和记录不同组织部位中具有不同动力学的快速变化现象的生理局限性。
Balas C.(2001)IEEE Trans.on Biomedical Engineering，48：96-104；Balas CJ，et al.(1999)SPIE 3568：31-37；和PCT公开No.WO 01/72214 A1公开的一种方法和装置提供了该问题的一种解决方案，其中提供了从生物标志物-组织相互作用产生的动态光学现象的定量评价和作图分析。
如上所示，本发明提供与前述方法相比改进的方法。例如，针对在区分各种正常和病理状况的预测值和效率方面，本发明提供了DOC的系统性参数分析和所得DOP的比较性评价。
本文所述的本发明涉及基于选择合适DOP及其最佳区分各种病理状态的相应截止值，用于筛选目的的自动诊断或者用于阴道镜检查中半自动临床诊断的方法。这是通过将从DOC提取的DOP与定性和定量病理学相关联来实现的。本文公开的本发明的另一目的是提供一种经过建立上皮转运现象的模型来评价活组织中结构和功能特征以及它们与体内测量的动态光学特性的关联性的方法。
本文中术语“动态光学曲线”和“DOC”可互换使用，意在包括代表所观察组织在一段时间中的光学特性(例如来自组织或其部分的反向散射光的强度、光反射、来自组织或其部分的光的漫反射或来自组织或其部分的荧光，所述组织已经暴露于生物标志物)的曲线。
本文所用的术语“生物标志物”意思包括能够改变来自试验组织样品的光学信号的任意化学试剂。这种试剂的非限制性实例包括但不限于醋酸、甲酸、丙酸、丁酸、卢戈氏碘、希尔氏碘、亚甲基蓝、甲苯胺蓝、渗透剂、离子剂(ionic agent)和靛蓝胭脂红。可以使用前述试剂的任意溶液。在一个优选实施方案中，生物标志物是醋酸溶液，例如3～5％的醋酸溶液。
本文使用的术语“动态光学参数”意思包括本领域技术人员可以基于其表征组织(例如分级组织)的一个或更多参数。如本文所述，这种参数可经过对基于来自已经暴露于生物标志物的癌组织或其部分在一段时间中的反向散射光强度绘制的一个或更多动态光学曲线进行数学分析来获得。这种参数还可以通过经验、手动或视觉分析一个或更多所述动态光学曲线来获得。本发明涵盖的动态光学参数的非限制性实例是“积分”、“最大值”、“到最大值的时间”、“到最大值的面积”、“斜度A”和“斜度B”。
这些动态光学参数的数值是基于利用数字成像系统(DySIS技术，Forth Photonics)获得的那些值，该数字成像系统利用18％反射校准试样校准，以在该系统的绿色通道中对该试样产生0-255灰度量表中的105灰度值。基于该校准方案，最大值被给作以校准单位(0-255级)表示的绿色灰度值最大差异或者被给作反射率最大差异(0-100％级)。
本文引用的积分截止值是从与τ＝240秒积分时间对应的DOC计算出来的：
Itg = c ∫ 0 240 ( I t - I t = 0 ) dt ]]>
其中c是换算系数(scaling factor)，其中值c＝8[τIt＝0]-1，或代替c＝1/30(强度单位)-1秒-1。It是在施用生物标志物之后指定时间点的发射强度，It＝0是在施用生物标志物之前的发射强度。
到最大值的面积是从同一Itg公式计算的，唯一不同之处在于τ＝T最大值。因此，Itg和到最大值的面积的值在本文中都表示为无量纲的量。
不同的获取、积分时间段和校准方案和样品都可能导致不同的截止值。选择240秒积分时间段作为最佳时间段，它在此处代表一个实例，而不是限制。本文公开的“校准单位”和“无量纲的量”也可以称为“任意单位”。
因此，本文引用的值指经过上述特定方案获得的那些值。这为技术人员提供了一种用于比较利用其它成像系统获得的定量值的可容易辨别的方法。
本文所用名词在不限定数量时是指一个或多于一个(即，至少一个)所述对象。例如，“动态光学参数”是指一个或更多个动态光学参数。
本文使用的术语“组织”意思包括任意组织或其部分，包括癌组织和癌前组织。例如，该组织可以是上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织。在本发明的一个优选实施方案中，该组织是上皮组织或其部分，例如，覆盖和衬里上皮或腺上皮。例如，该组织可以是宫颈组织；皮肤组织；胃肠道组织，例如口腔组织、胃组织、食管组织、十二指肠组织、小肠组织、大肠组织、胰腺组织、肝组织、胆囊组织或结肠组织；或鼻腔组织。在一个优选实施方案中，该组织是癌前组织或癌组织，例如发育异常(dysplasia)、瘤变(neoplasia)或癌变(cancerous lesion)。
本文使用的短语“表征”癌组织意思包括利用本文所述的方法表征癌组织以便有助于癌组织的筛选、临床诊断、引导活组织检查取样和/或治疗。例如，可以分级癌组织，例如表征为低级(LG)病变(即，HPV感染、炎症或CIN I级病变或其亚组合)或高级(HG)病变(即，CIN II级病变、CIN III级病变或浸润性癌(CA)或其亚组合)。
本文使用的组织特征包括但不限于组织的结构特征、功能特征和病理状态以及前述项的任意组合。
有各种程度的宫颈上皮瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)，以前称为发育异常(dysplasia)。组织学评价的病变通常是利用CIN命名法来表征的；细胞学涂片通常是根据Bethesda系统来分类的；并且宫颈癌通常是基于国际妇产科联盟(FIGO)系统来分期的。I级CIN(轻度发育异常)定义为低于三分之一的上皮衬层生长紊乱；II级CIN(中度发育异常)定义为三分之二的所述衬层异常成熟；III级CIN(严重发育异常)包括多于三分之二的上皮厚度具有原位癌(CIS)，这代表全厚度的成熟障碍。对于宫颈发育异常(cervical dysplasia)(即宫颈上皮衬层的生长和发育紊乱)具有公知的分类系统(例如参见DeCherney，A.等人，CurrentObstetric & Gynecologic Diagnosis & Treatment，9th ed.，The McGraw-HillCompanies，New York，NY(2003)，其内容通过引用并入本文)。
“参考值”涉及各种动态光学参数(DOP)的预测和截止值，其与组织的特定组织病理状态和/或结构和功能特征相关联并可用于区分它们。
图1示出了本发明方法的基本步骤。
·应用生物标志物之前获取组织的参考图像，102。需要该步骤以记录所检查组织的原始光学性质。
·施用生物标志物，例如通过施加器，104。生物标志物施加器还可以提供引发信号以在施用生物标志物之后立即(即少于1秒)开始获取图像，由此确保获取过程的同步化和标准化。
·在预定的光谱带内，在约4分钟的预定时间段内以约5到7秒之间的取样或获取速率按时间顺序获取一系列图像，106。该时间段的确定考虑到了生物标志物所引发光学现象的持续时间。本领域技术人员会认识到，该时间段可以从4分钟延长到1或2小时或其间的任意时间间隔，但是可以使用诸如患者舒适性、患者便利性、生物标志物所引发光学现象在一段时间之后的有效性、系统能力(如存储能力和处理能力)以及其它因素之类的因素来确定所期望的时间段。作为替代，可以根据获取的图像数目(例如30个图像、35个图像、40个图像等)测量该时间段。选择光谱带，以便实现生物标志物响应区域和非响应区域之间的最大对比度。
·对齐获取的图像，108。该步骤对于获得每个组织点所发射的光强度的时间变化是必要的。与特定图像位置对应的图像像素需要与同一组织点对应。在体内测量的几种情况下，在连续获取组织图像期间由于呼吸等原因存在光学传感器-组织相对运动。可以确保光学传感器和所检查组织区域之间的恒定相对位置，例如通过机械稳定化手段和/或图像对准算法。将所获取图像与参考图像正确对准(102)还确保从与所检测组织的特定位置相对应的每个像素或像素组有效提取DOC。
·对于选定图像，从获取的所述系列图像中的一些或全部图像计算每个图像位置(即每个像素位置或者由一组像素限定的位置)处的DOC，其代表预定光谱带中作为时间函数的漫反射率[DR]或荧光强度(FI)，110。通过所采用生物标志物的性质确定光学性质(DR、FI)的选择，以分别改变漫反射率或荧光特性。如上所述，选择恰当的光谱带以提供生物标志物响应和非响应组织和组织区域之间的最大对比度。在一个示例性实施方案中，将在下文描述的图2～5，显示了从与醋酸溶液(生物标志物)相互作用的对应于各种病理(经组织学分类)的宫颈组织部位获得的DOC曲线。
·对于选定图像，从在每个图像位置(即每个像素位置或由一组像素限定的位置)获得的DOC计算DOP，112。获得表达所述现象之动态特征的许多参数。根据生物标志物选择性染色组织异常的效率，DOP潜在地能够提供一种评价体内各种组织病理的定量手段。然后，可以以伪彩图形式显示这些参数，其中不同的颜色代表不同的参数值。这种伪彩图可用于确定病变级别和边界，由此有助于活组织检查取样、治疗以及一般性病变管理。在本发明的一个实施方案中，从表达由生物标志物-组织相互作用产生的光学现象之动态特征的DOC(例如，在选定时间范围内的DOC积分、最大值、斜度，例如在下文表1中所示)计算各种DOP。下文对组织为宫颈上皮而生物标志物为醋酸溶液的情况下(参考图6)提供了指示性DOP的详细分析。
·在另一实施方案中，在统计学上足够的组织群中通过将DOP和DOC与提供明确诊断的标准方法如组织学(金标准)进行比较来试验性确定DOP和DOC的预测值。对于那些显示适当预测值的DOP，确定最好地区分各种病理状态的截止值，116。对于特定的生物标志物和上皮组织，该步骤可以单独进行，而不是作为本方法常规实施的一部分。该步骤对于将DOP和DOC与特定病理状态进行关联是必要的。在建立这种关联之后，就能够基于预定的DOP截止值区分病理状态，120。参照图7～9，下文提供了在组织为宫颈上皮而生物标志物为醋酸的情况下评价各种DOP预测值的详细分析。
·可以以伪彩图形式显示代表不同病理状态和分级的DOP和DOC值，其中不同的颜色代表不同的级别，124。伪彩图表达了能够用于体内分级所述病变以及确定病变边界的病理图，这有助于活组织取样、治疗以及一般性病变管理。
·在本发明的另一实施方案中，基于通过体内和体外实验对生物标志物-组织相互作用的理解和分析，建立了上皮组织的转运现象和结构特征的生物物理模型，114。在通过组织的功能特征来确定上皮传输现象的情况下，以及在以DOP和DOC表达功能特征的情况下，将模型参数与后者关联，从而提供一种用于体内评价组织的功能和结构特征的手段。具体地，可以转换DOP值以表达各种正常和病理状态下组织的功能和/或结构特征，118。值得注意的是，只可以在活组织中确定功能特性，但是可以在体外通过分析组织样品(活组织检查)确定结构特征。本发明方法提供了一种用于体内评价这两种特征的手段，从而实现更完全的上皮系统表征或鉴定。完全的上皮系统表征/鉴定可望提高诊断性能，这是因为各种病理状态影响上皮组织的功能和结构性质。作为实例，并参考使用醋酸溶液作为生物标志物的宫颈癌的情形中的结构现象，将DOP值与表达通过定量病理学方法获得的核密度的定量数据相关联。该关联在图10～11中示出，这能够将DOP转换成核质比。在功能或结构特征的两种情形中，可以产生伪彩图，其中利用不同颜色代表不同的功能和结构特征，122。伪彩图表示组织的功能和/或结构图，其可用于病变的体内分级以及确定病变的边界，有助于活组织检查取样、治疗和一般性病变管理。伪彩图还可以用于体内监测生物学标志物在组织的结构和功能特征中的作用，并因此用于评价生物标志物在突出异常组织区域中的效率。
作为宫颈组织情形下本发明的一个示例性实施方案，确定最好地区分各种状况(包括正常、HPV(人乳头瘤病毒)感染、炎症和不同级别的宫颈上皮内瘤样病变(CIN))的合适DOP和相应的截止值。使用3-5％的醋酸溶液作为生物标志物，然后进行上述测量程序来获得DOC。为了确定DOC和DOP的预测值，从多中心临床试验获得试验数据，其中登记并检查了308位具有异常巴氏试验的妇女。通过在蓝-绿光谱范围内以时间顺序获取宫颈组织图像来获得DOC。对醋酸溶液响应性组织区域(如DOC和DOP伪彩图所示出的)进行活组织检查并提交用于组织学评价和分级。然后将组织学分类与一组DOP比较，以通过ROC分析确定与组织学分级最佳关联的那些。从ROC曲线中获得每个参数或参数集合的最佳截止值，从而提供期望的SS和SP值。
在一个示例性实施方案中，图2到图5显示了从组织学上分别分类为：HPV感染、炎症、CIN1和高级(HG)病变的宫颈组织部位获得的典型DOC。作为临床实践中常用的进一步分类，HPV、炎症、CIN1或其组合称为低级(LG)病变。HG病变对应于CIN2、CIN3或浸润性癌(CA)中任意一种或组合。组织学级别CIN1、CIN2和CIN3是CA的前体(CIN1-最低，CIN3-最高)。纵轴对应于IBSL(以任意单位表示)，横轴代表将醋酸施用到组织后过去的时间(秒)。可清楚地看出，与不同病理状态对应的DOC在强度-时间变化方面存在多方面的不同。
具体地，可以看出，分类为HPV的曲线几乎按指数增加，然后到达饱和水平，而对应于炎症的曲线则更早达到更高的峰值，然后突然减弱。分类为CIN1的曲线比对应于HPV或炎症的曲线更晚达到其最大值，然后缓慢减弱，其速率明显低于在炎症情形中观察到的。对于HG病变，与在HPV和CIN1中观察到的相比更晚达到曲线最大值，但是达到了更高的值，而减弱速率非常小；比在炎症分类曲线中看到的小得多。与这些发现相比，从正常组织部位获得的DOC在整个测量期间几乎恒定(见图11)。
尽管有帮助，但是与特定病理状态相关对DOC的前述说明是相当定性的。因此，下文描述从动态曲线提取的定量参数，其能够稳健地区分LG和HG病变以及区分HPV感染和HG病变。
在本发明的一个优选实施方案中，还可以利用数学公式进一步处理从组织获得的DOC，以获得描述与病理状态相关的所记录DOC的各种特征的单个DOP或DOP组合，该数学公式包括但不限于多项式、单-、双-和多指数拟合、线性和非线性分解、或其组合。
在另一实施方案中，还可以基于所检查组织样品特有的特征(例如，患者年龄、绝经期(对妇女而言))或基于表征接受组织检查之对象的地区性、全球性群体的特征或基于以上两者对所得的DOP进行加权。
在本发明方法的另一优选实施方案中，在区分LG和HG病变中具有高诊断价值的DOP如下：
1.最大值
该参数定义为施用生物标志物之后所记录DOC的最大值和在t＝0时DOC值之间的差。
2.积分
该参数定义为由所记录DOC和与第一DOC实验点相交的时间轴的平行线所包围的面积。针对预定时间段计算积分，其取决于生物标志物-组织相互作用所产生之光学效应的持续时间。在宫颈组织和醋酸溶液(生物标志物)的情形中，对t＝0到t＝4分钟计算积分。还可以在用封闭型数学形式对所测量曲线取近似之后通过数学公式的积分来分析计算该参数。
3.T最大值
该参数定义为达到DOC最大值所需的时间，其中所述最大值是“最大值”参数。
4.到最大值的面积
该参数定义为与从t＝0秒(即醋酸白化(acetowhiten)现象的起始时间)到t＝T最大值的DOC所对应的曲线面积。同样，也可以在用封闭型数学形式对所测量曲线取近似之后通过数学公式的积分来分析计算该参数。
5.斜度A
这是一个表达直到“最大”值时强度增加速率的参数。作为指示，它可以作为曲线的第一导数或作为直至“最大”值时中间斜度的平均值来计算。
6.斜度B
这是一个表达从曲线“最大”值开始强度降低的速率的参数。作为指示，它可以作为曲线的最后导数或作为从“最大”值开始中间斜度的平均值来计算。
图6在DOC曲线上示出了前述定义参数中的4个：“最大值”、“T最大值”、“斜度A”和“斜度B”。另外两个参数(“积分”和“到最大值的面积”)实际上代表分别由指示点：KLNP和KLM所封闭的面积
图7示出了针对前述“积分”参数的累积结果的LG/HG ROC分析。ROC曲线下面积是0.83，其含义是高区分度(灵敏度)。
图8示出了从对用于定量醋酸白化特征的“积分”参数的各个值进行ROC分析所获得的灵敏度(灰色)和特异性(黑色)曲线。可清楚地看出，对于一定的值，灵敏度和特异性最大同时达到78％。
图9示出了针对LG和HG诊断状态，前述一些参数的平均值(相应的误差线代表95％置信区间)，这是通过组织学家进行活组织检查推断出来的。
利用ROC分析计算区分LG和HG病变的最佳值范围，如前文对“积分”参数所示出的。具体地，对于每个参数类型，对跨越整个范围[P最小、P最大]的各个阈值计算真阳性(TP)和假阳性(FP)的百分比，其中P代表特定参数的值。使用其中灵敏度(SS＝TP)和特异性(SP＝100-FP)大致相互一致的阈值作为区分LG和HG的最佳(截止)值。
表1示出了对于前述定义的一些参数，用于区分LG和HG的最佳值范围，其导致特异性和灵敏度大于60％所示的性能。
表1

＊上述参数是利用数字成像系统(DySIS技术，Forth Photonics)获得的，该数字成像系统利用18％反射校准试样校准，以在系统的绿色通道中在0～255灰度量表中对后者产生105的灰度值。基于该校准方案，作为以校准单位(0～255级)表示的绿色灰度值最大差值或作为反射率最大差值(0～100％级)给出最大值。
＊＊所示的积分截止值是从对应于τ＝240秒积分时间的DOC计算的：
Itg = c ∫ 0 240 ( I t - I t = 0 ) dt ]]>
其中c是换算系数，其中c＝8[τIt＝0]-1或替代c＝1/30(强度单位)-1秒-1，It是在施用生物标志物之后在指定时间点的发射强度，It＝0是在施用生物标志物之前的发射强度。
因此，从同一Itg公式计算到最大值的面积，唯一的差别在于τ＝T最大值。此处的Itg和到面积的最大值都表示为无量纲的量。
不同的获取、积分时间段和校准方案和样品都可能导致不同的截止值。选择240秒积分时间段为最佳时间段，它在此代表一个实例，而不是作为限制。
虽然已经参照具体实施方案显示并描述了本发明，但是本领域技术人员将会理解，在不违背本发明精神和范围的情况下可以对形式和细节进行变化。
基于前述分析，在一个优选的实施方案中，使用具有约480～650的截止值范围的DOC“积分”参数来区分LG和HG病变。
在另一优选实施方案中，使用具有约70～90或35％～45％的截止值范围的DOC“最大值”参数来区分LG和HG病变。
在又一实施方案中，使用具有约120～170的截止值范围的“到最大值的面积”参数来区分LG和HG病变。
在又一实施方案中，使用具有约80～100秒的截止值范围的“T最大值”参数来区分LG和HG病变。
在另一个优选实施方案中，使用具有约1.1～1.3值范围的“斜度A”参数来区分LG和HG病变。
在再一实施方案中，使用具有约-0.012～-0.090的截止值范围的“斜度B”参数来区分LG和HG病变。
还可以进行类似的分析来获得前述参数的合适截止值，以用于区分HPV感染和HG病变。
表2示出了对区分HPV/HG产生大于60％的特异性和灵敏度的“最大值”和“积分”参数的最佳值范围。
表2

在一个优选的实施方案中，使用具有约380～490的截止值范围的DOC“积分”参数来区分HPV感染和HG病变。
在另一个实施方案中，使用具有约65～90的截止值范围的DOC“最大值”参数来区分HPV感染和HG病变。
在又一实施方案中，包括但不限于上述参数的参数组合可以提供一种用于确定组织病理学的手段。例如，该参数可以是在施用所述生物标志物之后直至约40秒取样时间的平均斜度DOC与最大值的乘积。大于约2.05±0.2(校准强度单位/时间)的乘积值可以指示高级瘤变的存在，而较低的值可以指示低级瘤变或健康组织。
除了使用截止参数值来区分LG和HG病变或区分HPV和HG病变的“硬聚类”(hard-clustering)方法之外，可以采用更高级的统计和模式识别分析技术(例如贝叶斯分类、人工神经网络(ANN)、分类树)来提取其它线性或非线性的、单个参数或多参数组合以获得高度区分。在又一个实施方案中，采用利用贝叶斯建模的参数方法(例如描述于FukunagaK.(1990)New York：Academic，2nd Ed.中)和利用ANN的非参数方法(学习矢量量子化(Learning Vector Quantization)-LVQ，例如描述于KohonenT.，(1986)Int.J.Quant.Chem.，Suppl.13，209-21中)以用于区分从具有LG和HG瘤变的组织部位的对应DOC所获得的DOP。对于贝叶斯和NN分类，针对前述光学参数的各种组合，以及针对选自总体样品的不同数目的训练集，LG和HG病变的总体区分性能高于75％。
在另一实施方案中，本发明包括一种用于通过对动态参数值以及显示该疾病存在的对应截止值作图以自动进行宫颈筛选的手段。
在又一实施方案中，本发明包括一种通过对动态参数值和显示该疾病存在的相应截止值作图进行半自动阴道镜检查的手段。这种方法确保基线阴道镜检查的性能与专业人员的技能无关，有助于整体诊断程序、随访和在活组织取样和治疗期间的引导。
本发明的另一方面包括通过与上皮的功能和结构变化相关的动态参数给出的醋酸白化现象的解释。在一个实施方案中，计算与宫颈结构性质相关的区别性参数，并与从同一组织部位记录的DOC获得的许多功能特征相关联。具体地，普遍一致认为在核体积和瘤变分级(HPV、CIN 1、CIN 2和CIN 3)或宫颈癌[Walker DC，et al.(2003)PhysiologicalMeasurement，24：1-15]之间有直接关联。表达上皮组织中核密度的核质比(NCR)是用于描述与某些诊断病症的这种关联的最常用参数。在一个优选实施方案中，通过找到前述动态参数中任一个或其组合与从对应宫颈位置提取的活组织检查材料计算的NCR之间的关联公式来评价组织的细胞结构。为此，在将醋酸引入组织区域中之后，将NCR与反映上皮功能异常的DOC参数进行关联。
在又一实施方案中，除了代表醋酸白化动力学特性并且突出高核密度的部位的图之外，这种关联能够导致提取出代表所检查宫颈组织每个位置处结构性质的伪彩图。如果想到通过定量从组织获得的体内光学曲线(代表宏观结构组织状态的体内评价)，还能够获得有关组织的细胞性能的直接结论(这构成在微观水平下关于其结构的代表性观点)，该执行还具有额外的价值。
为了对相应数目的上皮组织部位(通过本文公开的方法从其获得了动态参数)计算NCR，在阴道镜检查期间获得了相等数目的宫颈活组织检查样品。该活检组织经过标准程序处理、免疫组化染色并置于载玻片上用于通过显微镜图像分析来进一步评价。在获取等量的显微组织学图像之后，采用多级图像分析算法来分割图像中显示的细胞核[Loukas CG，et al.(2003)Cytometry，55A(1)：30-42]。用上皮中包封的核所占据的面积之和除以上皮组织的总面积来计算NCR的量。NCR也称为上皮组织的“细胞堆积”性能，主要代表组织的细胞群体的截面结构。
在一个示意性实施方案中，图10A和10B显示了对NCR表现出最强关联系数(R)的两个不同DOP的散点图。这些参数是如前文定义的动态光学曲线的“积分”和最大值(“最大值”)。图中的线代表线性回归曲线，而从实验数据的最小二乘法拟合获得的DOP到NCR变换方程和关联结果示于表3中。
表3

从该表可见，两个参数与组织的细胞堆积性能都表现出了显著的相关性。在所述方法的一个实施方案中，线性方程将与从特定组织部位获得的DOC对应的DOP变换成组织部位的NCR基本性质。
在所述方法的另一实施方案中，“积分”或“最大值”的定量伪彩图中的任一个都可以利用前述变换公式变换成上皮组织的NCR图。
除了与瘤变发展有关的上皮组织结构变化之外，在施用醋酸溶液之后在上皮的细胞外和细胞内空间中还存在几种功能变化。具体地，已知实体瘤在酸性微环境下存活[Webb SD，at al.(1999)J.Theor.Biol.，196：237-250；Lee AH，et al.(1998)Cancer Research，58：1901-1908；YamagataM et al.(1996)Br.J.Cancer，73：1328-1334；和Marion S，et al.(2000)Molecular Medicine Today，6：15-19]。此外，实验测量表明肿瘤中细胞外pH比正常组织平均低0.5个单位，肿瘤的细胞外pH通常在[6.6～7.0]的范围内(见[Yamagata M et al.(1996)Br.J.Cancer，73：1328-1334])。肿瘤细胞还具有中性或微碱性的细胞内pH[Marion S，et al.(2000)MolecularMedicine Today，6：15-19]。与正常细胞类似，肿瘤细胞在窄范围内调节它们的细胞质pH以提供有利于各种细胞内活动的环境。
尽管关于肿瘤中存在细胞外酸性pH的问题还存在争议，但是一般相信肿瘤的酸性环境起因于高的代谢酸(例如乳酸)生产率和效率低下的从细胞外空间的去除能力[Webb SD，at al.(1999)J.Theor.Biol.，196：237-250；Lee AH，et al.(1998)Cancer Research，58：1901-1908；Marion S，et al.(2000)Molecular Medicine Today，6：15-19；和Prescott DM，et al.(2000)Clinical Cancer Research，6；(6)：2501-2505]。此外，肿瘤细胞具有高的糖酵解速率，这与它们的供氧水平无关。因此，从细胞环境产生出大量的乳酸(以及H+)。由于诸如脉管系统紊乱或淋巴引流不良和间隙压力升高等许多因素，酸清除(H+清除)(到血液中)非常慢，由此在肿瘤细胞的细胞外和细胞内空间之间观察到反转的pH梯度[Webb SD，at al.(1999)J.Theor.Biol.，196：237-250；Lee AH，et al.(1998)Cancer Research，58：1901-1908；Yamagata M et al.(1996)Br.J.Cancer，73：1328-1334；和Marion S，et al.(2000)Molecular Medicine Today，6：15-19]。假设癌是过渡性过程且CIN是前癌，则也有理由认为CIN的细胞外环境也是酸性的(可能是较弱的酸性)。而且，已知肿瘤以及发育异常的细胞采用与正常细胞相同的短期[Marion S，et al.(2000)Molecular Medicine Today，6：15-19]和长期[Lee AH，et al.(1998)Cancer Research，58：1901-1908；Yamagata Met al.(1996)Br.J.Cancer，73：1328-1334和Prescott DM，et al.(2000)Clinical Cancer Research，6；(6)：2501-2505]的pH调节机制。肿瘤细胞代谢产生的过量质子经过特异性氢泵从细胞排泄掉[Prescott DM，et al.(2000)Clinical Cancer Research，6；(6)：2501-2505]。
在宫颈中观察的醋酸白化效应用于阴道镜检查术中来表征异常组织(即HPV、CIN或癌症)。醋酸白化效应是指将醋酸溶液施用到宫颈转化区所引发的现象。醋酸的施用选择性诱导异常宫颈区域的暂时变白。尽管它已经在临床实践中用于定位异常区域超过70年，但是组织变白所涉及的确切物理化学机制仍然是未知的。当采用甲酸、丙酸和丁酸作为生物标志物时观察到了类似的现象。
对解释醋酸白化效应的两种主要解释见于相关文献中。体外研究显示，醋酸效应与某些细胞角蛋白(上皮细胞中存在的蛋白质)的量有关[Maddox P，et al.(1999)Journal of Clinical Pathology，52：41-46和Carrilho C，et al.(2004)Human Pathology，35：546-551]。由于在宫颈瘤变中细胞外环境为酸性，所以局部施用的酸性酸分子没有分解成它的组成离子，并且因此可以被动穿过细胞膜。进入中性pH细胞质后，乙酸分子分解，释放出氢离子和羧酸离子，它们与核内蛋白相互作用，导致选择性改变异常细胞的散射特性。
细胞溶胶的pH值对于这些蛋白质的构象稳定至关重要。在中性pH值下，蛋白质在溶液中是稳定的。随着pH降低，它们变得不稳定和不溶(取决于其pI(等电点))。蛋白质失稳的过程称为变性，这种部分变性是可逆过程，它仅持续若干毫秒。变性或解折叠的蛋白质具有不同的折射率，因此这可能是白化效应的原因。正常细胞中的pH降低可能不足以引起蛋白质解折叠，或许这是在正常组织中未检测到IBSL中变化的原因。因此，反向散射光与宫颈上皮中的醋酸渗透所影响的pH动力学非常相关。然而，有助于该效应的蛋白质并不太确定。而且，这些蛋白质中的各种蛋白质可以在不同的pH值下变性。
根据另一种解释，醋酸对转化区上皮的作用与其浓度有关[MacLeanAB.(2004)Gynecologic Oncology，95：691-694]。醋酸进入发育异常层的细胞环境中，改变了不同核蛋白的结构，由此使细胞呈现出不透明。因此，反向散射光的动力学遵循醋酸浓度的动力学。在正常组织中没有出现白化的原因是核蛋白的量非常小。
基于以上对在瘤变发展期间经历变化的上皮的功能和结构特征的分析，可以将动态光学数据与具有诊断重要性的上皮特征关联起来。具体地，所测量的动态特征可用于将在施用生物标志物之后按时间顺序出现的各种上皮结构和运输现象分开，并将它们与体内可测量的光学参数关联起来，由此对该反问题提供解决方案。换言之，可以通过测量体内动态特征和参数来获得关于各种上皮特征的信息。
在所述方法的一个实施方案中，“斜度A”用于获得用于细胞外酸度的信息，并依次用于被动扩散常数以及复层上皮的细胞层数。在所述方法的另一实施方案中，“最大值”用于确定上皮的NCR，这是因为反向散射光的强度与信号源(细胞核)的密度成比例。在所述方法的另一实施方案中，“斜度B”用于获得与调节细胞内pH的细胞功能障碍、脉管系统紊乱的存在和与瘤变发展有关的淋巴引流不良有关的信息。在另一实施方案中，“积分”参数用于获得上述功能特征和结构特征的组合信息。
该生物物理模型的临床验证已经通过将NCR与前述“最大值”和“积分”参数相关联来进行。然而，功能特征的临床验证在临床上是行不通的，这是因为缺乏能够在体内测量这些特征的参考方法。相反，基于其记录、分析和显示在体内从与生物标志物相互作用的组织获得的动态光学特性的固有能力，本文所公开的方法能够来建模和预测组织的体内功能特征。
图12描述了本发明的另一示例性实施方案。计算设备1070执行在计算机可读介质上体现的指令，所述指令至少限定在图像处理引擎1085中示出的步骤，并且与用于获得组织图像数据的硬件设置联用。具体地，用光源1010连续照射组织1020。在通过施加器1030施用合适的生物标志物之后，提供触发信号来启动用图像获取设备1040(如视频CCD和其它合适的图像获取设备)获取图像。在组织1020和图像获取设备1040之间是滤光器1050和透镜1060，例如，可以插入一个或更多个可变焦透镜。滤光器1050可以调节至优选的光谱带，在该优选的光谱带下，在施用合适试剂之后，在其光学反射率或荧光特征经历不同级别变化的区域之间获得最大的对比度。
在施药之前，获得组织的图像作为参照。在施药之后，在预定的光谱带中、在预定时间段内按时间顺序获得一系列图像1080，并且存储在计算机设备1070内部或外部的记忆体(memory)或存储器中，用于由图像处理引擎1085进一步处理。在将一些或全部所获取的图像正确对齐之后，对与相同组织点对应的特定图像位置生成DOC1090。在步骤1100中，从DOC获得表示所述现象的动态特征的许多动态光学参数，1100。
在提取DOP之后，在步骤1110中，可以将它们的值与预定截止值比较，进而在步骤1120中将组织的各种病理状态分类。作为一种结果，然后可以将伪彩图1130显示在显示设备1140上，该伪彩图1130以不同的颜色或灰度代表不同的病理。作为替代，可以存储组织的各种病理状态的分类，以用于再次显示或通过例如信息包或适用于在网络环境下传输数据的其它合适单元发送到另一计算设备。
作为替代，在步骤1150中，可以利用预定的数学公式将DOP的值变换成表达组织的功能和结构特征。在该情况下，可以将伪彩图1130显示在显示设备1140上，其中以不同的颜色或灰度代表不同的功能和结构特征。
本申请全文所引用的全部文献、数字、专利和公开的专利申请通过引用并入本文。
本领域的技术人员将会承认，或仅利用常规实验就能够确定，本文所述的本发明具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案也将包括在所附权利要求的范围内。