用于T－A克隆的PG7X－T载体及其制备方法.pdf

本发明涉及用于T－A克隆的pG7X－T载体及其制备方法，属于重组DNA技术的载体构建领域，其技术方案是利用自行设计的引物对质粒pGEM7Zf(+)进行扩增，扩增产物经HindIII消化、自连、转化、筛选等过程，获得新质粒pG7X。相比pGEM7Zf(+)而言，pG7X增加了2个XcmI识别位点，可用于制备T－A克隆载体。用XcmI酶切后得到的两端带有3′dT粘性末端的DNA即为T载体，命名为pG7X－T。该T载体与带有dA末端DNA片段或PCR产物进行连接，阳性重组率达95％以上。利用本发明制备T载体的成本在60元/微克以下，仅为市场价格的十分之一，而且操作简便、性能稳定、重组率高。

1.  用于T-A克隆的pG7X-T载体及其制备方法，其特征在于，该载体DNA序列如下：
0001   GACTGGGGA TCCGGAGAGC TCCCAACGCG TTGGATGCAT AGCTTGAGTA TTCTATAGTG TCACCTAAAT AGCTTGGCGT AATCATGGTC
      TCTGACCCCT AGGCCTCTCG AGGGTTGCGC AACCTACGTA TCGAACTCAT AAGATATCAC AGTGGATTTA TCGAACCGCA TTAGTACCAG
0091  ATAGCTGTTT CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG TGTAAAGCCT GGGGTGCCTA
      TATCGACAAA GGACACACTT TAACAATAGG CGAGTGTTAA GGTGTGTTGT ATGCTCGGCC TTCGTATTTC ACATTTCGGA CCCCACGGAT
0181  ATGAGTGAGC TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC CAGCTGCATT AATGAATCGG
      TACTCACTCG ATTGAGTGTA ATTAACGCAA CGCGAGTGAC GGGCGAAAGG TCAGCCCTTT GGACAGCACG GTCGACGTAA TTACTTAGCC
0271  CCAACGCGCG GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG
      GGTTGCGCGC CCCTCTCCGC CAAACGCATA ACCCGCGAGA AGGCGAAGGA GCGAGTGACT GAGCGACGCG AGCCAGCAAG CCGACGCCGC
0361  AGCGGTATCA GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA
      TCGCCATAGT CGAGTGAGTT TCCGCCATTA TGCCAATAGG TGTCTTAGTC CCCTATTGCG TCCTTTCTTG TACACTCGTT TTCCGGTCGT
0451  AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCTCAAG
      TTTCCGGTCC TTGGCATTTT TCCGGCGCAA CGACCGCAAA AAGGTATCCG AGGCGGGGGG ACTGCTCGTA GTGTTTTTAG CTGCGAGTTC
0541  TCAGAGGTGG CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC TCTCCTGTTC CGACCCTGCC
      AGTCTCCACC GCTTTGGGCT GTCCTGATAT TTCTATGGTC CGCAAAGGGG GACCTTCGAG GGAGCACGCG AGAGGACAAG GCTGGGACGG
0631  GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGT
      CGAATGGCCT ATGGACAGGC GGAAAGAGGG AAGCCCTTCG CACCGCGAAA GAGTATCGAG TGCGACATCC ATAGAGTCAA GCCACATCCA
0721  CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCC
      GCAAGCGAGG TTCGACCCGA CACACGTGCT TGGGGGGCAA GTCGGGCTGG CGACGCGGAA TAGGCCATTG ATAGCAGAAC TCAGGTTGGG
0811  GGTAAGACAC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA
      CCATTCTGTG CTGAATAGCG GTGACCGTCG TCGGTGACCA TTGTCCTAAT CGTCTCGCTC CATACATCCG CCACGATGTC TCAAGAACTT
0901  GTGGTGGCCT AACTACGGCT ACACTAGAAG AACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG
      CACCACCGGA TTGATGCCGA TGTGATCTTC TTGTCATAAA CCATAGACGC GAGACGACTT CGGTCAATGG AAGCCTTTTT CTCAACCATC
0991  CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC AGAAAAAAAG GATCTCAAGA
      GAGAACTAGG CCGTTTGTTT GGTGGCGACC ATCGCCACCA AAAAAACAAA CGTTCGTCGT CTAATGCGCG TCTTTTTTTC CTAGAGTTCT
1081  AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC ATGAGATTAT CAAAAAGGAT
      TCTAGGAAAC TAGAAAAGAT GCCCCAGACT GCGAGTCACC TTGCTTTTGA GTGCAATTCC CTAAAACCAG TACTCTAATA GTTTTTCCTA
1171  CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATGCTT
      GAAGTGGATC TAGGAAAATT TAATTTTTAC TTCAAAATTT AGTTAGATTT CATATATACT CATTTGAACC AGACTGTCAA TGGTTACGAA
1261  AATCAGTGAG GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT CCCCGTCGTG TAGATAACTA CGATACGGGA
      TTAGTCACTC CGTGGATAGA GTCGCTAGAC AGATAAAGCA AGTAGGTATC AACGGACTGA GGGGCAGCAC ATCTATTGAT GCTATGCCCT
1351  GGGCTTACCA TCTGGCCCCA GTGCTGCAAT GATACCGCGA GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA GCAATAAACC AGCCAGCCGG
      CCCGAATGGT AGACCGGGGT CACGACGTTA CTATGGCGCT CTGGGTGCGA GTGGCCGAGG TCTAAATAGT CGTTATTTGG TCGGTCGGCC
1441  AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA GCTAGAGTAA GTAGTTCGCC
      TTCCCGGCTC GCGTCTTCAC CAGGACGTTG AAATAGGCGG AGGTAGGTCA GATAATTAAC AACGGCCCTT CGATCTCATT CATCAAGCGG
1531  AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTACAGGC ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTTC
      TCAATTATCA AACGCGTTGC AACAACGGTA ACGATGTCCG TAGCACCACA GTGCGAGCAG CAAACCATAC CGAAGTAAGT CGAGGCCAAG
1621  CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT
      GGTTGCTAGT TCCGCTCAAT GTACTAGGGG GTACAACACG TTTTTTCGCC AATCGAGGAA GCCAGGAGGC TAGCAACAGT CTTCATTCAA
1711  GGCCGCAGTG TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGA
      CCGGCGTCAC AATAGTGAGT ACCAATACCG TCGTGACGTA TTAAGAGAAT GACAGTACGG TAGGCATTCT ACGAAAAGAC ACTGACCACT
1801  GTACTCAACC AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC GTCAATACGG GATAATACCG CGCCACATAG
      CATGAGTTGG TTCAGTAAGA CTCTTATCAC ATACGCCGCT GGCTCAACGA GAACGGGCCG CAGTTATGCC CTATTATGGC GCGGTGTATC
1891  CAGAACTTTA AAAGTGCTCA TCATTGGAAA ACGTTCTTCG GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG TTGAGATCCA GTTCGATGTA
      GTCTTGAAAT TTTCACGAGT AGTAACCTTT TGCAAGAAGC CCCGCTTTTG AGAGTTCCTA GAATGGCGAC AACTCTAGGT CAAGCTACAT
1981  ACCCACTCGT GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA GGAAGGCAAA ATGCCGCAAA
      TGGGTGAGCA CGTGGGTTGA CTAGAAGTCG TAGAAAATGA AAGTGGTCGC AAAGACCCAC TCGTTTTTGT CCTTCCGTTT TACGGCGTTT
2071  AAAGGGAATA AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT ATTGTCTCAT
      TTTCCCTTAT TCCCGCTGTG CCTTTACAAC TTATGAGTAT GAGAAGGAAA AAGTTATAAT AACTTCGTAA ATAGTCCCAA TAACAGAGTA
2161  GAGCGGATAC ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTTC CGCGCACATT TCCCCGAAAA GTGCCACCTG ATGCGGTGTG
      CTCGCCTATG TATAAACTTA CATAAATCTT TTTATTTGTT TATCCCCAAG GCGCGTGTAA AGGGGCTTTT CACGGTGGAC TACGCCACAC
2251  AAATACCGCA CAGATGCGTA AGGAGAAAAT ACCGCATCAG GAAATTGTAA GCGTTAATAT TTTGTTAAAA TTCGCGTTAA ATTTTTGTTA
      TTTATGGCGT GTCTACGCAT TCCTCTTTTA TGGCGTAGTC CTTTAACATT CGCAATTATA AAACAATTTT AAGCGCAATT TAAAAACAAT
2341 AATCAGCTCA TTTTTTAACC AATAGGCCGA AATCGGCAAA ATCCCTTATA AATCAAAAGA ATAGACCGAG ATAGGGTTGA GTGTTGTTCC
     TTAGTCGAGT AAAAAATTGG TTATCCGGCT TTAGCCGTTT TAGGGAATAT TTAGTTTTCT TATCTGGCTC TATCCCAACT CACAACAAGG
2431 AGTTTGGAAC AAGAGTCCAC TATTAAAGAA CGTGGACTCC AACGTCAAAG GGCGAAAAAC CGTCTATCAG GGCGATGGCC CACTACGTGA
     TCAAACCTTG TTCTCAGGTG ATAATTTCTT GCACCTGAGG TTGCAGTTTC CCGCTTTTTG GCAGATAGTC CCGCTACCGG GTGATGCACT
2521 ACCATCACCC TAATCAAGTT TTTTGGGGTC GAGGTGCCGT AAAGCACTAA ATCGGAACCC TAAAGGGAGC CCCCGATTTA GAGCTTGACG
     TGGTAGTGGG ATTAGTTCAA AAAACCCCAG CTCCACGGCA TTTCGTGATT TAGCCTTGGG ATTTCCCTCG GGGGCTAAAT CTCGAACTGC
2611 GGGAAAGCCG GCGAACGTGG CGAGAAAGGA AGGGAAGAAA GCGAAAGGAG CGGGCGCTAG GGCGCTGGCA AGTGTAGCGG TCACGCTGCG
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2701 CGTAACCACC ACACCCGCCG CGCTTAATGC GCCGCTACAG GGCGCGTCCA TTCGCCATTC AGGCTGCGCA ACTGTTGGGA AGGGCGATCG
     GCATTGGTGG TGTGGGCGGC GCGAATTACG CGGCGATGTC CCGCGCAGGT AAGCGGTAAG TCCGACGCGT TGACAACCCT TCCCGCTAGC
2791 GTGCGGGCCT CTTCGCTATT ACGCCAGCTG GCGAAAGGGG GATGTGCTGC AAGGCGATTA AGTTGGGTAA CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA
     CACGCCCGGA GAAGCGATAA TGCGGTCGAC CGCTTTCCCC CTACACGACG TTCCGCTAAT TCAACCCATT GCGGTCCCAA AAGGGTCAGT
2881 CGACGTTGTA AAACGACGGC CAGTGAATTG TAATACGACT CACTATAGGG CGAATTGGGC CCGACGTCGC ATGCTCCTCT AGACTCGAGG
     GCTGCAACAT TTTGCTGCCG GTCACTTAAC ATTATGCTGA GTGATATCCC GCTTAACCCG GGCTGCAGCG TACGAGGAGA TCTGAGCTCC
2971 AATTCGGTAC CCCAGGTCT
     TTAAGCCATG GGGTCCAG

2.  根据权利要求1所述的用于T-A克隆的pG7X-T载体及其制备方法，其特征在于，根据质粒pGEM7Zf(+)的序列，设计了一对PCR引物——pG7X-F2和pG7X-R2，其序列如下：
pG7X-F2：gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctccca
pG7X-R2：gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt

3.  根据权利要求2所述的用于T-A克隆的pG7X-T载体及其制备方法，其特征在于，两条引物的5′-端分别插入限制性内切酶HindIII和XcmI识别位点，其位点分别用单线和波线标示如下：
pG7X-F2：gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctccca
pG7X-R2：gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt

4.  根据权利要求1所述的用于T-A克隆的pG7X-T载体及其制备方法，其特征在于，以pGEM7Zf(+)DNA为模板、pG7X-F2和pG7X-R2为引物构建的新质粒，命名为pG7X，其步骤和方法如下：
1)质粒pGEM7Zf(+)的PCR扩增及HindIII酶切
2)HindIII酶切产物的环化
3)连接DNA转化大肠杆菌
4)菌落的PCR筛选
5)阳性菌的进一步筛选和鉴定
6)用限制性内切酶SmaI和XcmI酶切鉴定
7)质粒pG7X序列测定

5.  根据权利要求1所述的用于T-A克隆的pG7X-T载体及其制备方法，其特征在于，用XcmI酶切质粒pG7X制备的T载体，命名为pG7X-T，其制备方法如下：

12.  5单位的XcmI酶、5微升的缓冲液N，1微克的pG7X DNA，补水至50微升，37℃酶切过夜后0.7％琼脂糖凝胶电泳回收大片段。

6.  根据权利要求5所述的用于T-A克隆的pG7X-T载体及其制备方法，其特征在于，T载体pG7X-T的使用方法如下：
将制备的T载体pG7X-T与带有dA尾的DNA片段按摩尔比1∶3混合，加入T4DNA连接酶，于12℃连接；用标准的氯化钙处理法将连接物转化进感受态细胞E.coli DH5α，然后涂于含50微克/毫升氨苄青霉素，表面均匀地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩尔/升的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培养16小时，白色菌落含有由pG7X-T与插入DNA形成的重组质粒。

7.  根据权利要求5所述的用于T-A克隆的pG7X-T载体及其制备方法，其特征在于，T载体pG7X-T在分子生物学技术、基因芯片技术、生物工程和医学领域的应用。

用于T-A克隆的pG7X-T载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及质粒载体的构建，具体地讲，是将质粒pG7X改造成线性化以后带有dT末端，使之成为能克隆PCR产物和含有dA末端DNA片段的T载体。
背景技术
在分子生物学和基因工程研究中，PCR是一项广泛用于体外扩增特异DNA片段的基本技术，而将PCR产物成功地克隆到特定载体并进行转化和表达，是目前研究基因或DNA片段的必经之路。为了解决这一问题，近年来发展了T-A克隆技术，即利用Taq DNA聚合酶非模板依赖型末端转移酶活性，能在PCR产物的3′端加上一个dA的特点，使PCR产物与具有一个3′dT突出末端的T载体连接，然后转化受体细胞，使PCR产物得到高效快速克隆。这项技术有效地克服了传统克隆技术很多固有的缺点，如载体容易自连，克隆效率低，筛选阳性克隆难度大，实验费用高等。其中快速、简便、经济地制备T载体成为有效利用该克隆技术的关键之一。
目前T载体售价大多偏高，如1微克的Promega公司的pGEM-T载体和pGEM-T Easy载体的售价分别在700元和800元左右，1微克的TaKaRa公司的pMD18-T载体的售价在500元左右。国内几家公司开发的产品，售价也在200元以上，而且存在连接效率低、连接不稳定等缺陷。因此制备高质量、稳定、价廉的T载体是广大分子生物学研究者关心的问题，也是生物试剂厂商感兴趣的业务之一。
目前T载体的构建方法主要有两种：第一种方法是用产生平末端的限制性内切酶(如EcoRV)在质粒DNA多克隆位点处切开，利用Taq DNA聚合酶非模板扩增特性在线性质粒两条链的3′端添加dT制成T载体(Harwood A J.Methods in Molecular Biology.Human Press，1994，31：19-33；奥斯伯·布伦特等主编，颜子颖、王海林译，精编分子生物学实验指南，第3版，科学出版社，1998，616-618)，如Promega和TaKaRa公司的产品，以及国内几家公司的产品。该方法存在很多缺点，如载体平末端加dT效率低，而且连接不稳定，载体在克隆过程中自身环化率较高，必然增加筛选阳性克隆的难度。此外，用该方法生产的T载体产量有限，不适合大规模生产，还容易造成批次间质量差异大，在普及上存在一定困难(陆哲明，柯杨.北京大学学报[医学版]，2002，34(6)：726-728)。
第二种方法是在质粒的多克隆位点引入特殊序列，利用限制性内切酶(如XcmI、AspEI、HphI等)酶切即可直接产生T载体(Jooyeun C，William B，Srinivasn C.Gene，1993，136：369-370；Ichihara Y，Kurosawa Y.Gene，1993，130：153-154；Schutte B C，Ranade K，Pruessner J，et al.BioTechniques，1997，22：40-44)。该方法虽然成本稍高(原因是所使用的限制性内切酶价格较高)，但制备更快捷(只需酶切，回收片段即是稳定的T载体，不必额外进行加尾反应)，更高效(通过酶切反应在3′端产生单个T突出末端更彻底)，更稳定(通过酶切加尾更容易，产品性能稳定)，产品的质量检测指标更直观可靠(只需要跑琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分)。因此，限制性内切酶法以其简便、快速、稳定、实用的优点，在T载体构建领域中具有良好的应用前景。
发明内容
针对上述情况，本发明在不影响质粒编码的β-半乳糖苷酶活力的情况下，改造Promega公司的商品质粒pGEM7Zf(+)，通过PCR扩增在质粒中增加有用的酶切位点，产生新质粒pG7X，该质粒经过限制性内切酶XcmI消化以后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收的2989碱基对DNA片段，即是含有3′dT粘性末端、可用于PCR产物和其它带有dA末端DNA片段克隆的T载体，命名为pG7X-T。这种T载体具有稳定的3′dT粘性末端、连接效率高、制备简便等优点，克服了商品化T-A克隆系统售价高、批次间质量不稳定以及无法进行循环使用等缺点。
本发明用于T-A克隆的pG7X-T载体DNA序列如下：
0001  GACTGGGGA TCCGGAGAGC TCCCAACGCG TTGGATGCAT AGCTTGAGTA TTCTATAGTG TCACCTAAAT AGCTTGGCGT AATCATGGTC
     TCTGACCCCT AGGCCTCTCG AGGGTTGCGC AACCTACGTA TCGAACTCAT AAGATATCAC AGTGGATTTA TCGAACCGCA TTAGTACCAG
0091 ATAGCTGTTT CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG TGTAAAGCCT GGGGTGCCTA
     TATCGACAAA GGACACACTT TAACAATAGG CGAGTGTTAA GGTGTGTTGT ATGCTCGGCC TTCGTATTTC ACATTTCGGA CCCCACGGAT
0181 ATGAGTGAGC TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC CAGCTGCATT AATGAATCGG
     TACTCACTCG ATTGAGTGTA ATTAACGCAA CGCGAGTGAC GGGCGAAAGG TCAGCCCTTT GGACAGCACG GTCGACGTAA TTACTTAGCC
0271 CCAACGCGCG GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG
     GGTTGCGCGC CCCTCTCCGC CAAACGCATA ACCCGCGAGA AGGCGAAGGA GCGAGTGACT GAGCGACGCG AGCCAGCAAG CCGACGCCGC
0361 AGCGGTATCA GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA
     TCGCCATAGT CGAGTGAGTT TCCGCCATTA TGCCAATAGG TGTCTTAGTC CCCTATTGCG TCCTTTCTTG TACACTCGTT TTCCGGTCGT
0451 AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCTCAAG
     TTTCCGGTCC TTGGCATTTT TCCGGCGCAA CGACCGCAAA AAGGTATCCG AGGCGGGGGG ACTGCTCGTA GTGTTTTTAG CTGCGAGTTC
0541 TCAGAGGTGG CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC TCTCCTGTTC CGACCCTGCC
     AGTCTCCACC GCTTTGGGCT GTCCTGATAT TTCTATGGTC CGCAAAGGGG GACCTTCGAG GGAGCACGCG AGAGGACAAG GCTGGGACGG
0631 GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGT
     CGAATGGCCT ATGGACAGGC GGAAAGAGGG AAGCCCTTCG CACCGCGAAA GAGTATCGAG TGCGACATCC ATAGAGTCAA GCCACATCCA
0721 CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCC
     GCAAGCGAGG TTCGACCCGA CACACGTGCT TGGGGGGCAA GTCGGGCTGG CGACGCGGAA TAGGCCATTG ATAGCAGAAC TCAGGTTGGG
0811 GGTAAGACAC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA
     CCATTCTGTG CTGAATAGCG GTGACCGTCG TCGGTGACCA TTGTCCTAAT CGTCTCGCTC CATACATCCG CCACGATGTC TCAAGAACTT
0901 GTGGTGGCCT AACTACGGCT ACACTAGAAG AACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG
     CACCACCGGA TTGATGCCGA TGTGATCTTC TTGTCATAAA CCATAGACGC GAGACGACTT CGGTCAATGG AAGCCTTTTT CTCAACCATC
0991 CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC AGAAAAAAAG GATCTCAAGA
     GAGAACTAGG CCGTTTGTTT GGTGGCGACC ATCGCCACCA AAAAAACAAA CGTTCGTCGT CTAATGCGCG TCTTTTTTTC CTAGAGTTCT
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1441 AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA GCTAGAGTAA GTAGTTCGCC
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1531 AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTACAGGC ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTTC
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1621 CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT
     GGTTGCTAGT TCCGCTCAAT GTACTAGGGG GTACAACACG TTTTTTCGCC AATCGAGGAA GCCAGGAGGC TAGCAACAGT CTTCATTCAA
1711 GGCCGCAGTG TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGA
     CCGGCGTCAC AATAGTGAGT ACCAATACCG TCGTGACGTA TTAAGAGAAT GACAGTACGG TAGGCATTCT ACGAAAAGAC ACTGACCACT
1801  GTACTCAACC AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC GTCAATACGG GATAATACCG CGCCACATAG
      CATGAGTTGG TTCAGTAAGA CTCTTATCAC ATACGCCGCT GGCTCAACGA GAACGGGCCG CAGTTATGCC CTATTATGGC GCGGTGTATC
1891  CAGAACTTTA AAAGTGCTCA TCATTGGAAA ACGTTCTTCG GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG TTGAGATCCA GTTCGATGTA
      GTCTTGAAAT TTTCACGAGT AGTAACCTTT TGCAAGAAGC CCCGCTTTTG AGAGTTCCTA GAATGGCGAC AACTCTAGGT CAAGCTACAT
1981  ACCCACTCGT GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA GGAAGGCAAA ATGCCGCAAA
      TGGGTGAGCA CGTGGGTTGA CTAGAAGTCG TAGAAAATGA AAGTGGTCGC AAAGACCCAC TCGTTTTTGT CCTTCCGTTT TACGGCGTTT
2071  AAAGGGAATA AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT ATTGTCTCAT
      TTTCCCTTAT TCCCGCTGTG CCTTTACAAC TTATGAGTAT GAGAAGGAAA AAGTTATAAT AACTTCGTAA ATAGTCCCAA TAACAGAGTA
2161  GAGCGGATAC ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTTC CGCGCACATT TCCCCGAAAA GTGCCACCTG ATGCGGTGTG
      CTCGCCTATG TATAAACTTA CATAAATCTT TTTATTTGTT TATCCCCAAG GCGCGTGTAA AGGGGCTTTT CACGGTGGAC TACGCCACAC
2251  AAATACCGCA CAGATGCGTA AGGAGAAAAT ACCGCATCAG GAAATTGTAA GCGTTAATAT TTTGTTAAAA TTCGCGTTAA ATTTTTGTTA
      TTTATGGCGT GTCTACGCAT TCCTCTTTTA TGGCGTAGTC CTTTAACATT CGCAATTATA AAACAATTTT AAGCGCAATT TAAAAACAAT
2341  AATCAGCTCA TTTTTTAACC AATAGGCCGA AATCGGCAAA ATCCCTTATA AATCAAAAGA ATAGACCGAG ATAGGGTTGA GTGTTGTTCC
      TTAGTCGAGT AAAAAATTGG TTATCCGGCT TTAGCCGTTT TAGGGAATAT TTAGTTTTCT TATCTGGCTC TATCCCAACT CACAACAAGG
2431  AGTTTGGAAC AAGAGTCCAC TATTAAAGAA CGTGGACTCC AACGTCAAAG GGCGAAAAAC CGTCTATCAG GGCGATGGCC CACTACGTGA
      TCAAACCTTG TTCTCAGGTG ATAATTTCTT GCACCTGAGG TTGCAGTTTC CCGCTTTTTG GCAGATAGTC CCGCTACCGG GTGATGCACT
2521  ACCATCACCC TAATCAAGTT TTTTGGGGTC GAGGTGCCGT AAAGCACTAA ATCGGAACCC TAAAGGGAGC CCCCGATTTA GAGCTTGACG
      TGGTAGTGGG ATTAGTTCAA AAAACCCCAG CTCCACGGCA TTTCGTGATT TAGCCTTGGG ATTTCCCTCG GGGGCTAAAT CTCGAACTGC
2611  GGGAAAGCCG GCGAACGTGG CGAGAAAGGA AGGGAAGAAA GCGAAAGGAG CGGGCGCTAG GGCGCTGGCA AGTGTAGCGG TCACGCTGCG
      CCCTTTCGGC CGCTTGCACC GCTCTTTCCT TCCCTTCTTT CGCTTTCCTC GCCCGCGATC CCGCGACCGT TCACATCGCC AGTGCGACGC
2701  CGTAACCACC ACACCCGCCG CGCTTAATGC GCCGCTACAG GGCGCGTCCA TTCGCCATTC AGGCTGCGCA ACTGTTGGGA AGGGCGATCG
      GCATTGGTGG TGTGGGCGGC GCGAATTACG CGGCGATGTC CCGCGCAGGT AAGCGGTAAG TCCGACGCGT TGACAACCCT TCCCGCTAGC
2791  GTGCGGGCCT CTTCGCTATT ACGCCAGCTG GCGAAAGGGG GATGTGCTGC AAGGCGATTA AGTTGGGTAA CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA
      CACGCCCGGA GAAGCGATAA TGCGGTCGAC CGCTTTCCCC CTACACGACG TTCCGCTAAT TCAACCCATT GCGGTCCCAA AAGGGTCAGT
2881  CGACGTTGTA AAACGACGGC CAGTGAATTG TAATACGACT CACTATAGGG CGAATTGGGC CCGACGTCGC ATGCTCCTCT AGACTCGAGG
      GCTGCAACAT TTTGCTGCCG GTCACTTAAC ATTATGCTGA GTGATATCCC GCTTAACCCG GGCTGCAGCG TACGAGGAGA TCTGAGCTCC
2971  AATTCGGTAC CCCAGGTCT
      TTAAGCCATG GGGTCCAG
本发明根据Promega公司的质粒pGEM7Zf(+)的序列，设计了一对PCR引物--pG7X-F2和pG7X-R2，其序列如下：
pG7X-F2：gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctccca
pG7X-R2：gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt
本发明还包括两条引物的5′-端分别插入限制性内切酶HindIII和XcmI识别位点，其位点分别用单线和波线标示如下：
pG7X-F2：gaataagcttgttccccaggtcaagatggggatccggagagctccca
pG7X-R2：gaacaagcttattcccagcaagacctggggtaccgaattcctcgagt
以pGEM7Zf(+)DNA为模板、pG7X-F2和pG7X-R2为引物构建的新质粒，命名为pG7X，其步骤和方法如下：
1.质粒pGEM7Zf(+)的PCR扩增及HindIII酶切
根据pGEM7Zf(+)序列(图1)设计一对引物pG7X-F2和pG7X-R2，引物的5′端分别插入HindIII(单线处)和XcmI(波线处)识别位点。引物序列为：
pG7X-F2：gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctccca
pG7X-R2：gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt
以质粒pGEM7Zf(+)DNA为模板，pG7X-F2和pG7X-R2为引物，在大连宝生物有限公司的Ex Taq DNA聚合酶作用下进行扩增反应。20微升扩增体系中，含6皮摩尔的pG7X-F2，6皮摩尔的pG7X-R2，5纳克的pGEM7Zf(+)，0.5单位的Ex TaqDNA聚合酶，2.0微升的Ex-缓冲液，1.6微升的dNTPs(每种dNTP的浓度为2.5毫摩尔/升)；反应循环为：94℃下预热5分钟后，经35个反应循环(94℃40秒，60℃32秒，72℃200秒)，然后在72℃下保温7分钟，最后保存在4℃。大约3千碱基对的扩增产物(图2)经0.7％琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，置于37℃进行HindIII酶切。酶切体系为：2.8微克的PCR产物，23微升的缓冲液，120单位的HindIII，补水至230微升。酶切产物通过0.7％琼脂糖凝胶电泳回收大片段DNA。
2.HindIII酶切产物的环化
回收的DNA酶切片段加入到含T4 DNA连接酶的溶液中，12℃保温过夜，进行连接，实现自身环化。10微升连接体系为：240纳克的DNA片段，1微升的缓冲液，350单位的T4DNA连接酶。
3.连接DNA转化大肠杆菌
用标准的氯化钙处理法制备E.coli DH5α感受态细胞，将连接物转化进感受态细胞E.coliDH5α，然后涂于含50微克/毫升氨苄青霉素，表面均匀地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩尔/升的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培养16小时后，选取蓝色菌落。
4.菌落的PCR筛选
随机挑选一定数目的蓝色菌落，以pG7X-F2/pG7X-R2为引物进行菌落PCR。15微升扩增体系中，含4.5皮摩尔的pG7X-F2，4.5皮摩尔的pG7X-R2，0.5单位的rTaq DNA聚合酶，1.5微升的rTaq-缓冲液、1.2微升地dNTPs(每种dNTP的浓度为2.5毫摩尔/升)。反应循环为：94℃预热10分钟后，经35个反应循环(94℃ 40秒，60℃ 32秒，72℃ 200秒)，然后在72℃下保温7分钟，最后保存在4℃，通过琼脂糖电泳筛选含有3千碱基对扩增产物的阳性菌落。
5.阳性菌的进一步筛选和鉴定
将上一步筛选得到的阳性菌分别划线挑选单菌落，接种于10毫升含50微克/毫升氨苄青霉素的液体LB培养基中过夜培养，用标准的碱裂解法提取其质粒DNA，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测。然后对质粒DNA进行PCR鉴定，方法同步骤4。
6.用限制性内切酶SmaI和XcmI酶切鉴定
上一步提取的质粒DNA进行酶切和琼脂糖凝胶电泳，应产生3千碱基对DNA片段，见图3：M为DNA分子量标准物：λ-EcoT14I digest，1、2、3及4为不同的克隆。酶切体系：(1)5单位的SmaI酶，1微升的牛血清白蛋白，1微升的缓冲液T，200纳克的DNA，补水至10微升，30℃酶切过夜；(2)2.5单位的XcmI酶、1微升的缓冲液N，200纳克的DNA，补水至10微升，37℃酶切过夜。SmaI购自大连宝生物公司，XcmI购自NEB公司。通过上述方法鉴定的质粒命名为pG7X。
7.质粒pG7X序列测定
3018碱基对的质粒pG7X的测序结果见图4，其多克隆位点的序列见图5。
本发明构建的质粒pG7X具有如下特点：
1)pG7X保留了pGEM7Zf(+)的氨苄青霉素抗性基因，便于用氨苄青霉素对重组体进行筛选(见图1)。
2)pG7X保留了pGEM7Zf(+)的高拷贝特性(见图1)，有利于从大肠杆菌中提取大量质粒DNA。
3)pG7X大小仅为3018碱基对(见图4)，比较小，便于进行DNA操作。
4)pG7X的多克隆位点两侧有T7、SP6、M13通用序列(见图4)，因此，对在多克隆位点插入的外源DNA进行序列测定有广泛的通用引物供选择。
5)pG7X的lacZ基因长度虽增加到384碱基对，但读码框架没有改变(见图4)，不改变应用5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷对重组体进行蓝白斑筛选的特性。
6)pG7X保留了pGEM7Zf(+)多克隆位点的大部分酶切识别序列，便于与多种限制性内切酶酶切片段实现连接。与pGEM7Zf(+)相比，少了SmaI位点，多了2个XcmI位点(见图5)。
7)pG7X保留了pGEM7Zf(+)的T7、SP6启动子元件，且这些元件位于多克隆位点两侧(见图1)，因此可正反两方向体外转录目的基因。
8)XcmI是一稀有限制性内切酶，其识别序列为CCANNNNN*NNNNTGGG，中间9个核苷酸对XcmI的酶切特异性及酶切效率没有影响。pG7X在pGEM7Zf(+)多克隆位点里插入了2个XcmI识别序列，因此可方便地用XcmI酶切以获取两端都是3′dT粘性末端的DNA片段(见图6)，所以，可方便地获得稳定的T载体。
用XcmI酶切质粒pG7X制备的T载体，命名为pG7X-T，其制备方法如下：
用XcmI酶切pG7X质粒，0.7％琼脂糖凝胶电泳回收大片段，即为T载体，命名为pG7X-T(图6)。酶切体系参照步骤6，但体积增大到50微升。
T载体pG7X-T的使用方法如下：
将制备的T载体pG7X-T与带有dA尾的DNA片段按摩尔比1∶3混合，加入T4 DNA连接酶，于12℃连接；用标准的氯化钙处理法将连接物转化进感受态细胞E.coli DH5α，然后涂于含50微克/毫升氨苄青霉素，表面均匀地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩尔/升的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培养16小时，白色菌落含有由pG7X-T与插入DNA形成的重组质粒。
载体pG7X-T可以在分子生物学技术、基因芯片技术、生物工程和医学等领域中广泛应用。
本发明的有益效果是：利用本发明制备T载体的成本在60元/微克以下，仅为市场价格的十分之一，而且操作简便、性能稳定、重组率高，既适合研究室内自制，也可应用于商业生产。
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
附图说明
图1质粒pGEM7Zf(+)图谱
图2 pGEM7Zf(+)的PCR扩增
图3左图为质粒pG7X的SmaI酶切结果，右图为pG7X的XcmI酶切结果。
图4质粒pG7X的全长序列
图5质粒pG7X多克隆位点的DNA序列
图6利用pG7X产生T载体示意图
具体实施方式
实施例一：T载体pG7X-T的制备
1.质粒pGEM7Zf(+)的PCR扩增及HindIII酶切
根据pGEM7Zf(+)序列(图1)设计一对引物pG7X-F2和pG7X-R2，引物的5′端分别插入HindIII(单线处)和XcmI(波线处)识别位点。引物序列为：
pG7X-F2：gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctccca
pG7X-R2：gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt
以质粒pGEM7Zf(+)DNA为模板，pG7X-F2和pG7X-R2为引物，在大连宝生物有限公司的Ex Taq DNA聚合酶作用下进行扩增反应。20微升扩增体系中，含6皮摩尔的pG7X-F2，6皮摩尔的pG7X-R2，5纳克的pGEM7Zf(+)，0.5单位的Ex TaqDNA聚合酶，2.0微升的Ex-缓冲液，1.6微升的dNTPs(每种dNTP的浓度为2.5毫摩尔/升)；反应循环为：94℃下预热5分钟后，经35个反应循环(94℃ 40秒，60℃ 32秒，72℃ 200秒)，然后在72℃下保温7分钟，最后保存在4℃。大约3千碱基对的扩增产物(图2)经0.7％琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，置于37℃进行HindIII酶切。酶切体系为：2.8微克的PCR产物，23微升的缓冲液，120单位的HindIII，补水至230微升。酶切产物通过0.7％琼脂糖凝胶电泳回收大片段DNA。
2.HindIII酶切产物的环化
回收的DNA酶切片段加入到含T4 DNA连接酶的溶液中，12℃保温过夜，进行连接，实现自身环化。10微升连接体系为：240纳克的DNA片段，1微升的缓冲液，350单位的T4DNA连接酶。
3.连接DNA转化大肠杆菌
用标准的氯化钙处理法制备E.coli DH5α感受态细胞，将连接物转化进感受态细胞E.coliDH5α，然后涂于含50微克/毫升氨苄青霉素，表面均匀地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩尔/升的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培养16小时后，选取蓝色菌落。
4.菌落的PCR筛选
随机挑选一定数目的蓝色菌落，以pG7X-F2/pG7X-R2为引物进行菌落PCR。15微升扩增体系中，含4.5皮摩尔的pG7X-F2，4.5皮摩尔的pG7X-R2，0.5单位的rTaq DNA聚合酶，1.5微升的rTaq-缓冲液、1.2微升的dNTPs(每种dNTP的浓度为2.5毫摩尔/升)。反应循环为：94℃预热10分钟后，经35个反应循环(94℃ 40秒，60℃ 32秒，72℃ 200秒)，然后在72℃下保温7分钟，最后保存在4℃，通过琼脂糖电泳筛选含有3千碱基对扩增产物的阳性菌落。
5.阳性菌的进一步筛选和鉴定
将上一步筛选得到的阳性菌分别划线挑选单菌落，接种于10毫升含50微克/毫升氨苄青霉素的液体LB培养基中过夜培养，用标准的碱裂解法提取其质粒DNA，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测。然后对质粒DNA进行PCR鉴定，方法同步骤4。
6.用限制性内切酶SmaI和XcmI酶切鉴定
上一步提取的质粒DNA进行酶切和琼脂糖凝胶电泳，应产生3千碱基对DNA片段，见图3：M为DNA分子量标准物：λ-EcoT14I digest，1、2、3及4为不同的克隆。酶切体系：(1)5单位的SmaI酶，1微升的牛血清白蛋白，1微升的缓冲液T，200纳克的DNA，补水至10微升，30℃酶切过夜；(2)2.5单位的XcmI酶、1微升的缓冲液N，200纳克的DNA，补水至10微升，37℃酶切过夜。SmaI购自大连宝生物公司，XcmI购自NEB公司。通过上述方法鉴定的质粒命名为pG7X。
7.质粒pG7X序列测定
3018碱基对的质粒pG7X的测序结果见图4，其多克隆位点的序列见图5。
8.XcmI酶切制备T载体
用XcmI酶切pG7X质粒，0.7％琼脂糖凝胶电泳回收大片段，即为T载体，命名为pG7X-T。见图6。酶切体系参照步骤6，但体积增大到50微升。
实施例二：T载体pG7X-T的性能检验
将制备的T载体pG7X-T与带有dA尾的插入DNA(Control Insert DNA，购自大连宝生物公司)按1∶3的摩尔比混合，加入T4 DNA连接酶，于12℃连接。用标准的氯化钙处理法将连接物转化进感受态细胞E.coli DH5α，然后涂于含50微克/毫升氨苄青霉素，表面均匀地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩尔/升的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培养16小时，白色菌落含有由pG7X与插入DNA形成的重组质粒，蓝色菌落中的质粒不含有插入DNA。统计菌落数，计算白斑率。实验结果表明，白斑率平均为94.4％。
实施例三：T载体pG7X-T的应用
用实施例二中筛选到的、白斑率最高的阳性菌株提取质粒DNA，用限制性内切酶XcmI酶切，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳回收大片段，即为所需T载体pG7X-T。T载体pG7X-T与PCR扩增的谷胱甘肽巯基转移酶Zeta类基因——AtGSTZ基因DNA(Chen D F，Kawarasaki Y，Nakano H，et al.JBiosci Bioeng，2003，95：594-600)，按1∶3的摩尔比混合，加入T4 DNA连接酶，进行连接反应，连接物转化进E.coli DH5α，统计菌落数，计算白斑率，白斑率平均为88.8％。对白色菌落进行菌落PCR鉴定，检查是否插入了AtGSTZ基因，实验结果表明，阳性重组率为95.6％。
                SEQUENCE LISTING
<110>南开大学
<120>用于T-A克隆的pG7X-T载体及其制备方法
<130>041025
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2989
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222>(1)..(2989)<223>
<400>1
agactgggga tccggagagc tcccaacgcg ttggatgcat agcttgagta ttctatagtg      60
tcacctaaat agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc     120
gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta     180
atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa     240
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat     300
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cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc     660
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt     720
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt     780
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc     840
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa     900
gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa     960
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tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga    1080
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg    1140
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg    1200
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cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc    1740
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gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc    1860
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acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta    1980
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<210>2
<211>47
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(47)
<223>
<400>2
gaataagctt gttcccaggt caagactggg gatccggaga gctccca                    47
<210>3
<211>48
<212>DNA
<213>人工合成
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<221>primer_bind
<222>(1)..(48)
<223>
<400>3
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