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细菌群体感应的抗体介导性破坏
本申请是申请日为2008年10月24日、申请号为200880113179.4、发明名称为“细菌群体感应的抗体介导性破坏”的发明专利申请的分案申请。
政府资助
在美国政府支持下，以国家健康研究所(National Institutes of Health)授权编号AI055778进行本文所述之本发明。美国政府(United States Government)对本发明具有某些权利。
技术领域
本申请涉及细菌群体感应的抗体介导性破坏。
背景技术
细菌感染变得越来越具有致命性，因为许多引起疾病的菌株对用于控制其的大批抗生素产生耐药性。举例来说，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种医院获得性感染的常见原因，其导致从皮肤感染和食物中毒到危急生命的医院感染的各种疾病或病状。金黄色葡萄球菌分离株对糖肽抗生素(最显著的是万古霉素(vancomycin))的耐药性逐渐增加是现今重病监护室主要关心的事。因此，亟需抵抗细菌感染的替代性策略。
发明内容
本发明涉及减弱群体感应的免疫药物治疗方法的发现。具体来说，本发明涉及针对合理设计的半抗原所引发的单克隆抗体的发现，所述单克隆抗体可抑制群体感应，在活体内脓肿形成小鼠模型中抑制细菌致病性且提供保护以免受致命细菌攻毒。
在一实施例中，本发明提供一种包含至少一种半抗原的免疫原性分子实体，所述半抗原任选地通过连接子部分与大分子载体共价连接，所述半抗原包含环肽或其类似物，所述环肽或其类似物包含大环，其中环肽或其类似物包含约4个到约19个氨基酸残基，环肽或其类似物具有由式I表示的结构：

其中各X独立地为任何氨基酸残基；X¹为通过相应羰基与R共价键结的氨基酸残基；X^a+2为内部氨基酸，其中相应碳原子与R共价键结；R为共价连接X¹和X^a+2从而形成大环的大环化部分，其中R包含酯、硫酯、酰胺、尿素、氨基脲或其它酰胺替代基团或其任何组合；a为1到约9；b为1到约8；且由波形线横切的键指示所述环肽或其类似物的N端氨基酸残基任选地通过所述连接子部分与所述大分子载体的连接点。
在一些实施例中，所述免疫原性分子实体具有以上所示的结构，其中a为2-8，且R包括烷氧基或烷芳氧基、烷硫基或烷氨基，其使X^a+2与X¹羰基共价键结，从而分别提供酯、硫酯或酰胺键，以致分别形成内酯、硫内酯或内酰胺大环。在一些实施例中，免疫原性分子实体具有以上所示的结构，其中R包括-CH₂O-、-CH₂CH₂O-、-CH₂CH(CH₃)O-、-CH₂-苯基-O-、-CH₂S-、-CH₂CH₂S-或-(CH₂)_nNH-，其中n为1到约4。在一些实施例中，免疫原性分子实体具有以上所示的结构，其中a为2-8，且R包括至少一个酰胺、尿素或氨基脲基团或至少一个酰胺替代键。
在一些实施例中，R由式(IIa)或式(IIb)表示：



其中n为1到约4，R¹为天然存在的氨基酸或其类似物的侧链，由波形线横切的键指示连接点，其中所述称为(i)的连接点是与X¹的羰基键结且所述称为(ii)的连接点是与X^a+2的α-碳键结。
在一些实施例中，R具有式(IIa)：

在一些实施例中，R具有式(IIb)：

在一些实施例中，免疫原性分子实体具有以上所示的结构，其中X¹和X²为疏水性氨基酸残基，且在一些实施例中，X¹和X²独立地选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸组成的氨基酸残基或其类似物的群组。在一些实施例中，X¹和X²各独立地为甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或色氨酸。
在一些实施例中，免疫原性分子实体的环肽或类似物具有氨基酸序列YST(X^a+2)DFIM(SEQ ID NO：92)、YST(X^a+2)YFIM(SEQ ID NO：93)、IN(X^a+2)DFLL(SEQ ID NO：94)、GVNA(X^a+2)SSLF(SEQ ID NO：95)、GVNP(X^a+2)GGWF(SEQ ID NO：96)、KAKT(X^a+2)TVLY(SEQ ID NO：97)、KTKT(X^a+2)TVLY(SEQ ID NO：98)、GANP(X^a+2)OLYY(SEQ ID NO：99)、GANP(X^a+2)ALYY(SEQ ID NO：100)、GYST(X^a+2)SYYF(SEQ ID NO：101)、GYRT(X^a+2)NTYF(SEQ ID NO：102)、YNP(X^a+2)VGYF(SEQ ID NO：103)、GGKV(X^a+2)SAYF(SEQ ID NO：104)、SVKP(X^a+2)TGFA(SEQ ID NO：105)、DSV(X^a+2)ASYF(SEQ ID NO：106)、 KYNP(X^a+2)SNYL(SEQ ID NO：107)、KYNP(X^a+2)ASYL(SEQ ID NO：108)、KYNP(X^a+2)ANYL(SEQ ID NO：109)、RIPT(X^a+2)TGFF(SEQ ID NO：110)、DI(X^a+2)NAYF(SEQ ID NO：111)、DM(X^a+2)NGYF(SEQ ID NO：112)、KYNP(X^a+2)LGFL(SEQ ID NO：113)、KYYP(X^a+2)FGYF(SEQ ID NO：114)、GARP(X^a+2)GGFF(SEQ ID NO：115)、GAKP(X^a+2)GGFF(SEQ ID NO：116)、YSP(X^a+2)TNFF(SEQ ID NO：117)、YSP(X^a+2)TNF(SEQ ID NO：118)或QN(X^a+2)PNIFGQWM(SEQ ID NO：119)，其中各序列的最后一个氨基酸残基为X¹，且(X^a+2)为X¹的羰基通过R所共价键结的内部氨基酸。
在一些实施例中，所述大分子载体包括蛋白质、聚合物或纳米粒子。在一些实施例中，所述聚合物为树枝状聚合物。在一些实施例中，所述树枝状聚合物为MAP树枝状聚合物。在一些实施例中，大分子载体包含蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是选自由以下组成的群组：钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、兔血清白蛋白(rabbit serum albumin，RSA)、人类血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、智利鲍血蓝蛋白(Concholepas concholepas hemocyanin，CCH)、霍乱毒素(cholera toxin)B亚单位、大肠杆菌(E.coli)不稳定毒素B亚单位、白喉类毒素(Diphtheria toxoid)、破伤风类毒素(tetanus toxoid)、破伤风毒素(tetanus toxin)C片段、重组绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)外蛋白A、CRMl97(交叉反应性物质)、阳离子化的牛血清白蛋白(cationized bovine serum albumin，cBSA)、甲状腺球蛋白(Tg)、抗生物素蛋白、牛甲状腺球蛋白(bovine thyroglobulin，BTG)、牛G球蛋白、牛免疫球蛋白G(bovine immunoglobulin G，BIgG)、伴白蛋白(CONA)、胶态金(colloidal gold)、麻仁球蛋白、红色皇帝蟹(Paralithodes camtschatica)血蓝蛋白(HC)、罗曼蜗牛血蓝蛋白(helix promatia haemocyanin，HPH)、大豆库尼兹型胰蛋白酶抑制剂(soybean kunitz trypsin inhibitor，KTI)、美洲鲎血蓝蛋白(Limulus polyphemus heamocyanin，LPH)、卵白蛋白(OA)、Pam3Cys-Th(脂肽/Th细胞表位)、聚赖氨酸、猪甲状腺球蛋白(porcine thyroglobulin，PTG)、纯化蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)、大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor，STI)或向日葵球蛋白(sunflower globulin，SFG)。
在一些实施例中，环肽类似物通过环肽类似物的N端氨基酸残基的氨基或环肽类似物的N端半胱氨酸或高半胱氨酸残基的巯基与大分子载体共价连接。
在一些实施例中，本发明的分子实体进一步包括使环肽类似物与大分子载体共价连接的连接子部分。在一些实施例中，环肽类似物通过环肽类似物的N端氨基酸残基的氨基或通过环肽类似物的N端半胱氨酸或高半胱氨酸残基的巯基与连接子部分键结，所述 连接子部分与大分子载体共价键结。在一些实施例中，连接子部分包括通过MBS、磺酸基-MBS、SMCC或磺酸基-SMCC的反应所产生的部分。在一些实施例中，连接子部分包括己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide，ADH)、间隔肽、半丁二酸羟甲酯或聚乙二醇衍生物。
在一些实施例中，分子实体具有以下结构：

SEQ ID NO：3(YSTSDFIM，不包括保护基)，

SEQ ID NO：4(GVNASSSLF，不包括保护基)，

SEQ ID NO：2(INSDFLL，不包括保护基)，
或

SEQ ID NO：1(YSTSYFIM，不包括保护基)，
其中CPL为任选连接子与半胱氨酸巯基共价键结的大分子载体。
另一方面，本发明提供一种包括本发明的免疫原性分子实体的超分子组合体。在一些实施例中，所述超分子组合体包括脂质体、病毒体、噬菌体、病毒粒子或聚合纳米粒子传递系统。
另一方面，本发明提供一种与具有以下氨基酸序列的环肽特异性结合的抗体：YST(X^a+2)DFIM(SEQ ID NO：92)、YST(X^a+2)YFIM(SEQ ID NO：93)、IN(X^a+2)DFLL(SEQ ID NO：94)、GVNA(X^a+2)SSLF(SEQ ID NO：95)、GVNP(X^a+2)GGWF(SEQ ID NO：96)、KAKT(X^a+2)TVLY(SEQ ID NO：97)、KTKT(X^a+2)TVLY(SEQ ID NO：98)、GANP(X^a+2)OLYY(SEQ ID NO：99)、GANP(X^a+2)ALYY(SEQ ID NO：100)、GYST(X^a+2)SYYF(SEQ ID NO：101)、GYRT(X^a+2)NTYF(SEQ ID NO：102)、YNP(X^a+2)VGYF(SEQ ID NO：103)、GGKV(X^a+2)SAYF(SEQ ID NO：104)、SVKP(X^a+2)TGFA(SEQ ID NO：105)、DSV(X^a+2)ASYF(SEQ ID NO：106)、KYNP(X^a+2)SNYL(SEQ ID NO：107)、KYNP(X^a+2)ASYL(SEQ ID NO：108)、KYNP(X^a+2)ANYL(SEQ ID NO：109)、RIPT(X^a+2)TGFF(SEQ ID NO：110)、DI(X^a+2)NAYF(SEQ ID NO：111)、DM(X^a+2)NGYF(SEQ ID NO：112)、KYNP(X^a+2)LGFL(SEQ ID NO：113)、KYYP(X^a+2)FGYF(SEQ ID NO：114)、GARP(X^a+2)GGFF(SEQ ID NO：115)、GAKP(X^a+2)GGFF(SEQ ID NO：116)、YSP(X^a+2)TNFF(SEQ ID NO：117)、YSP(X^a+2)TNF(SEQ ID NO：118)或QN(X^a+2)PNIFGQWM(SEQ ID NO：119)；其中各序列的最后一个氨基酸残基为X¹，且(X^a+2)为X¹的羰基通过R所共价键结的内部氨基酸，其中R为与X¹的羰基共价键结的X^a+2的侧链部分；且其中R包含-CH₂O-、-CH₂CH₂O-、-CH₂CH(CH₃)O-、-CH₂-苯基-O-、-CH₂S-、-CH₂CH₂S-或-(CH₂)_nNH-，其中n为1到约4。
另一方面，本发明提供一种与革兰氏阳性细菌的环肽信号传导分子特异性结合的抗体。
在一些实施例中，抗体与具有以下序列的环肽信号传导分子特异性结合：YSTCDFIM(SEQ ID NO：120)；GVNACSSLF(SEQ ID NO：121)；INCDFLL(SEQ ID NO：122)；YSTCYFIM(SEQ ID NO：123)；GVNPCGGWF(SEQ ID NO：124)；KAKTCTVLY(SEQ ID NO：125)；KTKTCTVLY(SEQ ID NO：126)；GANPCOLYY(SEQ ID NO：127)；GANPCALYY(SEQ ID NO：128)；GYSTCSYYF(SEQ ID NO：129)；GYRTCNTYF(SEQ ID NO：130)；YNPCVGYF(SEQ ID NO：131)；GGKVCSAYF(SEQ ID NO：132)；SVKPCTGFA(SEQ ID NO：133)；DSVCASYF(SEQ ID NO：134)；KYNPCSNYL(SEQ ID NO：135)；KYNPCASYL(SEQ ID NO：136)；KYNPCANYL(SEQ ID NO：137)；RIPTSTGFF(SEQ ID NO：138)；DICNAYF(SEQ ID NO：139)；DMCNGYF(SEQ ID NO：140)；KYNPCLGFL(SEQ ID NO：141)；KYYPCFGYF(SEQ ID NO：142)；VGARPCGGFF(SEQ ID NO：143)；GAKPCGGFF(SEQ ID NO：144)；YSPCTNFF(SEQ ID NO：145)；或QNSPNIFGQWM(SEQ ID NO：146)；其中加下划线残基的α-羰基分别与粗体内部半胱氨酸或丝氨酸残基的巯基或羟基形成硫内酯或内酯键。
在一些实施例中，抗体为中和抗体，例如交叉中和抗体。在一些实施例中，其为单链可变片段(scFv)、Fab或F(ab′)₂片段。在一些实施例中，抗体包含SEQ ID NO：35-53中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体为单克隆抗体。在一些实施例中，抗体包含SEQ ID NO：19-26和147-154中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含SEQ ID NO：19-26中的任一个的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：147-154中的任一个的氨基酸序列共价相互作用。在一些实施例中，抗体为鼠类、牛类或人类抗体。在一些实施例中，抗体为人类化或嵌合抗体。在一些实施例中，抗体为AP4-24H11。
另一方面，本发明提供一种包括本发明的至少一种抗体和医药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施例中，所述组合物包括与两种到四种具有以下序列的环肽信号传导分子特异性结合的两种到四种抗体：YSTCD FIM(SEQ ID NO：120)、GVNACSSLF(SEQ ID NO：121)、INCDFLL(SEQ ID NO：122)和YSTCYFIM(SEQ ID NO：123)；其中加下划线残基的α-羰基与粗体内部半胱氨酸残基的巯基形成硫内酯键。
另一方面，本发明提供一种包括本发明的至少一种免疫原性分子实体和医药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施例中，所述免疫原性分子实体包括具有以下序列的环肽：YST(X^a+2)DFIM(SEQ ID NO：92)、YST(X^a+2)YFIM(SEQ ID NO：93)、IN(X^a+2)DFLL(SEQ ID NO：94)、GVNA(X^a+2)SSLF(SEQ ID NO：95)、GVNP(X^a+2)GGWF(SEQ ID NO：96)、KAKT(X^a+2)TVLY(SEQ ID NO：97)、KTKT(X^a+2)TVLY(SEQ ID NO：98)、GANP(X^a+2)OLYY(SEQ ID NO：99)、GANP(X^a+2)ALYY(SEQ ID NO：100)、 GYST(X^a+2)SYYF(SEQ ID NO：101)、GYRT(X^a+2)NTYF(SEQ ID NO：102)、YNP(X^a+2)VGYF(SEQ ID NO：103)、GGKV(X^a+2)SAYF(SEQ ID NO：104)、SVKP(X^a+2)TGFA(SEQ ID NO：105)、DSV(X^a+2)ASYF(SEQ ID NO：106)、KYNP(X^a+2)SNYL(SEQ ID NO：107)、KYNP(X^a+2)ASYL(SEQ ID NO：108)、KYNP(X^a+2)ANYL(SEQ ID NO：109)、RIPT(X^a+2)TGFF(SEQ ID NO：110)、DI(X^a+2)NAYF(SEQ ID NO：111)、DM(X^a+2)NGYF(SEQ ID NO：112)、KYNP(X^a+2)LGFL(SEQ ID NO：113)、KYYP(X^a+2)FGYF(SEQ ID NO：114)、GARP(X^a+2)GGFF(SEQ ID NO：115)、GAKP(X^a+2)GGFF(SEQ ID NO：116)、YSP(X^a+2)TNFF(SEQ ID NO：117)、YSP(X^a+2)TNF(SEQ ID NO：118)或QN(X^a+2)PNIFGQWM(SEQ ID NO：119)；其中各序列的最后一个氨基酸残基为X¹，且(X^a+2)为X¹的羰基通过R所共价键结的内部氨基酸；且其中R包含-CH₂O-、-CH₂CH₂O-、-CH₂CH(CH₃)O-、-CH₂-苯基-O-、-CH₂S-、-CH₂CH₂S-或-(CH₂)_nNH-，其中n为1到约4。
在一些实施例中，所述组合物包括两种到四种免疫原性分子实体，其中所述环肽具有序列YST(X^a+2)DFIM(SEQ ID NO：92)、YST(X^a+2)YFIM(SEQ ID NO：93)、IN(X^a+2)DFLL(SEQ ID NO：94)、GVNA(X^a+2)SSLF(SEQ ID NO：95)、GVNP(X^a+2)GGWF(SEQ ID NO：96)、KAKT(X^a+2)TVLY(SEQ ID NO：97)、KTKT(X^a+2)TVLY(SEQ ID NO：98)、GANP(X^a+2)OLYY(SEQ ID NO：99)、GANP(X^a+2)ALYY(SEQ ID NO：100)、GYST(X^a+2)SYYF(SEQ ID NO：101)、GYRT(X^a+2)NTYF(SEQ ID NO：102)、YNP(X^a+2)VGYF(SEQ ID NO：103)、GGKV(X^a+2)SAYF(SEQ ID NO：104)、SVKP(X^a+2)TGFA(SEQ ID NO：105)、DSV(X^a+2)ASYF(SEQ ID NO：106)、KYNP(X^a+2)SNYL(SEQ ID NO：107)、KYNP(X^a+2)ASYL(SEQ ID NO：108)、KYNP(X^a+2)ANYL(SEQ ID NO：109)、RIPT(X^a+2)TGFF(SEQ ID NO：110)、DI(X^a+2)NAYF(SEQ ID NO：111)、DM(X^a+2)NGYF(SEQ ID NO：112)、KYNP(X^a+2)LGFL(SEQ ID NO：113)、KYYP(X^a+2)FGYF(SEQ ID NO：114)、GARP(X^a+2)GGFF(SEQ ID NO：115)、GAKP(X^a+2)GGFF(SEQ ID NO：116)、YSP(X^a+2)TNFF(SEQ ID NO：117)、YSP(X^a+2)TNF(SEQ ID NO：118)或QN(X^a+2)PNIFGQWM(SEQ ID NO：119)；其中各序列的最后一个氨基酸残基为X¹，且(X^a+2)为X¹的羰基通过R所共价键结的内部氨基酸；且其中R包含-CH₂O-、-CH₂CH₂O-、-CH₂CH(CH₃)O-、-CH₂-苯基-O-、-CH₂S-、-CH₂CH₂S-或-(CH₂)_nNH-，其中n为1到约4。
在一些实施例中，组合物包括四种免疫原性分子实体，其中所述环肽具有序列YSTCDFIM(SEQ ID NO：120)、GVNACSSLF(SEQ ID NO：121)、INCDFLL(SEQ ID  NO：122)和YSTCYFIM(SEQ ID NO：123)；其中加下划线残基的α-羰基与粗体内部半胱氨酸残基的巯基形成硫内酯键。
在一些实施例中，组合物包括至少一种其它免疫原。在一些实施例中，所述至少一种其它免疫原引发针对乙型肝炎(hepatitis B)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)b型细菌、白喉、麻疹、流行性腮腺炎(mumps)、百日咳、脊髓灰质炎、风疹、破伤风、结核、水痘或其任何组合的免疫反应。
另一方面，本发明提供一种包含本发明的免疫原性分子实体、超分子组合体、抗体或组合物和使用说明书的制品。
另一方面，本发明提供一种引发哺乳动物免疫反应的方法，其包括向所述哺乳动物投与包括本发明的免疫原性分子实体或超分子组合体的组合物，投与量有效引发哺乳动物的免疫反应。在一些实施例中，哺乳动物为山羊、兔、绵羊、猪、小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、母牛、马、猴或人类。在一些实施例中，通过静脉内、腹膜内、皮下、皮内或肌肉内注射向哺乳动物投与所述组合物。在一些实施例中，所述方法进一步包括从哺乳动物获得生物样品，其中所述生物样品包含与环肽信号传导分子和/或与免疫原性分子实体的环肽特异性结合的抗体。在一些实施例中，方法进一步包括从哺乳动物中分离出产生抗体的细胞，和使所述产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，其产生与环肽信号传导分子和/或与免疫原性分子实体的环肽特异性结合的抗体。
在一些实施例中，哺乳动物易受革兰氏阳性细菌感染或易患与革兰氏阳性细菌相关的疾病病状。在一些实施例中，所述革兰氏阳性细菌为葡萄球菌(Staphylococcus)，诸如金黄色葡萄球菌(S.aureus)或表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。在一些实施例中，哺乳动物为人类。
在一些实施例中，方法进一步包括在所选时间向哺乳动物再投与至少一个剂量的包括免疫原性实体的组合物。
另一方面，本发明提供一种抑制哺乳动物体内的群体感应的方法，其包括向所述哺乳动物投与包括本发明的抗体的组合物，投与量有效抑制哺乳动物体内的群体感应。
另一方面，本发明提供一种抑制哺乳动物体内的群体感应的方法，其包括向所述哺乳动物投与本发明的免疫原性分子实体或超分子组合体，投与量有效引发免疫反应且抑制哺乳动物体内的群体感应。在本发明的一些实施例中，哺乳动物为人类。
另一方面，本发明提供一种预防或治疗哺乳动物的革兰氏阳性细菌感染的方法，其包括向所述哺乳动物投与本发明的免疫原性分子实体、超分子组合体或抗体，投与量有效预防或治疗哺乳动物的革兰氏阳性细菌感染。在一些实施例中，哺乳动物为人类。在 一些实施例中，通过静脉内、腹膜内、皮下、皮内或肌肉内注射来向哺乳动物投与免疫原性分子实体、超分子组合体或抗体。
另一方面，本发明提供一种鉴别与环肽信号传导分子特异性结合的抗体的方法，其包括使包括与大分子载体共价连接的信号传导分子的环肽类似物的免疫原性分子实体与重组组合性免疫球蛋白文库接触，和将所述与所述免疫原性分子实体特异性结合的重组免疫球蛋白鉴别为与所述环肽信号传导分子特异性结合的抗体。
另一方面，本发明提供一种防止生物膜形成的方法，其包括用本发明的抗体涂布包括导管表面的表面。
另一方面，本发明提供一种分离的核酸，其具有编码本文所论述的抗体的序列。在一些实施例中，所述核酸具有SEQ ID NO：54-91、27-34和155-181中的任一个的序列。如本文中所使用，术语“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA)的聚合物。所述术语包括线性分子以及共价闭环分子。其包括单链分子以及双链分子。
如本文中提及核酸分子时所使用，术语“分离”的意思是核酸分子不含在衍生本发明的核酸的有机体的天然存在的基因组中侧接其5′和3′端的无关核酸序列，或其它基因的表达所涉及的序列。因此，本发明的“分离的核酸”具有不同于任何天然存在的核酸或天然存在的基因组核酸中跨越3个以上独立基因的任何片段的结构。因此，术语“分离的核酸分子”包括例如：(1)DNA分子，其具有天然存在的基因组DNA分子的一部分的序列，但两侧不为侧接有机体(所述分子天然存在于其中)的基因组中的分子的一部分的编码序列；(2)核酸，其以使得所得分子与任何天然存在的载体或基因组DNA不同的方式并入载体或原核生物或真核生物的基因组DNA中；(3)独立分子，诸如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链反应(PCR)所产生的片段或限制性片段；和(4)重组核苷酸序列，其为杂合基因(即编码融合蛋白的基因)的一部分。具体来说，这一定义中不包括以(1)DNA分子、(2)转染细胞和(3)细胞克隆的混合物形式存在的核酸，例如那些以诸如cDNA或基因组DNA文库等DNA文库形式存在的核酸。
另一方面，本发明提供一种具有编码本文所论述的抗体的核酸的表达载体。
在一些实施例中，编码抗体的核酸可操作地连接于表达控制序列。在一些实施例中，所述表达控制序列为启动子。在一些实施例中，所述启动子为噬菌体、病毒、细菌或哺乳动物启动子。
如本文中所使用，术语“表达载体”的意思是能够转运和/或允许表达所连接的另一核酸的核酸分子。表达产物被称为信使核糖核酸(mRNA)转录物。因此，表达载体含有可指导可操作地连接于表达控制序列的核酸表达以产生转录物的适当表达控制序列。 因此，短语“表达控制序列”的意思是当诸如转录活化蛋白等适当分子结合表达控制序列时，足以指导可操作地连接于表达控制序列的另一核酸序列转录以产生RNA转录物的核酸序列。且术语“可操作地连接”的意思是核酸和表达控制序列以使得当诸如转录活化蛋白等适当分子与表达控制序列结合时表达控制序列指导核酸表达的方式定位。
另一方面，本发明提供一种包含编码上述抗体的核酸或上述表达载体的细胞。所述细胞可为细菌或哺乳动物细胞。
本发明的其它特征和优点将由以下具体实施方式和由权利要求书显而易见。
附图说明
图1说明金黄色葡萄球菌所使用的自身诱导肽(AIP)的结构。翻译后使寡肽环化以在保守性^(*)Cys的巯基部分与C端残基的羧基之间形成硫酯键(SEQ ID NO：120-123)。
图2A-K是所合成的AIP的电喷雾电离质谱(ESI-MS)谱图和高效液相色谱法(HPLC)色谱图：AIP-1(纯硫内酯)(A和B)；AIP-2(纯硫内酯)(C和D)；AIP-3(纯硫内酯)(E和F)；AIP-4(纯硫内酯)(G和H)；AIP-IV(纯内酯)(I和J)。HPLC是在C18管柱上执行，在214nm下通过UV吸收来监测，使用20％B历时3分钟且接着在30分钟内增加到50％B的梯度。B为针对HPLC级水过柱的乙酰腈。图2K：AP4-BSA结合物的MALDI-TOF分析。
图3A-B是说明RN4850的外蛋白分泌的数据。(A)RN4850的外蛋白分泌的分析。如所指示，在37℃下在所选mAb(200μg/mL)存在下生长20-24小时后，在13，000rpm下离心细胞2分钟。通过10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析上清液。使用蓝色染色剂(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce，Rockford IL))使凝胶染色。实心箭头表示由AP4-24H11引起的外蛋白含量的电位差。(B)金黄色葡萄球菌生长培养基的上清液的溶血活性。将以上所制备的上清液(150μL)滴到绵羊血琼脂板上。在37℃下培育所述板24小时且在室温下再保持24小时。
图4A-E是说明AP4-24H11对金黄色葡萄球菌的群体感应信号传导的抑制结果。(A)金黄色葡萄球菌的α-溶血素和蛋白A表达的西方印迹分析(RN4850和Wood46)。如实例中所述制备金黄色葡萄球菌培养物上清液。(B)在AP4-24H11存在/不存在下培育20-24小时后RN4850、NRS168和Wood46的相对OD₆₀₀(％)。(C)RN4850的静态生物膜形成的分析。(D)实时PCR分析。对在AP4-24H11存在或不存在下生长的RN4850测量所选mRNA的量。使用gyrA作为校准物(calibrator)进行相对定量。对于各项实验进行至少两次独立实验，一式两份。倍数变化的实际数目；rnaIII(-77±48)、eta(-8.1±1)、 hla(-5.2±3.1)、spa(+5.7±3.6)、sarA(-2.1±0.6)和saeR(+1.4±0.4)。(E)AIP-4对AP4-24H11介导的金黄色葡萄球菌QS抑制的抑制。在室温下将AP4-24H11(≈1.3μM)与天然AIP-4(2.5μM)在CYPG培养基中一起培育20分钟。用上述培养基稀释隔夜培养的金黄色葡萄球菌细胞(OD₆₀₀≈0.03)且在37℃下在静态条件下生长20到24小时。制备和分析上清液。关于实验程序的详细讨论，请参见实例。
图5A-B是说明AP4-24H11对金黄色葡萄球菌诱导性聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)裂解的抑制数据。在用来自金黄色葡萄球菌RN4850(A)和Wood46(B)的上清液处理后Jurkat细胞的PARP裂解。将人类Jurkat白血病T细胞保持在补充有10％热灭活致命牛血清、10mM(L)-谷氨酰胺和50mg/mL链霉素和青霉素的RPMI1640(GIBCO，英杰公司(Invitrogen Corp.))中。如实例中所述制备金黄色葡萄球菌上清液，且使用Amicon Ultra-4(5，000NMWL)离心过滤器(马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(MILLIPORE，Billerica MA))将RN4850的上清液进一步浓缩到原始体积的1/3。将汇合的细胞分配到24孔板的新鲜培养基(0.5mL)中且培育6小时，随后添加金黄色葡萄球菌上清液。与指定量的金黄色葡萄球菌上清液一起培育4小时后，制备细胞提取物且通过西方印迹法，使用抗PARP抗体进行分析。
图6A-B是显示在小鼠模型中AP4-24H11对金黄色葡萄球菌诱导性脓肿形成的抑制结果。(A)金黄色葡萄球菌(1×10⁷个)+PBS(上图)；金黄色葡萄球菌(1×10⁷个)+AP4-24H11(0.6mg)(下图)。(B)金黄色葡萄球菌(1×10⁸个)+对照mAb(0.6mg)(上图)；金黄色葡萄球菌(1×10⁸个)+AP4-24H11(0.6mg)(下图)。
图7A-D是说明在小鼠模型中AP4-24H11对金黄色葡萄球菌诱导性脓肿形成的抑制结果。SKH1有胸腺无毛小鼠(6-8周龄)接受200μL含有金黄色葡萄球菌(1×10⁸个细菌)、4μL包装体积Cytodex珠粒、杜尔贝科氏磷酸盐缓冲生理食盐水(DPBS)、mAbAP4-24H11或对照IgG(0.06mg或0.6mg)的皮内侧腹注射液。其它对照动物接受200μL含有Cytodex珠粒或珠粒加抗体的皮内注射液。进行注射后，经过4-7天时间，每天监测小鼠至少三次。在监测期结束时，使小鼠安乐死且收集组织以进行细菌学和组织学分析。(A)金黄色葡萄球菌+PBS；(B)金黄色葡萄球菌+AP4-24H11(0.06mg)；(C)金黄色葡萄球菌+AP4-24H11(0.6mg)；(D)Cytodex+AP4-24H11(0.6mg)。
图8说明从用AP4-24H11使小鼠被动免疫针对金黄色葡萄球菌感染所获得的存活数据。用mAb AP4-24H11或对照IgG预处理，2个小时后接着用金黄色葡萄球菌注射液(3×10⁸个，腹膜内)预处理的小鼠的存活率。括号中的数字显示存活者数目/每组数目。对数秩统计量，p＝0.001；每组n＝6。
图9是显示抗AP1单克隆抗体对I型agr菌株的α-溶血素表达的抑制结果。
图10A-B是抗AIP1mAb的生物化学评估结果。A.在抗AIP1mAb(0.2mg/mL)存在下agr I金黄色葡萄球菌RN6390B的α-溶血素表达。1：AP1-2C2；2：AP1-9A9；3：AP1-9F9；4：AP1-15B4；对照mAb；无抗体。B.在抗AIP1mAb存在下金黄色葡萄球菌RN6390B的静态生物膜形成。
图11是在人类抗AIP4scFv4-20抗体存在下生长的金黄色葡萄球菌RN4850的培养物上清液关于α-溶血素表达的西方分析结果。
图12是证明由mAb AP1-15B4保护小鼠免受致命MRSA USA300攻毒的实验结果。在注射金黄色葡萄球菌(1-3×10⁸个，腹膜内)后2小时，用AP1-15B4(1mg)或对照IgG(1mg)处理小鼠。括号中的数字显示每组存活者，p＝0.02；每组n＝6。
具体实施方式
本发明涉及对于金黄色葡萄球菌AP-4信号传导肽具有特异性的抗体可阻止群体感应且防止小鼠受葡萄球菌感染的发现。因此，本发明提供一种可用于引发产生针对由革兰氏阳性细菌产生的天然环状信号传导肽的免疫反应的免疫原性分子实体，所述细菌通过群体感应调控毒力因子的表达。如本发明的陈述中所定义，所述免疫原性分子实体包含至少一种半抗原，所述半抗原任选地通过连接子部分与大分子载体共价连接，其中所述连接子部分与半抗原和大分子载体共价键结，半抗原包含环肽或其类似物，所述环肽或其类似物包含大环，其中所述环肽或其类似物包含约4个到约19个氨基酸残基。
本发明还提供一种与环肽信号传导分子特异性结合的抗体。所述抗体为可用于抑制哺乳动物体内的群体感应的中和抗体。另外，本发明提供一种包括免疫原性分子实体或中和抗体和医药学上可接受的载剂的组合物。本发明的其它实施例包括一种引发哺乳动物的针对环肽信号传导分子的免疫反应的方法，和一种抑制哺乳动物体内的细菌群体感应的方法。
本发明的免疫原性分子实体由任选地通过连接子部分与大分子载体共价键结的环肽或其类似物构成。免疫原性分子实体可进一步包括于诸如病毒粒子等超分子组合体中。因此，本发明的免疫原性分子实体可引发已投与分子实体的动物的免疫反应。所述动物可为例如任何哺乳动物，诸如山羊、猪、兔、小鼠、大鼠、马或人类。
定义
如本文中所使用，术语“免疫原性”是指分子实体在脊椎动物中，例如在包括小鼠、大鼠、灵长类动物或人类的哺乳动物中产生免疫反应的适合性。当分子实体具有足够分 子大小且具有用于产生免疫反应的其它必需分子性质以致由用分子实体攻毒的动物产生抗体时，其具有免疫原性。在所属领域中熟知，为了具有免疫原性，诸如蛋白质等分子实体的分子量必须为至少约10kDa。
术语“分子实体”的意思是分别由化学结构或化学结构的组合体定义的分子或分子的组合体。举例来说，本发明的分子实体可为任选地通过连接子部分与半抗原共价偶合的载体蛋白或其它免疫原性感受态聚合物(诸如树枝状聚合物)。“超分子组合体”可为包括免疫原性分子实体的不同大分子的组合体，诸如包含免疫原性分子实体的传染性病毒粒子。超分子组合体也可为在外表面上呈现免疫原性分子实体的半抗原部分的病毒体。
如本文中所使用，“半抗原”是单独时分子大小或重量不足以例如刺激动物的免疫反应的分子部分或片段。然而，当与载体偶合时，可产生与半抗原特异性结合的抗体。
如本文中所使用的术语“环肽或其类似物”是指至少部分由多个以线性寡聚形式共价连接的氨基酸残基或类似单元形成的有机结构，其中所述线性链进一步内部环化以形成大环。所述线性寡聚形式包含单体单元，各单体单元由以线性方式键结的氨基酸残基构成，但另外还形成通过线性链的羧基端氨基酸残基与内部氨基酸残基的侧链共价连接所产生的环。例如参见图1。
术语“氨基酸残基”的意思是共价键结于寡聚链中(例如所属领域中所熟知的天然肽中)的氨基酸或其类似物。氨基酸残基也称为“无水氨基酸单元”，这归因于在氨基酸残基的氨基或羧酸基团分别与寡聚物中的相邻氨基酸残基的羧酸基团或氨基之间形成酰胺键。氨基酸或氨基酸类似物的氨基与羧酸基团都可与寡聚物中的相邻氨基酸残基以酰胺或类似酰胺的键形式组合。然而，如本文所提及的环肽或其类似物无须仅由天然存在的氨基酸的残基构成。
虽然如本文中所使用的术语环肽可由核糖体氨基酸残基(即可在DNA中编码而无翻译后修饰的约20种L-α-氨基酸)形成，但其可包括这些天然氨基酸的对映异构D-氨基酸形式，以及非天然氨基酸，诸如带有除约20种核糖体氨基酸的侧链外的侧链的氨基酸。环肽也可包括除α-氨基酸外的类型的氨基酸，诸如β-氨基酸或γ-氨基酸，或羧酸和氨基由许多原子分隔的氨基。举例来说，环肽或类似物可包括烷氨基和羧酸基团由各种长度的聚乙二醇(PEG)链或简单亚烷基链分隔的氨基酸。所有这些氨基酸在本文的含义中都视为“氨基酸残基”。因此，本发明的环肽或其类似物可由遗传编码氨基酸、天然存在的非遗传编码氨基酸或合成氨基酸制成。表1中提供本文中用于二十种遗传编码的L-氨基酸和非编码氨基酸的一些实例的氨基酸符号：
表1


不管氨基酸的构成，环肽或其类似物的结构包括大环。如本文中所使用的术语环肽或其类似物含有的大环包括与位于链中的氨基酸残基(即“内部”氨基酸残基)的侧链共价键结的C端氨基酸残基。因此，包含“环肽或其类似物”的“免疫原性分子实体”可概念化为具有“套索(lasso)”样环形式的分子，其中套索的环自由，而套索的尾部与大分子载体键结。如下文所述，套索的尾部可通过连接子部分与大分子载体键结，以及直接键结。
如本文中所使用，环肽或其类似物也可包括不包括氨基酸残基的分子区段。举例来说，环肽或类似物中可包括诸如聚乙二醇(PEG)区段等间隔区段。通常位于套索样环的尾部的间隔区段可用以保持半抗原远离大分子载体的表面以增加其与抗体的可接近性。
所述环由一组共价键结的原子完成，所述原子在本文中称为“大环化部分”，且如式(I)中的“R”所示，插入C端氨基酸的羰基(即氨基酸羧基的羰基)与内部氨基酸的碳原子之间。
如本文中所使用的术语“大环化部分”是指一组共价键结的原子，其可包括在C端氨基酸残基的羧基端羰基与内部氨基酸残基的原子(诸如α-碳)之间形成桥的碳、氮、氧、硫和氢。大环化部分可包括酰胺键；例如，所述部分可为如下基团，其包括可通过酰胺键与内部氨基酸残基的侧链氨基共价键结的羧酸基团，且也可包括可通过酰胺键与C端氨基酸残基的羧酸基团的羰基共价键结的氨基。在式(I)中称为“R”的大环化部 分也可包括其它基团类型，诸如酯、硫酯、醚、硫醚、羰基、烯烃或烃基。大环化部分可含有任何酰胺替代基团，或若干所述基团，例如如″氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物化学(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins)，″第7卷，阿诺F.斯皮托拉(Arno F.Spatola)，(1983)马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker)，纽约/巴塞尔(New York/Basel)中所述，其以全文引用的方式并入本文中。酰胺替代基团可包括酮、胺、醚、硫醚、砜、亚砜、磺酰胺、磺酸酯基、芳基、杂芳基、烷基、烯基、肼、脒、胍、尿素、硫脲、氨基脲、硼酸酯基、膦酸酯基等等。
如本文中所使用的术语“大环”的意思是完全由共价键结的原子形成的环，其中所述环大小超过约9个原子。大环可包括多达20个原子或30个原子或更多。大环可包括碳-碳键，以及碳-氮、碳-氧、碳-硫、氮-氮和包括价态大于1的原子的其它共价键。在本发明环肽或其类似物中，大环包括具有至少3个且多达约10个氨基酸残基的一些原子，以及完成大环结构的上述大环化部分。
如本文中所使用的术语“大分子载体”是指一种大分子实体，与其所键结的半抗原一起其大小足以触发由组合物攻毒的有机体产生免疫反应。通常，半抗原与蛋白质(例如钥孔血蓝蛋白)键结，以触发免疫反应且引起经攻毒的有机体形成针对所连接的半抗原的抗体。因此，大分子载体可为蛋白质，尤其是已知为用于呈递半抗原的良好载体的蛋白质，即所产生的大部分抗体具有半抗原且不具有载体蛋白作为其抗原结构。然而，本发明的大分子载体可为除蛋白质外的实体。举例来说，大分子载体可包含树枝状聚合物，诸如多抗原肽(Multiple Antigen Peptide，MAP)树枝状聚合物，诸如由J.塔姆(J.Tam)等人所开发的用于将半抗原呈递到免疫系统的树枝状聚合物(例如参见D.波斯奈特(Posnett，D.)，H.麦格拉斯(McGrath，H.)，和J.P.塔姆(Tam，J.P.)″制造抗肽抗体的新颖方法(A novel method for producing anti-peptide antibodies)″生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263，1719-1725(1988)，和J.P.塔姆(Tam，J.P.)″合成肽疫苗设计：高密度多抗原肽系统的合成和性质(Synthetic peptide vaccine design：synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system)″美国国家科学院院刊(PNAS USA)85，5409-5413(1988)，其以全文引用的方式并入本文中)。可通过多官能单体(诸如赖氨酸)的星形聚合来形成的所述树枝状聚合物在可键结半抗原的球状大分子的表面上呈现多个官能团。
此外，大分子实体可为大分子的超分子组合体(诸如病毒粒子)的一部分。举例来说，可使用噬菌体呈现系统，其中噬菌体表面适合于共价连接环肽或类似物。或者，大分子载体可包括病毒体，即由磷脂形成的胶束结构，跨膜蛋白包埋于磷脂中且充当连接 半抗原的大分子载体。
如本文中所使用的术语“连接子部分”是指并入环肽或其类似物与大分子载体之间的分子区段。半抗原可包括连接子部分，其作为可用以通过与环肽或类似物的N端和载体反应而使两者偶合的双功能试剂而被引入。应了解，在一些情况下，环肽或其类似物可与诸如蛋白质等大分子载体直接偶合。举例来说，可通过使用诸如EDC(乙基二甲基氨基丙基碳化二亚胺)等脱水剂，使环肽的N端氨基与蛋白质，例如带有酸性侧链的蛋白质氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)的羧酸基团直接连接，以形成直接酰胺键而不插入任何连接子部分。然而，如所属领域中所熟知，由双功能试剂组成的连接子试剂可执行相同功能。这种连接子试剂的原子在并入本发明免疫原性分子实体中时形成如本文中所使用的术语“连接子部分”。
所属领域的技术人员已知许多类型的连接子试剂。实例包括具有一个适合于与巯基反应的官能团的试剂，例如可与本发明环肽或其类似物的N端半胱氨酸或高半胱氨酸残基反应的N-烷基顺丁烯二酰亚胺衍生物。连接子还具有适合于与存在于大分子载体表面上的基团反应的第二官能团，例如蛋白质中的氨基酸侧链的羧酸酯基或氨基。举例来说，酰基的N-羟基丁二酰亚胺酯可与蛋白质表面赖氨酸残基反应形成酰胺键。连接子试剂的两个官能团通常通过插入原子而共价键结，以致两端的反应用以通过连接子部分使反应性分子相互共价偶合。连接子化学品的实例可见于皮尔斯公司(邮箱117，伊利诺斯州罗克福德，61105)(Pierce，P.O.Box117，Rockford，IL61105)的目录中，其可在网站http：//piercenet.com/products/browse.cfm？fldID＝0203中察看，所述网站的信息以引用的方式并入本文中。如所属领域中所熟知，可反应形成连接子部分的连接子试剂的一些实例包括MBS、磺酸基-MBS、SMCC或磺酸基-SMCC。
术语“群体感应”是指某些菌种检测其自身群体水平且当达到某一群体水平时开始或扩大某些性状的表达(诸如分泌毒力因子)的现象。
术语“免疫原”是指活性疫苗的活性成分且可为多肽、如本文所述的与载体连接的半抗原、或能够引发已暴露的或与免疫原接触的哺乳动物的免疫反应的任何大分子实体或组合体。
本发明的免疫原性分子实体
本发明提供一种包含至少一种半抗原的免疫原性分子实体，所述半抗原任选地通过连接子部分与大分子载体共价连接，所述半抗原包含环肽或其类似物，所述环肽或其类似物包含大环，其中环肽或其类似物包含约4个到约19个氨基酸残基，环肽或其类似物具有由式I表示的结构：

其中各X独立地为任何氨基酸残基；X¹为通过相应羰基与R共价键结的氨基酸残基；X^a+2为内部氨基酸，其中相应碳原子与R共价键结；R为共价连接X和X^a+2从而形成大环的大环化部分，其中R包含酯、硫酯、酰胺、尿素、氨基脲或其它酰胺替代基团或其任何组合；a为1到约9；b为1到约8；且由波形线横切的键指示所述环肽或其类似物的N端氨基酸残基任选地通过所述连接子部分与所述大分子载体的连接点。
在一实施例中，环肽或其类似物包括如下式(I)的结构，其中a为2-8或者可为2-4，且R包含烷氧基或烷芳氧基、烷硫基或烷氨基，其使X^a+2与X¹羰基共价键结，从而分别提供酯、硫酯或酰胺键，以致分别形成内酯、硫内酯或内酰胺大环。
更具体来说，环肽或其类似物包括如下式(I)的结构，其中R包含-CH₂O-、-CH₂CH₂O-、-CH₂CH(CH₃)O-、-CH₂-苯基-O-、-CH₂S-、-CH₂CH₂S-或-(CH₂)_nNH-，其中n为1到约4。在这些实施例中，环肽或其类似物可视为包括大环，其中羧基端羰基分别与丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的侧链键结，形成内酯环；或分别与半胱氨酸或高半胱氨酸残基的侧链键结，形成硫内酯；或分别与二氨基丙酸酯(n＝1)、二氨基丁酸酯(n＝2)、鸟氨酸(n＝3)或赖氨酸(n＝4)残基的侧链键结，形成内酰胺。
在另一实施例中，环肽或其类似物包括如下式(I)的结构，其中a为2-8或者可为2-4，且大环化基团R包含至少一个酰胺、尿素或氨基脲基团或至少一个酰胺替代键。举例来说，R可由式(IIa)或式(IIb)表示：


其中n为1到约4，R¹为天然存在的氨基酸或其类似物的侧链，由波形线横切的键指示连接点，其中所述称为(i)的连接点是与X¹的羰基键结且所述称为(ii)的连接点是与X^a+2的α-碳键结。天然存在的氨基酸的侧链可为任一核糖体氨基酸或其类似物的侧链。因此，由R¹表示的侧链可为如丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸等核糖体氨基酸的侧链。或者，侧链可为类似于这些天然存在的侧链的结构，例如乙基替代丙氨酸甲基、苯乙基替代苯丙氨酸苯甲基等等。如本文中所使用的术语氨基酸残基或氨基酸侧链的类似物是指与天然结构不同、但不同之处仅在于添加短烷基或添加不改变侧链的基本物理性质的取代基的化学结构。举例来说，丙氨酸的类似物将包括丙氨酸的氟化衍生物，诸如三氟丙氨酸，因为残基的大小、离子性和疏水性不会因为取代而大大改变。
式(IIa)的非限制性实例为：

认识到这个R1基团对应于甲硫氨酸侧链。相应地，R可为带有甲硫氨酸侧链的式(IIb)基团：

在本发明的另一实施例中，环肽或其类似物可包括疏水性C端氨基酸残基。举例来 说，在一实施例中，式(I)的X¹和X²为疏水性氨基酸残基。更具体来说，X¹和X²可独立地选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸组成的氨基酸残基或其类似物的群组。更具体来说，X¹和X²各可独立地为甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或色氨酸。
在其它实施例中，环肽或其类似物可包括序列YST(X^a+2)DFIM(SEQ ID NO：92)、YST(X^a+2)YFIM(SEQ ID NO：93)、IN(X^a+2)DFLL(SEQ ID NO：94)、GVNA(X^a+2)SSLF(SEQ ID NO：95)、GVNP(X^a+2)GGWF(SEQ ID NO：96)、KAKT(X^a+2)TVLY(SEQ ID NO：97)、KTKT(X^a+2)TVLY(SEQ ID NO：98)、GANP(X^a+2)OLYY(SEQ ID NO：99)、GANP(X^a+2)ALYY(SEQ ID NO：100)、GYST(X^a+2)SYYF(SEQ ID NO：101)、GYRT(X^a+2)NTYF(SEQ ID NO：102)、YNP(X^a+2)VGYF(SEQ ID NO：103)、GGKV(X^a+2)SAYF(SEQ ID NO：104)、SVKP(X^a+2)TGFA(SEQ ID NO：105)、DSV(X^a+2)ASYF(SEQ ID NO：106)、KYNP(X^a+2)SNYL(SEQ ID NO：107)、KYNP(X^a+2)ASYL(SEQ ID NO：108)、KYNP(X^a+2)ANYL(SEQ ID NO：109)、RIPT(X^a+2)TGFF(SEQ ID NO：110)、DI(X^a+2)NAYF(SEQ ID NO：111)、DM(X^a+2)NGYF(SEQ ID NO：112)、KYNP(X^a+2)LGFL(SEQ ID NO：113)、KYYP(X^a+2)FGYF(SEQ ID NO：114)、GARP(X^a+2)GGFF(SEQ ID NO：115)、GAKP(X^a+2)GGFF(SEQ ID NO：116)、YSP(X^a+2)TNFF(SEQ ID NO：117)、YSP(X^a+2)TNF(SEQ ID NO：118)或QN(X^a+2)PNIFGQWM(SEQ ID NO：119)，其中各序列的最后一个氨基酸残基为X¹，且(X^a+2)为X¹的羰基通过R所共价键结的内部氨基酸。
在一实施例中，环肽或其类似物可模拟任一如下表中所示的对于天然存在的环肽信号传导分子所确定的序列：

细菌天然环状信号传导肽金黄色葡萄球菌IYSTCDFIM(SEQ ID NO：120)金黄色葡萄球菌IIGVNACSSLE(SEQ ID NO：121)金黄色葡萄球菌IIIINCDFLL(SEQ ID NO：122)金黄色葡萄球菌IVYSTCYFIM(SEQ ID NO：123)阿莱塔葡萄球菌(S.arlettae)GVNPCGGWF(SEQ ID NO：124)耳葡萄球菌(S.auricularis)IKAKTCTVLY(SEQ ID NO：125)耳葡萄球菌IIKTKTCTVLY(SEQ ID NO：126)头状葡萄球菌(S.capitis)IGANPCOLYY(SEQ ID NO：127)头状葡萄球菌IIGANPCALYY(SEQ ID NO：128)山羊葡萄球菌(S.caprae)IGYSTCSYYF(SEQ ID NO：129)山羊葡萄球菌IIGYRTCNTYF(SEQ ID NO：130)
肉葡萄球菌(S.carnosus)YNPCVGYF(SEQ ID NO：131)科氏葡萄球菌科氏亚种(S.cohnii ssp.cohnii)GGKVCSAYF(SEQ ID NO：132)科氏葡萄球菌解脲亚种(S.cohneii ssp.urealyticum)SVKPCTGFA(SEQ ID NO：133)表皮葡萄球菌(S.epidermis)IDSVCASYF(SEQ ID NO：134)表皮葡萄球菌IIKYNPCSNYL(SEQ ID NO：135)表皮葡萄球菌IIIKYNPCASYL(SEQ ID NO：136)表皮葡萄球菌IVKYNPCANYL(SEQ ID NO：137)中间葡萄球菌(S.intermedius)RIPTSTGFF(SEQ ID NO：138)里昂葡萄球菌(S.lugdunensis)IDICNAYF(SEQ ID NO：139)里昂葡萄球菌IIDMCNGYF(SEQ ID NO：140)模仿葡萄球菌(S.simulans)IKYNPCLGFL(SEQ ID NO：141)模仿葡萄球菌IIKYYPCFGYF(SEQ ID NO：142)禽葡萄球菌(S.gallinarum)VGARPCGGFF(SEQ ID NO：143)木糖葡萄球菌(S.xylosus)GAKPCGGFF(SEQ ID NO：144)瓦氏葡萄球菌(S.warneri)(RN833)YSPCTNFF(SEQ ID NO：145)粪肠球菌(E.faecalis)QNSPNIFGQWM(SEQ ID NO：146)
应注意：加下划线残基的α-羰基与粗体内部半胱氨酸残基的巯基形成硫内酯键。
半抗原的环肽和其类似物可使用标准固相肽合成技术以线性形式合成，其中X¹羰基将直接键结或通过更复杂的大环化部分(诸如式(IIa)和式(IIb)的基团)键结的内部氨基酸残基的侧链适当地被封阻，以致可实现这一氨基酸残基侧链的选择性去封阻。选择性去封阻的侧链可接着直接与C端羧基反应，从而使侧链与C端羰基键结，其中所述侧链由式(I)的R基团表示，或者可与更复杂的大环化部分反应，由此形成大环。以下提供合成实例。
半抗原共价键结或偶合的大分子载体的大小、分子量和组成足以刺激由半抗原-载体复合物攻毒的动物的免疫反应。包括环肽或环肽类似物的半抗原可与大分子载体直接偶合。举例来说，可使用诸如EDC(乙基二甲基氨基丙基碳化二亚胺)等酰胺形成试剂，任选地利用N-羟基丁二酰亚胺，在载体的官能团(诸如羧酸)与环肽或类似物的官能团(诸如N端氨基)之间形成共价键。或者，环肽的N端氨基酸残基可具有羧基官能团，例如N端残基可为天冬氨酸或谷氨酸残基。在所述情况下，可使用相同化学合成法，使其与载体上的氨基直接偶合。可例如在蛋白质表面上的赖氨酸残基的侧链中存在氨基。或者，肽羧化物可偶合的氨基可位于合成树枝状聚合物(诸如MAP结构)的表面上。其它使环肽或其类似物与大分子载体直接偶合的方案对于所属领域的技术人员将显而易见。
大分子载体可包含多肽。举例来说，大分子载体可为蛋白质，且所述合适的载体蛋白的非限制性实例包括：钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白 (RSA)、人类血清白蛋白(HAS)、智利鲍血蓝蛋白(CCH)、霍乱毒素B亚单位、大肠杆菌不稳定毒素B亚单位、白喉类毒素、破伤风类毒素、破伤风毒素C片段、重组绿脓杆菌外蛋白A、CRM197(交叉反应性物质)、阳离子化的牛血清白蛋白(cBSA)、甲状腺球蛋白(Tg)、抗生物素蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)、牛G球蛋白、牛免疫球蛋白G(BigG)、伴白蛋白(CONA)、胶态金、麻仁球蛋白、红色皇帝蟹血蓝蛋白(HC)、罗曼蜗牛血蓝蛋白(HPH)、大豆库尼兹型胰蛋白酶抑制剂(KTI)、美洲鲎血蓝蛋白(LPH)、卵白蛋白(OA)、Pam3Cys-Th(脂肽/Th细胞表位)、聚赖氨酸、猪甲状腺球蛋白(PTG)、纯化蛋白衍生物(PPD)、大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)或向日葵球蛋白(SFG)。因此，在一些实施例中，免疫原性分子实体包含与诸如(但不限于)以上所举例说明的多肽等多肽共价连接的半抗原。
大分子载体可为聚合物，诸如适合于共价连接半抗原的线性聚合物，或可为另一类型的合成载体，例如树枝状聚合物。通过单体与两个以上反应性基团的星形聚合所产生的树枝状聚合物可适合于提供可使用所属领域的技术人员已知的化学处理来偶合合成环肽或其类似物的官能团。举例来说，在表面上提供多个氨基的MAP树枝状聚合物可与本发明环肽的N端氨基酸残基的侧链羧基偶合。例如参见，萨卡罗-达特斯缇斯(Sakarellos-Daitsiotis)等人，医药化学的当前论题(Current Topics in Medicinal Chemistry)6：1715-35(2006)；绍珀(Saupe)等人，药物传递的专家意见(Expert Opin.Drug.Deliv.)3：345-354(2006)；麦德默(McDermott)等人，免疫学与细胞生物学(Immunology and Cell Biology)76：256-62(1998)；和莎海瓦拉(Shahiwala)等人，药物传递和配方的最新专利(Recent Patents on Drug Delivery&Formulation)1：1-9(2007)。
在另一实施例中，免疫原性分子实体可包括位于环肽或类似物与大分子载体之间的连接子部分。连接子部分可用于在物理上使半抗原(需要抗体对于其具有特异性)(即环肽或类似物)的结构域与大分子载体的表面分离。如所属领域中所熟知，连接子部分可从连接子试剂衍生而来，诸如如此项技术中所熟知的MBS(间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基N-羟基丁二酰亚胺酯)、磺酸基-MBS(间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基N-羟基-2-磺酸基丁二酰亚胺酯)、SMCC(4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸丁二酰亚胺酯)、磺酸基-SMCC(4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸2-磺酸基丁二酰亚胺酯)。连接子试剂与环肽和与载体的反应可使连接子部分与两者偶合。举例来说，以上所述的连接子试剂适合于通过将巯基添加到顺丁烯二酰亚胺基且通过用N-羟基酯基使载体氨基酰化来偶合环肽的含有巯基的N端氨基酸残基和大分子载体的氨基。其它连接子试剂适合于以不同方式与不同基团反应。连接子部分中可包括其它类型的结构。举例 来说，连接子部分可包括己二酸二酰肼(ADH)、间隔肽、半丁二酸羟甲酯或聚乙二醇衍生物。选择适合于以所需方式与特定环肽N端和与特定大分子载体反应的连接子试剂在一般技术范围内。
超分子组合体中可包括大分子载体和共价键结的半抗原。超分子组合体可为脂质体或病毒体，即包括跨膜蛋白的胶束结构。例如参见，韦斯特费德(Westerfeld)和楚尔布里根(Zurbriggen)，肽科学杂志(J.Peptide Sci.)11：707-712(2005)和费那罗瓦(Felnerova)等人，生物技术新见(Current Opinion in Biotechnology)15：518-29(2004)。超分子组合体可为诸如在噬菌体呈现系统中的病毒粒子，其中噬菌体适合于表达表面官能团。
在其它实施例中，为了具有免疫原性，超分子组合体中无需包括大分子载体和共价键结的半抗原。
出于示范性目的，以下展示本发明的免疫原性分子实体的特定实例：

SEQ ID NO：3（YSTSDFIM，不包括保护基)，

SEQ ID NO：4(GVNASSSLF，不包括保护基），

SEQ ID NO：2(INSDFLL，不包括保护基)，
或

SEQ ID NO：1(YSTSYFIM，不包括保护基)，
其中CPL为任选连接子与半胱氨酸巯基共价键结的大分子载体。在这些实例中可见，大环包括在内部丝氨酸氨基酸残基与羧基端(其为甲硫氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸残基)之间形成的内酯基团。每一个这些实例中的大环包括五个氨基酸残基、四个其它天然氨基酸残基、一个包含PEG基团的合成氨基酸残基和一个通过任选连接基团与大分子载体(例如大分子多肽)键结的N端半胱氨酸残基。这些组合物举例说明的结构可用于诱导在动物体内形成抗体，其中至少一些发生免疫反应所形成的抗体对于半抗原的环肽类似物具有特异性。
本发明的免疫原性分子实体可用于筛选重组组合性免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体呈现文库)中对于天然环状信号传导肽具有特异性的抗体。举例来说，本发明的具有对应于金黄色葡萄球菌AIP IV环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原的免疫原性分子实体可用于筛选重组组合性免疫球蛋白文库中将与AIP IV环状信号传导肽特异性结合的抗体。以下论述使用将与环状信号传导肽特异性结合的抗体。
本发明的免疫原性分子实体也可用于引发哺乳动物针对所选环状信号传导肽的免疫反应。举例来说，本发明的具有对应于金黄色葡萄球菌AIP IV环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原的免疫原性分子实体可用于引发哺乳动物针对 AIP-IV环状信号传导肽的免疫反应。
所得哺乳动物可为对于环状信号传导肽具有特异性的抗体的来源。举例来说，可从哺乳动物的血液中分离针对AIP-IV的抗体。另外，可分离出产生抗体的细胞且用于制造产生抗体的杂交瘤以制造如以下所论述的单克隆抗体。
本发明的免疫原性分子实体也可用作疫苗，因为哺乳动物所产生的免疫反应可保护哺乳动物免受在群体感应和毒力基因表达中利用所选环状信号传导肽的革兰氏阳性细菌的感染或防止哺乳动物发展与感染相关的疾病或病状。举例来说，本发明的具有对应于金黄色葡萄球菌AIP IV环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原的免疫原性分子实体可用于引发针对AIP-IV环状信号传导肽的免疫反应，以致保护哺乳动物以防发展与金黄色葡萄球菌毒力相关的疾病病状或并发症。
以下，例如在方法和实例部分中进一步论述本发明的免疫原性分子实体的用途。
本发明的抗体
本发明的抗体是与环状信号传导肽特异性结合的抗体。如本文中所使用，术语“环状信号传导肽”是指由利用群体感应来调控毒力基因表达的革兰氏阳性细菌所产生的环肽。环状信号传导肽是如下信号传导分子：其与结合膜的组氨酸激酶感应子分子结合，感应器分子接着与细胞内反应调节子相互作用。
环状信号传导肽是由利用包括(但不限于)各种葡萄球菌种(Staphylococci species)和粪肠球菌的群体感应的革兰氏阳性细菌产生。下表提供环状信号传导肽和产生者细菌的非限制性实例。信号传导肽由N端尾部和含有硫内酯或内酯的环构成，所述环是通过“C端”氨基酸残基(下划线)的α-羧基与内部氨基酸(粗体)的侧链巯基或羟基反应形成。
细菌天然环状信号传导肽金黄色葡萄球菌IYSTCDFIM(SEQ ID NO：120)金黄色葡萄球菌IIGVNACSSLF(SEQ ID NO：121)金黄色葡萄球菌IIIINCDFLL(SEQ ID NO：122)金黄色葡萄球菌IVYSTCYFIM(SEQ ID NO：123)阿莱塔葡萄球菌GVNPCGGWF(SEQ ID NO：124)耳葡萄球菌IKAKTCTVLY(SEQ ID NO：125)耳葡萄球菌IIKTKTCTVLY(SEQ ID NO：126)头状葡萄球菌IGANPCOLYY(SEQ ID NO：127)头状葡萄球菌IIGANPCALYY(SEQ ID NO：128)山羊葡萄球菌IGYSTCSYYF(SEQ ID NO：129)山羊葡萄球菌IIGYRTCNTYF(SEQ ID NO：130)肉葡萄球菌YNPCVGYF(SEQ ID NO：131)科氏葡萄球菌科氏亚种GGKVCSAYF(SEQ ID NO：132)科氏葡萄球菌解脲亚种SVKPCTGFA(SEQ ID NO：133)表皮葡萄球菌IDSVCASYF(SEQ ID NO：134)表皮葡萄球菌IIKYNPCSNYL(SEQ ID NO：135)表皮葡萄球菌IIIKYNPCASYL(SEQ ID NO：136)表皮葡萄球菌IVKYNPCANYL(SEQ ID NO：137)中间葡萄球菌RIPTSTGFF(SEQ ID NO：138)里昂葡萄球菌IDICNAYF(SEQ ID NO：139)里昂葡萄球菌IIDMCNGYF(SEQ ID NO：140)模仿葡萄球菌IKYNPCLGFL(SEQ ID NO：141)模仿葡萄球菌IIKYYPCFGYF(SEQ ID NO：142)禽葡萄球菌VGARPCGGFF(SEQ ID NO：143)木糖葡萄球菌GAKPCGGFF(SEQ ID NO：144)瓦氏葡萄球菌(RN833)YSPCTNFF(SEQ ID NO：145)粪肠球菌QNSPNIFGQWM(SEQ ID NO：146)
因此，环状信号传导肽可具有含3个到11个氨基酸的环和含1到约9个氨基酸的尾部。环结构是在“C端氨基酸残基”(即相应线性肽的羧基端氨基酸)的α-羰基与内部丝氨酸或半胱氨酸残基(尤其是距离羧基端氨基酸的第4个、第5个、第6个、第7个、第8个或第9个残基)的侧链上的烷氧基或烷硫基之间形成。举例来说，金黄色葡萄球菌AIP4信号传导分子是由氨基酸序列YSTCYFIM(SEQ ID NO：123)构成的环状硫内酯肽类似物。环状硫内酯环结构由甲硫氨酸(M)“C端氨基酸残基”的α-羧基与半胱氨酸HAS(距离“C端”甲硫氨酸(M)残基的第5个氨基酸)的巯基之间的键产生。
因此，环状信号传导肽可具有含5个氨基酸的环(例如硫内酯或内酯环)和含2个到5个氨基酸的线性尾部。
抗体可为与特定抗原特异性结合的免疫球蛋白分子或其免疫活性片段。本发明的抗体是与天然环状信号传导肽或包括环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原特异性结合的抗体。如本文中所使用，在提及本发明的抗体时，术语“特异性结合”的意思是本发明的抗体将与环状信号传导肽或相应半抗原结合，但实质上不与其它无关分子结合，所述无关分子包括单独载体蛋白或其它可与免疫原性分子实体、超分子组合体或来自哺乳动物的生物样品一起存在的无关分子。举例来说，与本发明的免疫原性分子实体(其中半抗原为金黄色葡萄球菌AIP IV环肽信号传导分子的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物)特异性结合的抗体是将与金黄色葡萄球菌AIP IV环肽结合、但不会实质上与单独载体或无关分子结合的抗体。
本发明的抗体也是中和抗体。如本文中所使用，术语“中和抗体”是指将与环状信号传导肽结合且防止环状信号传导肽与其膜相关受体结合的抗体。术语“中和抗体”还包括交叉中和抗体，其为将与至少两种环状信号传导肽(例如来自不同agr类型的环状信号传导肽)结合且防止至少两种环状信号传导肽与其受体结合的抗体。可使用所属领域的技术人员已知的方法(包括本文所述的方法，例如实例部分中)来判定抗体是否是中和抗体。术语
本发明的抗体可为多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可通过以下方式来获得：用本发明的免疫原性分子实体使哺乳动物免疫，且接着使用包括例如用于测定抗体效价的酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和用于获得含有抗体的IgG部份的蛋白A色谱法的标准技术，从所述哺乳动物的血液中分离抗体。
单克隆抗体是一群具有与特定抗原表位特异性结合的共同抗原结合位点的分子。单克隆抗体可通过从已用本发明的免疫原性分子实体免疫的哺乳动物中选出产生抗体的细胞和使所述产生抗体的细胞(例如B细胞)与骨髓瘤融合以得到产生抗体的杂交瘤来获得。本发明的单克隆抗体也可通过使用例如本发明的免疫原性分子实体筛选重组组合性文库(诸如抗体噬菌体呈现文库)来获得。例如参见，C.F.巴尔巴斯(Barbas，C.F.)，第3，D.R.伯顿(D.R.Burton)，J.K.斯科特(J.K.Scott)，和G.J.斯尔弗曼(G.J.Silverman)，噬菌体呈现-实验室手册(Phage Display-A Laboratory Manual.)2001，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，New York)：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；和R.科特曼(Kontermann，R.)，S.杜贝(S.)，抗体工程(Antibody Engineering)，2001，海德堡柏林(Berlin，Heidelberg)：施普林格出版社(Springer-Verlag)。
抗体的免疫活性片段是免疫球蛋白分子的生物活性片段，例如通过用诸如胃蛋白酶等酶使抗体裂解所产生的F(ab)或F(ab′)₂片段。免疫活性片段也可为由连接重链与轻链的可变片段所产生的单链可变片段(scFv)。
本发明的抗体也可为鼠类、嵌合、人类化或全人类抗体。鼠类抗体是完全来源于鼠类来源的抗体，例如来源于由小鼠骨髓瘤细胞与小鼠B淋巴细胞的融合所产生的鼠类杂交瘤的抗体。嵌合抗体是具有来源于非人类来源(鼠类或灵长类动物)的可变区和来源于人类来源的恒定区的抗体。人类化抗体具有来源于小鼠来源的抗原结合区(例如互补决定区)，和其余来源于人类来源的可变区和恒定区。全人类抗体是来自人类细胞或来源于带有人类抗体基因的转基因小鼠的抗体。
产生抗体的方法为所属领域所熟知。举例来说，本发明的多克隆抗体可通过用本发明的免疫原性分子实体使合适的哺乳动物免疫来制备。所述哺乳动物可为例如兔、山羊 或小鼠。在免疫后的适当时间，可从哺乳动物中，例如从哺乳动物的血液或其它流体中分离抗体分子，且进一步使用包括(但不限于)使用硫酸铵的沉淀法、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法或使用蛋白A的亲和色谱法的标准技术进行纯化。另外，可分离哺乳动物的产生抗体的细胞且用于制备分泌本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞。制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的技术为所属领域所已知。例如参见，柯勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)，自然(Nature)256：495-97(1975)和库兹布(Kozbor)等人现代免疫学(Immunol Today)4：72(1983)。本发明的单克隆抗体也可使用所属领域中已知的其它方法来制备，例如由重组DNA分子表达，或如上文所论述的使用本发明的免疫原性分子实体筛选重组组合性免疫球蛋白文库。
产生嵌合和人类化单克隆抗体的方法也为所属领域所熟知且包括例如涉及重组DNA技术的方法。嵌合抗体可通过由编码抗体分子的非人类可变区和人类恒定区的核酸表达来产生。例如参见，莫里森(Morrison)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.)86：6851(1984)。人类化抗体可通过由编码非人类抗原结合区(互补决定区)和人类可变区(无抗原结合区)和人类恒定区的核酸表达来产生。例如参见，琼斯(Jones)等人，自然(Nature)321：522-24(1986)；和维赫文(Verhoeven)等人，科学(Science)239：1534-36(1988)。完全人类抗体可通过使仅表达人类重链和轻链基因的经工程改造的转基因小鼠免疫来产生。在这种情况下，治疗上适用的单克隆抗体可接着使用常规杂交瘤技术来获得。例如参见，隆伯格(Lonberg)和胡萨尔(Huszar)，国际免疫学评论(Int.Rev.Immunol.)13：65-93(1995)。涉及抗体的设计和制造的核酸和技术为所属领域所熟知。例如参见，巴特拉(Batra)等人，杂交瘤(Hybridoma)13：87-97(1994)；柏多兹(Berdoz)等人，PCR方法应用(PCR Methods Appl.)4：256-64(1995)；宝利安尼(Boulianne)等人自然(Nature)312：643-46(1984)；卡森(Carson)等人，免疫学进展(Adv.Immunol.)38：274-311(1986)；江(Chiang)等人，生物技术(Biotechniques)7：360-66(1989)；科尔(Cole)等人，分子与细胞生物化学(Mol.Cell.Biochem.)62：109-20(1984)；琼斯(Jones)等人，自然(Nature)321：522-25(1986)；拉里克(Larrick)等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophys.Res.Commun.)160：1250-56(1989)；莫里森(Morrison)，免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)10：239-65(1992)；莫里森(Morrison)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Nat′lAcad.Sci.USA)81：6851-55(1984)；奥兰地(Orlandi)等人，美国国家科学院院刊(Pro.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.)86：3833-37(1989)；山杜(Sandhu)，生物技术重要评论(Crit.Rev.Biotechnol.)12：437-62(1992)；加比隆多(Gavilondo)和拉里克(Larrick)，生物技术(Biotechniques)29：128-32(2000)；休斯 顿(Huston)和乔治(George)，人类抗体(Hum.Antibodies.)10：127-42(2001)；齐皮亚诺伐(Kipriyanov)和勒高尔(Le Gall)，分子生物技术(Mol.Biotechnol.)26：39-60(2004)。
以下展示本发明的单克隆抗体和单链可变片段的实例，以及其编码核苷酸序列。
鼠类单克隆抗体的可变重链和轻链的氨基酸序列


















本发明的抗体可用于检测生物样品中环状信号传导肽的存在或测定环状信号传导肽的量。本发明的抗体也可用于预防性目的以防止哺乳动物受革兰氏阳性细菌感染或发展由革兰氏阳性细菌引起的疾病或病状。
本发明的医药组合物
本文中称为本发明的“活性剂”的本发明的免疫原性分子实体、包括免疫原性分子实体的超分子组合体或抗体可并入医药组合物中以投与哺乳动物。本发明的医药组合物可包括本发明的一种或多种活性剂(例如一种或多种抗体、免疫原性分子实体、超分子组合体或其组合)。本发明的医药组合物也可包括本发明的一种或多种活性剂以及另一种多肽或抗体疫苗。
举例来说，本发明的医药组合物可包括一种或多种免疫原性分子实体，其中半抗原包括金黄色葡萄球菌AIP-I、AIP-II、AIP-III或其任何组合的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物。因此，本发明的医药组合物可包括本发明的两种或两种以上免疫原性分子实体的组合，其中每一种都具有包括金黄色葡萄球菌AIP环肽信号传导分子的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原。
本发明的医药组合物可包括本发明的两种不同免疫原性分子实体：(1)第一种具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-I环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，且第二种具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-II、III或IV的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原；(2)第一种具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-II环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，且第二种具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-III或IV的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原；或(3)第一种具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-III环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，且第二种具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-IV的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原。
本发明的医药组合物也可包括本发明的三种不同免疫原性分子实体，例如：(1)第一种具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-I环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，第二种具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-II的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，且第三种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-III的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原；(2)第一种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-I环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，第二种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-II的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，且第三种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌 AIP-IV的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原；(3)第一种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-I环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，第二种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-III的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，且第三种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-IV的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原；(4)第一种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-II环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，第二种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-III的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，且第三种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-IV的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原。
本发明的医药组合物也可包括本发明的四种不同免疫原性分子实体，例如第一种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-I环状信号传导肽的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，第二种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-II的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原，第三种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-III的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原；且第四种免疫原性分子实体具有对应于金黄色葡萄球菌AIP-IV的内酯、内酰胺、尿素或氨基脲类似物的半抗原。
类似地，本发明的医药组合物也可包括特异性结合一种或多种环肽信号传导分子的一种或多种抗体。举例来说，本发明的医药组合物可包括与金黄色葡萄球菌AIP-I、AIP-II、AIP-III或AIP-IV环状信号传导肽中的任一种特异性结合的抗体。本发明的医药组合物可包括与两种或两种以上环状信号传导肽(例如金黄色葡萄球菌AIP-I、AIP-II、AIP-III或AIP-IV环状信号传导肽中的任何两种、三种或所有四种环状信号传导肽)特异性结合的两种或两种以上抗体。
本发明的医药组合物也可包括具有对应于来自一种或多种革兰氏阳性细菌的环状信号传导肽的半抗原的一种或多种免疫原性分子实体，以及与来自一种或多种使用群体感应的革兰氏阳性细菌的一种或多种环状信号传导肽特异性结合的一种或多种抗体。
本发明的医药组合物也可包括本发明的活性剂以及一种或多种针对不同感染剂的疫苗，所述感染剂包括(但不限于)乙型肝炎、流感嗜血杆菌b型细菌、白喉、麻疹、流行性腮腺炎、百日咳、脊髓灰质炎、风疹、破伤风、结核和水痘。
除上述外，本发明的医药组合物包括医药学上可接受的载剂。如本文中所使用，术语“医药学上可接受的载剂”包括(但不限于)任一种或多种溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、稳定剂、等张剂、佐剂和适合于投与哺乳动物的类似 物。医药学上可接受的载剂为所属领域所熟知，且除非常规载剂与本发明的免疫原性分子实体或抗体不相容，或与投药途径不相容，否则预期在本发明的组合物中使用所述载剂。
将本发明的医药组合物调配成与所选投药途径相容。投药途径的实例包括任何肠外投药途径，包括静脉内、皮内、皮下、吸入、经皮、经粘膜和直肠投药。
用于肠外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括：(1)无菌稀释剂，诸如注射用水、生理食盐水溶液、不挥发性油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；(2)抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；(3)抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；(4)螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；(5)缓冲液，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的药剂，诸如氯化钠或葡萄糖(dextrose)。pH值可用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)来调节。可将肠外制剂密封于安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射的医药组合物包括无菌水性溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内投药来说，合适的载剂包括生理食盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲生理食盐水。组合物必须是无菌的且在制造和贮存条件下稳定并且必须进行保藏以防诸如细菌和真菌等微生物的污染。载剂可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)和其合适混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用诸如卵磷脂等包衣，通过在分散液的情况下维持所需粒径和通过使用表面活性剂来实现。防止微生物的作用可使用例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞等各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现。可包括其它成分，诸如等张剂或延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)。
无菌可注射溶液可通过按需要将所需量的活性剂并入具有上述一种成分或成分的组合的适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备。分散液可通过将活性化合物并入含有基础分散介质和上述其它所需成分的无菌媒剂中来制备。在用于制备可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法包括真空干燥和冻干，由此从先前无菌滤液得到活性成分和任何其它所需成分的粉末。
口服组合物可包括惰性稀释剂或可食用载剂。可将其密封于明胶胶囊中或压缩成片剂。出于经口治疗性投药的目的，可将活性化合物与赋形剂合并且以片剂、糖衣锭或胶囊的形式使用。口服组合物也可使用流体载剂来制备。可包括医药相容性粘合剂和/或佐剂物质作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、糖衣锭等等可含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如海藻酸或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁；助流剂，诸如 胶态二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂(orange flavoring)。
对于通过吸入投药来说，组合物可以气溶胶喷雾的形式从含有合适推进剂(例如气体，诸如二氧化碳)的加压容器或分配器或雾化器传递。
对于经粘膜或经皮投药来说，可使用所属领域中已知适合于待渗透的屏障的渗透剂。这些渗透剂包括用于经粘膜投药的去污剂、胆汁盐和梭链孢酸(fusidic acid)衍生物，其可使用例如鼻用喷雾来实现。对于经皮投药来说，将本发明的活性剂调配成如所属领域中通常已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。
本发明的组合物可使用将防止从身体快速清除的载剂来制备。举例来说，诸如植入物和微囊封传递系统等控制释放调配物允许持续缓慢释放本发明的活性剂，且在一些情况下也释放免疫刺激剂。所述调配物的实例包括埋于脂质体乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(ethylene-vinyl acetate copolymer，EVAc)(参见尼美(Niemi)等人，实验室动物科学(LaboratoryAnimal Science)35：609-612(1985))和可降解聚合物中的本发明的活性剂。用于囊封的生物可降解的生物相容性聚合物包括(但不限于)聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(参见埃德里奇(Eldridge)等人，分子免疫学(Molecular Immunology)28：287-294(1991))。其它可使用的聚合物实例包括聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备所述调配物的方法对于所属领域的技术人员将显而易见。包括用病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的悬浮液的脂质体悬浮液也可用作医药学上可接受的载剂。这些悬浮液可使用所属领域中已知的方法来制备。
因此，经调配以引发免疫反应的组合物可包括佐剂以及其它载剂和媒剂。佐剂、载剂和媒剂的非限制性实例包括弗氏不完全佐剂(Freund′s incomplete adiuvant)；费氏完全佐剂(Freund′s complete adiuvant)；铝盐(例如硫酸钾、磷酸铝、氢氧化铝)；细菌脂多糖；合成聚核苷酸(聚IC/聚AU)；Montanide ISA佐剂(法国巴黎的塞皮克公司(Seppic，Paris，France))；里比氏佐剂(Ribi′s Adiuvant)(蒙大拿州汉弥尔顿的里比免疫化学研究公司(Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT))；亨特氏TiterMax(Hunter′s TiterMax)(佐治亚州诺克罗斯的CytRx公司(CytRx Corp.，Norcross，GA))；吸附硝基纤维素的蛋白质；格布氏佐剂(Gerbu Adiuvant)(德国盖贝格的格布生物技术公司(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)/加利福尼亚州波威的C-C生物技术公司(C-C Biotech，Poway，CA))；皂苷；胞壁酰基二肽和胞壁酰基三肽；单磷酰基脂质A；百日咳博德氏杆菌(Bordetella pertussis)；细胞激素；细菌类毒素；脂肪酸；活载体；矿物油乳液；生物可降解油乳液(例如含有花生油、角鯊烯或角鯊烷的乳液)；非离子 性嵌段共聚物表面活性剂；脂质体和生物可降解聚合物微球体。例如参见，埃德里奇(Eldridge)等人，分子免疫学(Mol Immunol.)28：287-94(1991))。其它疫苗传递系统的实例在以下文献中有论述：费那罗瓦(Felnerova)等人，生物技术新见(Current Opinion in Biotechnology)15：518-29(2004)；绍珀(Saupe)等人，药物传递的专家意见(Expert Opin.Drug Deliv.)3：345-54(2006)；萨卡罗-达特斯缇斯(Sakarellos-Daitsiotis)等人，医药化学的当前论题(Current Topics in Medicinal Chemistry)6：1715-1735(2006)；陈(Chen)和黄(Huang)，遗传学进展(Advances in Genetics)54：315-37(2005)；韦斯特费德(Westerfeld)和楚尔布里根(Zurbriggen)，肽科学杂志(J.Peptide Sci)11：707-712(2005)；莎海瓦拉(Shahiwala)等人，药物传递和配方的最新专利(Recent Patents on Drug Delivery&Formulation)1：1-9(2007)；和麦德默(McDermott)等人，免疫学与细胞生物学(Immunology and Cell Biology)76：256-62(1998)；所述文献的内容以引用的方式并入本文中。
组合物可以单位剂型形式调配以便于投药和剂量的均匀性。短语“单位剂型”是指适合作为用于待治疗的个体的单剂量(unitary dosage)的实体上不连续单位，各单位含有经计算以产生所需治疗作用的预定数量的活性化合物以及所需医药载剂。关于单位剂型的说明书视活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗作用而定。
试剂盒和制品
本发明的活性剂或医药组合物可与使用说明书一起容纳于容器、包装或分配器中。所述试剂盒可包括按需要用于免疫原性分子实体、抗体或医药组合物的预期用途的其它试剂。举例来说，本发明的抗体可用于诊断目的，在所述情况下，一种或多种能够检测/观察的试剂可包括在试剂盒中，优选地包括在与容纳本发明的抗体的容器、包装或分配器分开的容器、包装或分配器中。所述试剂盒或制品可包括关于其用于如下文所述的诊断、预防性和/或治疗性目的的说明书。
本发明的方法
本发明提供一种鉴别易患或患有与革兰氏阳性细菌感染相关的疾病或病状的哺乳动物的方法，以及一种预防革兰氏阳性细菌感染或其相关疾病或病状的方法。本发明还提供一种引发哺乳动物的免疫反应的方法和一种防止哺乳动物体内的群体感应的方法。
在本发明的上下文中，哺乳动物为任何温血脊椎动物，包括例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、天竺鼠、猪、母牛、马、绵羊、猴和人类。革兰氏阳性细菌为任何在群体感应中利用环肽作为信号传导分子的细菌且可为例如粪肠球菌和葡萄球菌种，包括例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、耳葡萄球菌、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、肉葡萄球菌、阿 莱塔葡萄球菌、科氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、中间葡萄球菌、里昂葡萄球菌、模仿葡萄球菌、禽葡萄球菌、木糖葡萄球菌和瓦氏葡萄球菌。与所述细菌感染相关的疾病或病状包括例如食物中毒、中毒性休克综合征、烫伤样皮肤综合征、手术创伤感染、尿路感染、败血症和肺炎。
诊断方法
本发明的诊断方法可用于鉴别需要或可受益于使用本发明的免疫原性分子实体或抗体进行治疗的哺乳动物。需要或可受益于使用本发明的免疫原性分子实体或抗体进行治疗的哺乳动物是具有革兰氏阳性细菌感染或易感染或易患与革兰氏阳性细菌感染相关的疾病或病状的哺乳动物。为了鉴别所述哺乳动物，可从所述哺乳动物获得生物样品。所述生物样品可为组织样品、细胞样品或诸如血液、尿或淋巴等生物流体的样品。本发明的抗体可用于确定生物样品是否含有环肽信号传导分子，存在所述分子指示哺乳动物具有革兰氏阳性细菌感染或易患或患有与革兰氏阳性细菌感染相关的疾病或病状。举例来说，本发明的与金黄色葡萄球菌AIP-IV信号传导肽特异性结合的抗体可用于检测来自怀疑易患或患有与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病或病状的哺乳动物生物样品中金黄色葡萄球菌AIP-IV的存在。样品中存在金黄色葡萄球菌AIP-IV指示哺乳动物具有金黄色葡萄球菌感染或易患或患有与金黄色葡萄球菌感染相关的疾病或病状。因此，本发明的抗体可在诊断上用于检测哺乳动物生物样品中环肽信号传导分子的存在和/或确定环肽信号传导分子的量。
哺乳动物生物样品中环肽信号传导分子的存在或量可在使用本发明的经适当标记的抗体的竞争性测定中检测。举例来说，可将本发明的免疫原性分子实体(例如与诸如多肽等大分子载体连接的半抗原)固定在表面上。确定在哺乳动物生物样品存在或不存在下，本发明的经适当标记的抗体与所固定的免疫原性分子实体的结合。在生物样品存在下经标记抗体与表面的结合减少指示存在环肽信号传导分子。生物样品可为已移除无关哺乳动物细胞的经部分纯化或处理的样品。可用可检测分子标记抗体，所述分子可为酶，诸如碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；辅基，诸如抗生蛋白链菌素、生物素或抗生物素蛋白；荧光基团，诸如丹黄酰氯、二氯三嗪基胺、二氯三嗪基胺荧光素、荧光素、异硫氰酸荧光素、藻红素、若丹明(rhodamine)、散形酮(umbelliferone)；发光基团，诸如鲁米那(luminal)；生物发光基团，诸如水母发光蛋白、荧光素酶和荧光素；或放射性同位素，诸如³H、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S。
治疗方法
本发明的免疫原性分子实体或抗体可用于预防或治疗在群体感应中利用环肽信号 传导分子的革兰氏阳性细菌(例如葡萄球菌种)对哺乳动物的感染。可得益于用本发明的免疫原性分子实体或抗体进行治疗的哺乳动物包括：(1)处于革兰氏阳性细菌感染危险中或易感染革兰氏阳性细菌的哺乳动物；(2)与感染性革兰氏阳性细菌接触的哺乳动物；或(3)受革兰氏阳性细菌感染的哺乳动物。为了预防或治疗革兰氏阳性细菌感染，可向哺乳动物投与本发明的免疫原性分子实体以引发所述哺乳动物的免疫反应。另外，可投与本发明的抗体以抑制环状信号传导肽的活性，从而防止辅助细菌感染或发展与细菌感染相关的疾病病状的毒力基因或毒素的产生。
可得益于用本发明的免疫原性分子实体或抗体进行治疗的哺乳动物可使用确定环肽信号传导肽的存在和/或量的上述方法加以鉴别。可使用其它检测革兰氏阳性细菌感染的存在的方法，例如通过培养哺乳动物样品，例如血液培养来进行。可得益于用本发明的免疫原性分子实体或抗体进行治疗的哺乳动物(诸如人类)可为具有变弱免疫系统的个体、具有受抑制免疫系统的个体、已经历或将经历手术的个体、年纪大的个体或病得很重的个体、已住院或已经历医疗程序的个体。可得益于用本发明的免疫原性分子实体或抗体进行治疗的哺乳动物可为处于发展医院感染的危险中的医院患者或已知感染或已暴露于耐抗生素细菌的哺乳动物，所述耐抗生素细菌例如耐二甲氧苯青霉素(Methicillin)的金黄色葡萄球菌、万古霉素(Vancomycin)中度敏感性金黄色葡萄球菌、耐万古霉素的金黄色葡萄球菌和其它耐抗生素肠球菌，包括肺炎球菌(Pneumococcus pneumoniae)。
本发明的抗体或免疫原性分子实体可在感染之前投与，在感染之后但在与感染相关的症状表现之前投与，或在症状表现之后投与以进一步防止细菌繁殖且防止毒力基因进一步表达，从而阻止疾病或其进程的发展。当投与哺乳动物时，本发明的免疫原性分子实体引发产生预防疾病或病状或其进程的抗体，这是通过所述抗体与细菌所产生的环肽信号传导分子结合和中和环肽信号传导分子来进行，从而防止辅助发展感染或与细菌感染相关的疾病病状的毒力基因或毒素的产生。另外，也可向哺乳动物投与本发明的中和抗体。所述中和抗体可与细菌所产生的环肽信号传导分子结合且防止其与其细胞相关受体结合并且这时防止辅助感染或发展与细菌感染相关的疾病病状的毒力基因或毒素的产生。因此，包括本发明的免疫原性分子实体的组合物可用作活疫苗，而包括本发明的抗体的组合物可用作被动疫苗，以预防细菌感染或与细菌感染相关的疾病或病状。
本发明的活性剂可通过本文所论述的任何途径来投与。待投与哺乳动物的免疫原性分子实体或超分子组合体的剂量可为任何适合于引发针对环状信号传导肽的免疫反应的数量。待投与哺乳动物的抗体的剂量可为任何适合于中和环状信号传导肽的活性的数 量。
所述剂量可为有效剂量或其适当部分。这将视个别患者参数而定，包括年龄、身体情况、体型、体重、所治疗的病状、病状的严重程度和任何同时进行的治疗。确定适当剂量的因素为所属领域的技术人员所熟知且可使用常规实验来解决。举例来说，可使用标准化学和生物学测定且通过使用化学、药理学和毒理学技术中已知的数学建模技术来确定物理化学、毒理学和药物动力学性质。治疗效用和给药方案可从所述技术的结果且通过使用适当药物动力学和/或药效学模型来推断。
投与患者的精确量将由主治医生负责。本发明的免疫原性分子实体或抗体可通过注射每公斤哺乳动物体重约0.05mg到约2000mg、优选每公斤哺乳动物体重约1mg到约200mg的剂量来投与。因为本发明的某些药剂具有长效作用，所以第一天宜投与80mg到4，000mg的初始剂量，接着在随后几天投与20mg到1，000mg的较低剂量。患者也可出于医学原因、心理原因或出于几乎任何其它原因而坚持较低剂量或可耐受剂量。可在第一次投药后的所选时间投与一个或多个加强剂量的免疫原性分子实体或抗体。
使用本发明的抗体或免疫原性分子实体进行治疗可历时引发有效中和免疫反应所需的持续时间。
产生本发明的抗体的方法
本发明的免疫原性分子实体或超分子组合体可用于产生针对环状信号传导肽的抗体。
本发明的免疫原性分子实体或超分子组合体可用于筛选重组免疫球蛋白文库以鉴别与所选环状信号传导肽特异性结合的抗体。用于产生和筛选重组组合性免疫球蛋白文库的方法和试剂例如在以下文献中有描述：C.F.巴尔巴斯(Barbas，C.F.)，第3，D.R.伯顿(D.R.Burton)，J.K.斯科特(J.K.Scott)，和G.J.斯尔弗曼(G.J.Silverman)，噬菌体呈现-实验室手册(Phage Display-A Laboratory Manual.)2001，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，New York)：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，和R.科特曼(Kontermann，R.)，S.杜贝(Dübel，S.)，抗体工程(Antibody Engineering)，2001，柏林海德堡(Berlin，Heidelberg)：施普林格出版社(Springer-Verlag)。
本发明的免疫原性分子实体或超分子组合体也可用于引发哺乳动物的免疫反应，可从所述哺乳动物获得多克隆或单克隆抗体。可向诸如山羊、绵羊、大鼠、小鼠或兔等哺乳动物投与本发明的免疫原性分子实体或超分子组合体。可使用所属领域中已知的方法，从哺乳动物的血液中分离出多克隆抗体。单克隆抗体可通过从哺乳动物中分离出产生抗体的细胞且产生产生抗体的杂交瘤来获得。从哺乳动物中产生和获得抗体的方法为 所属领域中已知。例如参见，D.哈洛(Harlow，D.)和D.莱安(D.Lane)，抗体实验室手册(Antibodies A laboratory manual.)纽约冷泉港实验室(Cold spring harbor laboratory，New York)(1988)，和A.特拉蒙塔诺(Tramontano，A.)和D.施罗德(D.Schloeder)，制造模拟酶催化活性的抗体(Production of antibodies that mimic enzyme catalytic activity).酶学方法(Methods Enzym0l)178：第531-550页(1989)。
本发明通过以下非限制性实例来进一步说明。
实例
实例1-材料
从理查德P.诺维卡(Richard P.Novick)博士(纽约大学医学中心的史葛柏研究所(Skirball Institute，New York University Medical Center))获得RN4850。从斯克利普斯研究所(TSRI)抗体制造核心设施获得纯化的单克隆抗体。通过由国家过敏和传染病研究所(NIAID)/国家健康研究所(NIH)支助的金黄色葡萄球菌抗微生物耐药性网络(Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus，NARSA)计划(NO1-AI-95359)获得临床分离株NRS168。
实例2-天然AIP1-4的合成
使用以下通用程序来合成所有天然产物。按照标准Boc固相肽合成方案，在0.25mmol用二甲基甲酰胺(DMF)膨胀的4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂上分批合成。制备含S-三苯甲基-3-巯基丙酸(2当量)、六氟磷酸苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲(HBTU)(3.9当量)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(0.5mL)的4mL DMF溶液且使其静置3分钟以进行预活化。将混合物添加到树脂中以进行偶合，这一般在1小时内完成。接着用DMF洗涤树脂且用5％三异丙基硅烷(TIS)的三氟乙酸(TFA)溶液脱除三苯甲基保护基(2×10分钟)。用DMF洗涤后，通过在3分钟预活化情况下，使用4当量Boc氨基酸、3.9当量HBTU和0.5mL DIEA依序进行偶合反应来完成肽序列。当合成完成时，用DMF、接着CH₂Cl₂洗涤，且最后用乙醚洗涤树脂，随后将其放入干燥器中。
裂解：使用苯甲醚作为净化剂，使树脂接触5-10mL HF历时1小时。用乙醚洗涤所得混合物且用1∶1水/乙腈萃取。冷冻且冻干这一溶液，并通过制备型高效液相色谱法(HPLC)纯化所得固体。将纯部份混合、冷冻且冻干。
硫内酯化：通过将纯化的固体线性肽溶解于80％3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)缓冲液(100mM，pH7.0)与20％乙腈的混合物中来分子内硫内酯化，产生小于1mM的肽浓度。通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)监测反应，且通常在24-48小时内完成。通过制备型HPLC纯化产物。将纯部份混合、冷冻且冻干。ESI-MS：m/z AIP-1，C₄₃H₆₀N₈O₁₃S₂ (M+H)，计算值为961.4；实验值为961.8：m/z AIP-2，C₃₈H₅₈N₁₀O₁₂S(M+H)，计算值为879.4；实验值为879.6：m/z AIP-3，C₃₈H₅₈N₈O₁₀S(M+H)，计算值为819.4；实验值为819.7：m/z AIP-4，C₄₈H₆₄N₈O₁₂S₂，计算值为1009.4；实验值为1009.7。参见图2A-H。
实例3-AIP4半抗原5-AIP4内酯类似物的合成
合成AIP4半抗原5的流程在以下流程1中描绘。使用标准Fmoc化学，利用二异丙基碳化二亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)作为偶合剂，在预装填有Fmoc-甲硫氨酸1的2-氯三苯甲基树脂上合成线性肽YSTSYFIM(SEQ ID NO：1，不包括保护基)。合并N端侧位半胱氨酸以与载体蛋白结合且在半抗原与载体蛋白之间添加短的可弯曲连接子作为间隔基。使用4％三氟乙酸的氯仿溶液，从树脂中释放出受保护的线性肽，这也从丝氨酸中选择性移除三苯甲基保护基。在稀释条件下使用二氯乙烷(EDC)/4-二甲氨基吡啶(4-DMAP)进行分子内酯化，且随后侧链脱除保护基，得到AP4半抗原5。下文描述合成程序的详情。
流程1AP4半抗原5的合成

SEQ ID NO：1(YSTSYFIM，不包括保护基)
线性保护肽(3)的合成
所有用于肽合成的N上受α-Fmoc保护的氨基酸、偶合剂和树脂都是购自EMD生物科学公司(EMD Biosciences，Inc.)(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego，CA))。所有其它化学品都是购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Corp.)(密苏里州圣路易斯(St. Louis，MO))。使用API150EX(PE SCIEX公司，加利福尼亚州福斯特城(Foster City，CA))进行ESI-MS分析，且分别使用日立(HITACHI)L-7300和岛津(SHIMADZU)SCL-10A进行分析型和制备型HPLC实验。
通过Fmoc SPPS，在预装填有Fmoc-Met1的2-氯三苯甲基树脂上合成肽。在内酯化的位置处合并Fmoc-Ser(Trt)-OH。选择侧链保护基对稀TFA稳定且在95％TFA中不稳定的所有其它残基。通过偶合Fmoc-8-胺基-3，6-二氧杂辛酸，在N端倒数第二个位置处合并短的可弯曲连接子。N端残基为最后用于与载体蛋白结合的Boc-Cys(Set)-OH。
特定条件：在1mmol用DMF膨胀的树脂上分批合成历时至少1小时。制备含受保护的氨基酸、DIC和HOBt(各4当量)的5mL DMF溶液且使其静置5分钟以进行预活化，随后添加0.5mL2，4，6-三甲基吡啶(sym-collidine)。将混合物添加到树脂中以进行偶合，这一般在1小时内完成。接着用DMF洗涤树脂且用20％(v/v)哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基(2×7分钟)。接着用DMF洗涤树脂且进行下一偶合反应。当合成完成时，用DMF、接着CH₂Cl₂洗涤，且最后用乙醚洗涤树脂，随后将其放入干燥器中。
裂解(和脱除三苯甲基保护基)：将树脂添加到4％TFA、4％三异丙基硅烷(TIS)和0.5％H₂O于氯仿中的混合物中并震荡6小时。过滤混合物，将滤液滴入冷乙醚中以使肽沉淀。离心乙醚混合物且倾析上清液。接着通过使固体再悬浮于乙醚中、离心并倾析上清液来用乙醚洗涤肽(2次)。将所得固体放入干燥器中。
纯化：将充分受保护的肽3溶解于二氯甲烷中且通过正相硅胶色谱法，用5％甲醇的二氯甲烷溶液洗提来纯化。
B.(3)的内酯化
将受保护的线性肽3溶解于1，2-二氯乙烷(预先经无水MgSO₄干燥)中，产生不大于1.0mM的最终浓度。搅拌溶液且加热到80℃并添加各3当量的EDC和4-DMAP；在24和48小时时向反应物中添加各另一当量的EDC和4-DMAP。通过HPLC监测反应。4天后，将反应混合物冷却到室温，用2×200mL0.2M KHSO₄(水溶液)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥，且蒸发至干。通过制备型HPLC纯化环化肽4。如通过分析型HPLC积分所测定，产率在的30-60％的范围内。
C.(4)的总体脱除保护基和脱除二硫键保护基
将纯化的肽固体溶解于含有2％TIS的TFA中且搅拌1小时。接着蒸发混合物至干。添加水且冷冻和冻干混合物。接着将冻干固体溶解于含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)的H₂O中。搅拌混合物1小时且直接注入制备型HPLC中进行纯化，产生AP4半抗原5。 将所收集的纯部份混合、冷冻且冻干。ESI-MS：m/z C₅₇H₈₀N₁₀O₁₇S₂(M+H)，计算值为1241.5；实验值为1242.2。参见图2I和J。
D.(5)与KLH/BSA的结合
如以下流程2中所示，使半抗原5与KLH/BSA结合。下文描述程序的详情。
流程2半抗原5与KLH/BSA的结合

SEQ ID NO：2(INSDFLL，不包括保护基)
磺酸基-SMCC的连接。将5mg载体蛋白再悬浮于0.9mL磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)(pH7.4)中。向这一溶液中添加1mg连接子磺酸基-SMCC(4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸磺酸基丁二酰亚胺酯)。搅拌溶液6-8小时且通过在4℃下用PBS透析来纯化蛋白质-连接子结合物。
半抗原5的结合。向蛋白质-连接子结合物的PBS溶液中添加100μL含有2mg半抗原5的DMF。震荡溶液过夜且通过透析纯化蛋白质-半抗原结合物。基质辅助激光解吸附电离-飞行时间(MALDI-TOF)分析证实平均每个BSA分子连接约6个半抗原(BSA-AIP4结合物的分子量＝75581道尔顿；BSA＝67000道尔顿；且半抗原＝1461.15 道尔顿)。参见图2K。
实例4-作为合成半抗原的AP1、AP2、AP3和AP4内酯类似物和半抗原-蛋白质载剂结合物的制备
对于免疫和引发免疫反应、活性疫苗和产生单克隆抗体来说，使用如制备上述AP4半抗原5所述的程序来制备呈AP1、AP2、AP3和AP4内酯类似物形式的合成半抗原和半抗原-蛋白质载剂结合物。制备流程如下。
流程3
制备合成半抗原(AP1)以用于免疫和引发免疫反应/活性疫苗/产生针对AIP-1的单克隆抗体

SEQ ID NO：3(YSTSDFIM，不包括保护基)
流程4
制备合成半抗原(AP2)以用于免疫和引发免疫反应/活性疫苗/产生针对AIP-2的单克隆抗体

SEQ ID NO：4(GVNASSSLF，不包括保护基)
流程5
制备合成半抗原(AP3)以用于免疫和引发免疫反应/活性疫苗/产生针对AIP-3的单克隆抗体

SEQ ID NO：2(INSDFLL，不包括保护基)
流程6
制备合成半抗原(AP4)以用于免疫和引发免疫反应/活性疫苗/产生针对AIP-4的单克隆抗体

SEQ ID NO：1(YSTSYFIM，不包括保护基)
流程7
制备半抗原-蛋白质载剂结合物以用于免疫和引发免疫反应/活性疫苗/产生AIP-1-AIP-4的单克隆抗体

实例5-作为合成半抗原的AP4内酰胺、尿素和氨基脲类似物的制备
使用已充分证明的肽环化方法，在碱不稳定的凯撒(Kaiser)肟树脂上制备蛋白水解稳定的环状内酰胺、尿素和氨基脲AIP肽半抗原。参见迪格拉德(DeGrado)等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)1980，45，1295-1300；迪格拉德(DeGrado)等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)1982，47，3258-3261；中川(Nakagawa)等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)1983，48，678-685；中川(Nakagawa)等人，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)1985，107，7087-7092；凯撒(Kaiser)等人，科学(Science)1989，243，187-192。这种合 成方法是根据Boc基固相肽合成，其中肽环化与环化肽从固体支撑物上裂解同时发生。奥斯柏(Osapay)等人，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)1992，114，6966-6973；泰勒(Taylor)等人，生物聚合物(Biopolymers)2002，66，49-75；和李(Li)等人，现代有机化学(Curr.Org.Chem.)2002，6，411-440。如文献中所述，环状尿素肽的合成需要逆反基序(retro-inverso motif)。库乐维(Chorev)等人，生物聚合物(Biopolymers)2005，80，67-84。从市售Boc-甲硫氨醇合成首要的1-N-Boc-4-(甲硫基)丁烷-1，2-二胺基本组分且接着根据文献先例，通过硝基苯基氨基甲酸酯方案偶合到肽链上。文斯(Vince)等人，生物有机化学和药物化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)1999，9，853-856。以下流程概述AIP-4肽的蛋白水解稳定的环状内酰胺、尿素和氨基脲类似物的合成。这些合成方法可应用于制备其它环肽半抗原，例如AIP-1、AIP-2、AIP-3以及其它葡萄球菌群体感应肽。
流程8中概括环状内酰胺AIP4半抗原的合成。流程9和10分别概述用于合成环状尿素AIP4半抗原和环状氨基脲AIP4半抗原的中间物对硝基苯基氨基甲酸1-N-Boc-4-(甲硫基)丁烷-1，2-二胺和对硝基苯基氨基甲酸N-Fmoc-Met-酰肼的合成。流程11和12中分别展示尿素和氨基脲AIP4半抗原的合成。
流程8

SEQ ID NO：1(YSTSYFIM，不包括保护基)
流程9

流程10

流程11

SEQ ID NO：1(YSTSYFIM，不包括保护基)
流程12

SEQ ID NO：1(YSTSYFIM，不包括保护基)
实例6-金黄色葡萄球菌的外蛋白分泌的分析
在37℃下在琼脂平板上生长过夜后，将金黄色葡萄球菌的单个群落(RN4850或Wood46)接种于3mL CYGP培养基中且生长过夜(18小时)(参见诺维卡(Novick)，酶学方法(Methods Enzymol)204：587-636(1991))。用新鲜CYGP培养基将过夜培养的细胞稀释到OD₆₀₀≈0.03，且分配到5mL聚苯乙烯细胞培养管中，其中各管含有0.5mL稀释的细胞和适当抗体(0.2mg/mL)。在37℃下在加湿恒温箱中无搅拌生长20-24小时后，将样品转移到微量离心管(1.5mL)中且在13，000rpm下离心5分钟。通过经-GV过滤装置(0.22μm；爱尔兰的密理博公司(Millipore，Ireland))过滤来对上清液灭菌，且通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(10％Bis-Tris凝胶，加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad CA))进行分析。为证实α-溶血素和蛋白A表达，使用结合辣根过氧化物酶(HRP)的绵羊多克隆α-溶血素抗体(马萨诸塞州坎布里奇的艾宾公司(abeam Inc.，Cambridge MA))和抗蛋白A小鼠单克隆抗体(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis MO))执行西方印迹分析(Western blot analysis)且使用鼠类mAb SP2-6E11(帕克真达公司(Park and Janda)，未公开的资料)作为对照抗体。为测试溶血活性，将金黄色葡萄球菌上清液(75μL×3)涂覆于绵羊血琼脂板上，且在37℃下培育所述板18小时并在室温下再培育24小时。
实例7-静态生物膜分析
通过按照文献程序，经少许修改来进行生物膜测定(参见奥图(O′Toole)，酶学方法(Methods Enzymol)310：91-109(1999))。在聚苯乙烯96孔板中使金黄色葡萄球菌细胞(200μL)在含有0.2％葡萄糖且存在或不存在抗体(0.2mg/mL)的胰蛋白酶大豆肉汤(tryptic soy broth，TSB)培养基中无搅拌生长20-24小时后，通过浸入水中来洗涤所述板并干燥。添加结晶紫溶液(200μL，0.1％水溶液)以使生物膜染色，且接着用水剧烈洗涤板，随后添加乙酸(250μL，30％水溶液)以溶解残余结晶紫。使用Spectramax250(加利福亚州桑尼维尔的分子仪器公司(Molecular Devices，Sunnyvale CA))在570nm下测量吸光度。
实例8-实时-PCR分析
用含有抗体的新鲜CYGP培养基(1mL)将过夜培养的金黄色葡萄球菌RN4850细胞稀释到OD₆₀₀≈0.03且在37℃下无震荡生长20-24小时(OD₆₀₀≈2)。根据制造商的说明书，使用微型试剂盒(加利福尼亚州巴伦西亚的凯杰公司(QIAGEN Inc.，Valencia CA))从细胞中分离出RNA。通过在室温下用无核糖核酸酶(Rnase)的脱氧核糖核酸 酶(Dnase)(凯杰公司(QIAGENE Inc.))处理30分钟来进一步纯化分离的RNA。使用用于RT-PCR的Superscript^TM第一链合成系统(英杰公司(Invitrogen))，使用约300ng纯化RNA来合成第一链DNA。用至少两种独立样品进行RT-PCR实验，且使用FastStart DNA Master^PLUs SYBR Green I(印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏应用科学公司(Roche Applied Science，Indianapolis，IN))进行各实验，一式两份。对于PCR条件使用通用SYBR Green方案(罗氏公司(Roche))，且使用2.0系统(罗氏应用科学公司(Roche Applied Science))，执行相对定量分析，使用看家GyrA基因作为参照物。所用的引物序列如下：
gyrA F：5′-TGGCCCAAGACTTTAGTTATCGTTATCC-3′(SEQ ID NO：5)；
gyrA R：5′-TGGGGAGGAATATTTGTAGCCATACCTAC-3′(SEQ ID NO：6)；
rnaIII F：5′-GCACTGAGTCCAAGGAAACTAACTC-3′(SEQ ID NO：7)；
rnoIII R：5′-GCCATCCCAACTTAATAACCATGT-3′(SEQ ID NO：8)；
hla F：5′-CTGAAGGCCAGGCTAAACCACTTT-3′(SEQ ID NO：9)；
hla R：5′-GAACGAAAGGTACCATTGCTGGTCA-3′(SEQ ID NO：10)；
spa F：5′-GCGCAACACGATGAAGCTCAACAA-3′(SEQ ID NO：11)；
spa R：5′-ACGTTAGCACTTTGGCTTGGATCA-3′(SEQ ID NO：12)；
eta F：5′-GTTCCGGGAAATTCTGGATCAGGT-3′(SEQ ID NO：13)；
eta R：5′-GCGCTTGACATAATTCCCAATACC-3′(SEQ ID NO：14)；
sarA F：5′-CTGCTTTAACAACTTGTGGTTGTTTG-3′(SEQ ID NO：15)
sarA R：5′-CGCTGTATTGACATACATCAGCGA-3′(SEQ ID NO：16)；
saeR F：5′-CGCCTTAACTTTAGGTGCAGATGAC-3′(SEQ ID NO：17)；
saeR R：5′-ACGCATAGGGACTTCGTGACCATT-3′(SEQ ID NO：18)。
实例9-小鼠皮肤感染模型
所有关于小鼠的实验都根据TSRI准则和条例执行。从查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)获得6-8周龄的SKH1有胸腺无毛小鼠且在用于实验之前饲养在生物防护人工动物园(biocontainment vivarium)中一周。如诺维卡(Novick)，酶学方法(Methods Enzymol)204：587-636(1991)所述，脑心浸液琼脂来自BBL(#211065)且CYGP肉汤含有1％酪蛋白氨基酸(费雪公司(Fisher)B P1424)1％酵母提取物(EMD公司(EMD)1.03753)0.59％氯化钠、0.5％葡萄糖和60mM磷酸β-甘油酯二钠盐(Fluka50020)。在20℃下将Cytodex 1珠粒(通用电气医疗集团(GE Healthcare)17-0448-01)悬浮(50mL中1克)于无钙/镁的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲生理食盐水(Dulbecco′s Phosphate Buffered  Saline)(吉布可公司(Gibco))中过夜。倾析上清液且通过悬浮于杜尔贝科氏磷酸盐缓冲生理食盐水(DPBS)中以及1G沉降，随后高压处理(121℃、15psi、15分钟)来洗涤珠粒三次。在35℃下使来自冷冻储备液(脑心浸液(BHI)+20％甘油)的金黄色葡萄球菌RN4850(AIP4)在脑心浸液琼脂平板上生长过夜。合并3个代表性群落以接种于2mL CYGP肉汤中，且无震荡培育过夜后，使用0.25mL培养物接种于5mL CYGP中，随后在35℃、200rpm下培育3小时。在4℃、1，300×G下离心培养物20分钟，倾倒出上清液，并将细菌颗粒悬浮于1mL无钙/镁的DPBS中。SKH1接受200μL含有金黄色葡萄球菌(1×10⁷个或1×10⁸个细菌)、4μL包装体积Cytodex珠粒、DPBS、抗AIP4抗体或对照IgG(0.6mg或0.06mg)的皮内侧腹注射液(intradermal flank injection)。其它对照动物接受200μL含有Cytodex珠粒或珠粒加抗体的皮内注射液。进行注射后，经4-7天时间，每天监测小鼠至少三次。在监测期结束时，使小鼠安乐死且收集组织以进行细菌学和组织学分析。
实例10-用AP4-24H11使小鼠被动免疫
将金黄色葡萄球菌RN4850在-80℃下贮存于20％甘油/BHI培养基中，解冻且在BHI琼脂平板上生长过夜，并且对3个独立群落取样以接种于2mL CYGP培养基中。在35℃下无震荡维持接种物培养物1小时，随后在200rpm下震荡3小时。将新鲜生长的接种物培养物的等分试样转移到50mL圆锥形聚丙烯管中的5mL CYGP培养基中(1/20稀释度)，随后在200rpm、35℃下震荡3小时。通过在4℃下在3，000rpm(1300×G)下离心10分钟来使细菌成粒。将细菌颗粒再悬浮于无钙或镁的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲生理食盐水中(DPBS^-)，且使用彼得罗夫-霍泽计数室(Petroff-Hausser counting chamber)计数。最后用DPBS^-稀释以致以0.5mL经腹膜内投与3×10⁸个细菌。为维持存活力，在收集两小时内投与细菌。
以DPBS溶液形式向SKH1小鼠(6-9周龄；每个处理组6只动物)经腹膜内投与Mab AP4-24H11、同型匹配的对照IgG(各1mg)或DPBS，两小时后经腹膜内投与0.5mL含有3×10⁸个金黄色葡萄球菌的DPBS^-。在注射当天监测小鼠数次且在随后几天每天监测两次，观察走动、警惕性、操作反应和由红外线温度测量法(Raytek MiniTemp MT4)使用1cm直径胸骨下皮肤部位测量的皮肤温度。将显示体表温度始终低于30℃并且操作反应减少以及正位反射减弱的动物视为濒临死亡且进行安乐死。
实例11-竞争性ELISA分析
测定AP4-BSA结合物以及各mAb的最佳浓度。分别用适量AP4-BSA结合物涂布96孔ELISA板。用4％脱脂乳阻断所述板，洗涤且添加预定最佳浓度的mAb。洗涤板且 将以100μM开始的一系列浓度的游离抗原(即天然AIP1-4)添加到孔中。在37℃下培育板1小时，充分洗涤且添加山羊抗小鼠-辣根过氧化物酶(HRP)结合物(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce，Rockford，IL))。在室温下培育1小时后，再次充分洗涤板且添加HRP底物(TMB底物试剂盒；皮尔斯公司(Pierce))，使反应进行15分钟且通过添加2M H₂SO₄来中止。读取450nm下的吸光度且使用GraFit(艾里沙克斯软件公司(Erithacus Software Ltd))将值绘成图。将吸光度值是最大吸光度的50％的游离抗原浓度视为抗体对于其抗原的K_d值。
实例12-抗AP4单克隆抗体的产生
根据所报道的AIP-4结构信息(梅维尔(Mayville)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Ncad.Sci.U.S.A.)96：1218-1223(1999))，设计且合成半抗原AP4-5以引发小鼠的抗AIP-4抗体免疫反应(流程1)。关于以化学方法从天然硫内酯转变为含有内酯的半抗原的基本原理是基于内酯的较大酰胺水解稳定性。这一策略确保在免疫过程和随后免疫反应期间半抗原结合物在结构上保持完整；由此，避免产生如先前对于其它QS分子所揭露的具有未知化学和生物学性质的降解产物。这种替代还防止保守性硫内酯与侧位半胱氨酸巯基之间可能发生分子内巯基交换。因此，在位置4处合并Fmoc-丝氨酸(Trt)-OH以替代天然半胱氨酸残基。
通过双功能连接子使半抗原5与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)结合(流程2)。使用标准方案，用KLH结合物使Balb/c小鼠免疫(参见考夫曼(Kaufmann)等人，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)128：2802-03(2006))。总的说来，所述免疫产生中等效价(1600-3200)，且基于ELISA分析选择20种单克隆抗体(mAb)。
在这些抗体中，测定3种AP4-mAb的结合亲和力。使用竞争性ELISA方法，测定其针对所有四种天然AIP的结合亲和力，展示于下表中。
如竞争性ELISA所测量的所选AP4单克隆抗体的结合常数
AP4-mAbAIP-1AIP-2AIP-3AIP-423E6≈6μM＞25μM＞25μM≈390nM24H11≈5μM＞25μM＞25μM≈90nM29E10≈3μM＞25μM＞25μM≈24nM
所有结合常数至少测量两次且展示平均值。虽然AP4-29E10对AIP-4具有较高亲和力，但由于在蛋白质产生期期间所遇到的技术困难，而不选择其进行进一步生物学评估。
AP4-24H11具有较强结合亲和力(K_d AIP-4≈90nM)和对于AIP-4的高特异性，同 时显示对于其它AIP的极小交叉反应性(K_d AIP-1≈5μM，K_d AIP-2＝＞25μM，K_d AIP-3＝＞25μM)。值得注意的是AP4-24H11区分AIP1与AIP4的能力，因为这两种寡肽仅在位置5处不同，在AIP-1中是天冬氨酸残基而在AIP-4中是酪氨酸部分。选择AP4-24H11进行进一步生物学评估。
实例13-AP4-24H11改变金黄色葡萄球菌的毒力因子表达
α-溶血素和蛋白A是金黄色葡萄球菌的两种主要毒力因子，且这些蛋白质的表达受金黄色葡萄球菌信号传导网(包括基于AIP的agr QS系统)严格调控。所述agr QS系统正调控α-溶血素的表达，而蛋白A的产生受QS信号传导向下调控。
为确定抗AIP抗体是否能够干扰金黄色葡萄球菌的QS信号传导，检验抗AIP-4mAbAP4-24H11是否可调节IV型agr菌株(RN4850和NRS168)的α-溶血素和蛋白A的表达。图3A中的结果指示AP4-24H11影响金黄色葡萄球菌外蛋白的表达和/或分泌，其中一些外蛋白也可能受agr QS线路(circuit)调控。如图4A中所见，mAb AP4-24H11可成功地降低金黄色葡萄球菌的α-溶血素表达，且如图3B中所示，在具有经AP4-24H11处理的上清液的血琼脂板上未观察到溶血活性。相比之下，在RN4850情况下，mAb AP4-24H11显著增加蛋白A表达，这也与agr QS抑制一致。
AIP-1与AIP-4之间的唯一结构差异为位置5，且数据表明AP4-24H11能够以中等亲和力(≈5μM)与AIP-1结合。因此，研究AP4-24H11是否会影响I型agr菌株(即Wood46)的QS信号传导。AP4-24H11无法如在RN4850情况下一样有效地阻断Wood46的α-溶血素表达。然而，在AP4-24H11存在下生长的Wood46的α-溶血素产生显著减少是明显的(图4A)。这些数据表明有可能产生抑制两种或两种以上不同agr类型的金黄色葡萄球菌QS信号传导的交叉反应性mAb。
有可能由抗体介导的生长缺陷引起毒素产生和总蛋白质分泌的减少，结果指示经24小时生长期，在AP4-24H11存在下未观察到金黄色葡萄球菌的显著生长变化(图4B)。另外，在mAb SP2-6E11(AP4-24H11的无关同型对照组(κγ_2a))情况下未观察到可辨别的生长效应。
受QS调控的重要细菌毒力因子之一是生物膜形成。在金黄色葡萄球菌中，生物膜形成受agr QS信号传导负调控，这是通过agr QS抑制来控制金黄色葡萄球菌毒力的问题之一。与先前研究一致，AP4-24H11介导的QS抑制导致RN4850的生物膜形成增加(图4C)。尽管生物膜形成增加会在金黄色葡萄球菌慢性感染中造成显著问题，但这在急性感染中并不是太麻烦且因此mAb AP4-24H11可为控制所述金黄色葡萄球菌感染的有效方式。
实例14-AP4-24H11通过干扰agr QS系统来改变毒力因子的表达
为进一步检验AP4-24H11对agr QS的抑制，进行实时聚合酶链反应(RT-PCR)分析以评估所观察到的毒力因子表达变化是否实际上由干扰agr QS系统引起，即AP4-24H11的存在是否影响rnaIII的转录，rnaIII为agr自身诱导的即时产物和金黄色葡萄球菌的主要QS效应子。正如所料，AP4-24H11使在稳定生长期期间RN4850的rnaIII转录水平显著降低(大于50倍)。因此，α-溶血素和蛋白A表达的变化是AP4-24H11干扰AIP-4介导的QS信号传导的直接结果(图4D)。然而，总外蛋白表达的微小变化(参见图3)可能会被曲解成AP4-24H11未有效地阻断QS信号传导。然而，RT-PCR分析提供AP4-24H11显著抑制金黄色葡萄球菌RN4850的基于AIP4的QS的证据。
为分析基于抗体的金黄色葡萄球菌QS干扰的特异性，研究其它两种控制对环境应力的反应以及毒力因子在金黄色葡萄球菌中的表达的毒力调节子，即sarA(葡萄球菌辅助调节子)和saeR(葡萄球菌辅助蛋白效应子)的转录水平。重要的是，在sarA或saeR转录情况下未观察到显著变化(≤2倍)，这指示AP4-24H11仅影响agr QS系统(图4D)。
通过如上文所述的RT-PCR分析α-溶血素和蛋白A的转录。如上所述(见上)，在蛋白质表达水平方面看到显著变化。在转录方面，抑制hla和spa基因且分别提高约3到5倍，这再次证实rnaIII不仅影响转录，而且还影响这些蛋白质的翻译。最后，研究脱皮毒素A(exofoliatin A)(eta)转录。脱皮毒素是另一种仅由利用AIP-4的金黄色葡萄球菌菌株产生的受agr QS调控的毒素。数据指示AP4-24H11还使eta转录降低约10倍(图4D)。
实例15-通过合成AIP-4使AP4-24H11失活
为确定AP4-24H11是否通过与AIP-4结合且从细胞生长培养基中螯合AIP-4来抑制agr QS，或AP4-24H11是否影响金黄色葡萄球菌的其它信号传导系统(包括线性肽RNAIII抑制肽(RAP)，其又影响agr QS网)，进行以下实验来确定外部添加AIP-4是否可在AP4-24H11存在下恢复金黄色葡萄球菌RN4850的agr QS信号传导网。简单来说，用等摩尔量的合成AIP-4处理AP4-24H11，随后添加到金黄色葡萄球菌生长培养基中以确保AIP-4肽使抗体结合位点饱和。如图4E中所见，添加合成AIP-4有效地降低AP4-24H11的群体感应猝灭效应，且因此，完全恢复金黄色葡萄球菌RN4850的α-溶血素表达。这一发现提供了其它证实，即AP4-24H11螯合金黄色葡萄球菌生长培养基中的AIP-4且以严格AIP-4依赖性方式抑制金黄色葡萄球菌的AIP依赖性QS信号传导。
实例16-AP4-24H11抑制哺乳动物细胞的金黄色葡萄球菌诱导性细胞凋亡
最新研究已显示，将Jurkat T细胞与金黄色葡萄球菌培养物的上清液一起培育会诱 导细胞凋亡。用在AP4-24H11存在或不存在下生长的金黄色葡萄球菌(RN4850和Wood46)培养物的上清液处理Jurkat细胞。与上清液一起培育4小时后，在Jurkat细胞蛋白质提取物中评估聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)(指示细胞凋亡诱导的生物化学标记)的裂解。如图5中所示，AP4-24H11防止Jurkat细胞中RN4850上清液(1％)诱导的PARP裂解，而且还部分抑制Wood46上清液的影响。结果(图4A和图5)指示α-溶血素的表达与金黄色葡萄球菌诱导性细胞凋亡之间的正相关。
实例17-AP4-24H11阻断小鼠的金黄色葡萄球菌诱导性皮肤损伤
下面，通过利用鼠类皮下感染模型来研究mAb AP4-24H11减轻活体内金黄色葡萄球菌诱导性损伤的可能性。将新鲜生长的对数期金黄色葡萄球菌RN4850悬浮于含有Cytodex珠粒的PBS和如所指示的AP4-24H11或对照IgG中。在SKH1无毛小鼠的侧腹皮下注射细菌悬浮液或媒剂对照组，随后密切监测7天。投与剂量为10⁷个或10⁸个细菌(群落形成单位；cfu)和0.6mg或0.06mg AP4-24H11或对照IgG。接受10⁷cfu的小鼠出现最小程度的充血/水肿，随后经过7天出现有限的硬化(参见图6)。然而，早在注射后6小时，接受悬浮于生理食盐水或对照IgG中的10⁸cfu的小鼠在注射部位显示早期充血/发红且沿侧腹以斜纹图案水平延伸3-5mm且垂直延伸5-10mm(图7A)。在18小时时再检查后，包围注射部位的相同区域失去活力，且皮肤变成易碎的红棕色疮痂。经过7天观察期，变硬的疮痂开始与周围显得相对正常的皮肤脱离，且在正常/坏死接合处观察到少量脓性渗出物。相比之下，接受10⁸个细菌和0.6mg AP4-24H11的小鼠消除皮肤损伤(图7C)。如所期望的，较低剂量的AP4-24H11(0.06mg)不具有保护性(图7B)，且接受10⁸cfu和0.6mg对照IgG的对照小鼠未得到保护(参见图6)。经过观察期，接受单独PBS/Cytodex或含有0.6mg AP4-24H11的PBS/Cytodex的注射液的小鼠保持正常，除了偶尔局部硬化(图7D)。经过7天观察期，接受保护性剂量的0.6mg AP4-24H11以及金黄色葡萄球菌RN4850的动物未发展出任何显著病变。
实例18-使用AP4-24H11被动免疫保护小鼠免于金黄色葡萄球菌诱导性致死
为评估使用AP4-24H11的被动免疫方法针对金黄色葡萄球菌致命攻毒的有效性，SKH1无毛小鼠接受1ml AP4-24H11、对照IgG或媒剂(DPBS)的腹膜内注射液，2小时后接受0.5mL含有3×10⁸个金黄色葡萄球菌RN4850的DPBS^-。如图8中所示，所有接受AP4-24H11的小鼠(6/6)在经历8天观察期后都存活。相比之下，用DPBS处理的对照小鼠中仅一只小鼠(1/6)存活超过24小时且用对照IgG处理的小鼠中没有一只小鼠(0/6)存活超过24小时。这些数据进一步验证了我们的抵抗急性金黄色葡萄球菌感染的免疫药物治疗方法。
实例19-针对AP-1、AP-3和AP-4的单克隆抗体的竞争性ELISA分析
如上述实例4和12中所述，制备AP-1、AP-3和AP-4半抗原和对于这些半抗原具有特异性的单克隆抗体。
对于竞争性ELISA分析，测定AP1-BSA、AP3-BSA或AP4-BSA结合物以及各mAb的最佳浓度。分别用适量AP1-BSA、AP3-BSA或AP4-BSA结合物涂布96孔ELISA板。用4v％脱脂乳阻断所述板，洗涤且添加预定最佳浓度的mAb。洗涤板且将以100μM开始的一系列浓度的游离抗原(即天然AIP1-4)添加到孔中。在37℃下培育板1小时，充分洗涤，且添加山羊抗小鼠-辣根过氧化物酶(HRP)结合物(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce，Rockford，IL))。在室温下培育1小时后，再次充分洗涤板且添加HRP底物(TMB底物试剂盒；皮尔斯公司(Pierce))，使反应进行15分钟且通过添加2M H₂SO₄来中止。读取450nm下的吸光度且使用GraFit(艾里沙克斯软件公司(Erithacus Software Ltd))将值绘成图。将吸光度值是最大吸光度的50％的游离抗原浓度视为抗体对于其抗原的K_d值。
以下表格中展示亲和力和交叉反应性数据。这些数据证明使用本文所揭示的半抗原设计策略可获得针对作为半抗原的天然硫内酯肽的内酯类似物的单克隆抗体(mAb)。mAb的亲和力在低纳摩尔到高微摩尔的范围内，且一些而非所有mAb显示交叉反应性，即其识别设计其原始半抗原所依据的天然AIP，以及一种或两种其它天然存在的AIP。
AP1SupsAIP1wtAIP2wtAIP3wtAIP4wt     1H11＞25μM＞100μM＞25μM＞100μM2A9＞25μM＞100μM＞25μM＞100μM2C2～800nM＞100μM～3μM＞100μM2C10＞25μM＞100μM＞25μM＞100μM2H9～6μM＞100μM＞25μM～12μM3B1～6μM＞100μM＞25μM＞100μM3B11～6μM＞100μM＞25μM＞100μM3E11＞25μM＞100μM＞25μM＞100μM4D3～6μM＞100μM＞25μM＞100μM6H10＞25μM＞100μM＞25μM＞100μM9A9～6μM＞100μM～12μM＞100μM9B2～25μM＞100μM＞25μM＞100μM9B9无数据无数据无数据无数据9C3～6μM＞100μM＞25μM＞100μM9C4～6μM＞100μM＞25μM＞100μM9F9～3μM＞100μM～3μM＞100μM10D6＞25μM＞100μM＞25μM＞100μM10F4＞25μM＞100μM＞25μM＞100μM
11B10～3μM＞100μM＞25μM＞100μM12A10＞25μM＞100μM＞25μM＞100μM13A11～12μM＞100μM＞25μM＞100μM13H3＞25μM＞100μM＞25μM＞100μM15B4～800nM＞100μM～1μM＞100μM15G12＞25μM＞100μM＞25μM＞100μM16E11＞25μM＞100μM＞25μM＞100μM16F4～25μM＞100μM＞25μM＞100μM16G9～12μM＞100μM＞25μM＞100μM17F5～12μM＞100μM＞25μM＞100μM
AP3SupsAIP1wtAIP2wtAIP3wtAIP4wt     18A7＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM21C4156μM＞625μM＞625μM＞625μM21E10＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM21H11＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM22B3＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM22D1156-312μM＞625μM78μM＞625μM22E12＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM22H10156μM＞625μM312μM＞625μM23C9＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM23H1＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM24H9＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM25A3＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM25E2＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM25E9156μM＞625μiM＞625μM＞625μM25F5625-312μM＞625μM156-312μM＞625μM26A2＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM26G3＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM26G11＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM27E1＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM28H8＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM29A2～9.8μM＞625μM～612μM＞625μM29B8＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM29D5＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM30C9156μM＞625μM＞625μM＞625μM30H8＞625μM＞625μM＞625μM＞625μM30H11156μM156μM4.9-2.5μM＞625μM
AP4SupsAIP1wtAIP2wtAIP3wtAIP4wt     9G2＞25μM＞25μM＞25μM～700nM12A2＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM13G5＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM15B3＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM15C3＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM15E8＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM
16D1＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM17G2＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM18D3＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM18G10＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM22B8＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM22D9＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM22F2＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM22G7＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM23C4＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM23E6～6μM＞25μM＞25μM～390nM24H11～5μM＞25μM＞25μM～98nM26E8＞25μM＞25μM＞25μM＞25μM27E9＞25M＞25μM＞25μM＞25μM29E10～3μM＞25μM＞25μM～24nM
再次测试所有杂交瘤竞争且展示平均值。5次不同地测试AP4-29E10，显示变化范围为2nM-110nM，但大多数在24nM左右。
测定所选单克隆抗体的氨基酸和核苷酸序列，且以下表格中展示其序列。
鼠类单克隆抗体的可变重链和轻链的氨基酸序列




实例20-其它抗AIP抗体的评估
评估一些新获得的抗AIP抗体(例如抗AP1和抗AP3抗体)的群体感应猝灭能力。对于I型菌株(RN6390B和Wood46)来说，测试在竞争性ELISA测定中对AIP-1显示高亲和力的两种单克隆抗体AP1-2C2和AP1-15B4。图9展示抗API抗体也有效地抑制I型菌株的群体感应，从而导致毒力因子表达的变化。另外，也测试针对III型菌株之一的RN8465的抗AP3抗体。由于RN8465的低外蛋白表达，因此未精确测定出群体感应猝灭效应。
实例21-基于环肽的疫苗的治疗作用
为评估基于环肽的疫苗的有效性，进行以下实验。主动和被动疫苗接种时间表如下：
主动疫苗接种时间表

被动疫苗接种时间表

通过静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下注射，向25-30g且8-12周龄的雄性Ba1b/c大鼠投与疫苗。各处理组中包括20只动物。
为确定疫苗是否保护动物免受致命的系统攻毒，使用任何已知agr类型的金黄色葡萄球菌菌株。通过腹膜内注射投与约10⁸-10⁹C.F.U.的细菌。测定体温和每12小时的存活率。10天后死亡或存活表示研究的终点。上文描述其它详情。
为确定疫苗是否保护动物免患败血症，使用任何已知agr类型的金黄色葡萄球菌菌株。通过静脉内注射投与约10⁷-10⁸C.F.U.的细菌。因此，将金黄色葡萄球菌直接投与血流中且金黄色葡萄球菌将以血流扩散方式遍布全身。测定体温和每12小时的存活率。 10天后死亡或存活表示研究的终点。
为确定疫苗是否保护动物免患脓毒性关节炎，使用能够自发地引起关节炎的金黄色葡萄球菌菌株LS-1(属于1型agr的小鼠适应性菌株)或任何已知agr类型的菌株。通过静脉内注射投与约10⁶-10⁷C.F.U.的细菌。测定体温、每12小时的存活率、关节肿胀(擦痕)、发红、移动模式变化和发病率。28天时死亡或存活表示研究的终点。
为确定疫苗是否保护动物免患肾脓肿，使用任何已知agr类型的金黄色葡萄球菌菌株。通过静脉内注射投与约10⁶-10⁷C.F.U.的细菌。基于活动性、警惕性和被毛状况评估动物(正常、略微异常、极异常的计分为0-2)。另外，在无菌条件下移出肾且进行组织学评估(脓肿形成；0-无明显脓肿；1-1处小脓肿；2-几处脓肿；和3-严重肾脓肿(abscessed kidney))，且从肾组织匀浆重新得到C.F.U.计数。7天时死亡或存活表示研究的终点。
可使用相同模型来确定疫苗是否可阻止肾脓肿形成，在所述情况下考虑综合行为(general behavior)和基于肾的组织学评估的肾脓肿。
为确定疫苗是否保护动物免于遍布全身以及占据导管，使用外来体模型。将一根导管植入小鼠的皮下间隙中。24小时后，通过在导管床中皮下注射约10⁶-10⁸C.F.U.来投与任何已知agr类型的金黄色葡萄球菌菌株的悬浮液。通过在各个时间点测定体温、每12小时的存活率、皮下脓肿形成和从导管重新得到的C.F.U.计数来评估细菌遍布全身且占据导管的能力。7天时死亡或存活表示研究的终点。或者，在这种模型中可使用被占据的导管。
为确定疫苗是否保护动物免患乳腺炎，通过乳房内注射约10²-10⁴C.F.U.的来自任何已知agr类型的金黄色葡萄球菌菌株来投与哺乳期CD1小鼠。在各个时间点测定乳腺的C.F.U.计数且以每腺体C.F.U.或每克乳房组织C.F.U.表示。也评估腺体中存在的乳汁量和存活率，且5天时死亡或存活表示研究的终点。这是确定的由诱导乳腺发炎的病因性微生物乳房内感染引起的牛乳腺炎模型。金黄色葡萄球菌引起临床乳腺炎，但更通常引起易于变成慢性且难以通过常规抗微生物疗法根除的亚临床感染(subclinical infection)。
实例22-用AP4-KLH主动疫苗接种保护小鼠免受致命全身性金黄色葡萄球菌攻毒
用100μg免疫结合物以及含有含未甲基化的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)作为佐剂的细菌DNA经腹膜内使小鼠免疫。张(Chuang)等人，白细胞生物学杂志(J Leukoc Biol)71：538-44(2002)。在初始疫苗接种后7天和21天，动物接受加强免疫。从所有动物抽取血清样品以进行抗AIP4抗体效价分析，然后进行感染实验。
下表中概括说明疫苗接种对腹膜内接受0.5mL含有3×10⁸个金黄色葡萄球菌 RN4850的PBS的SKH1无毛小鼠的保护作用的结果(帕克(Park)等人，化学生物学(Chem Biol)14：1119-1127(2007))。
针对AIP4的主动疫苗接种保护小鼠免受致命金黄色葡萄球菌攻毒
疫苗存活者AIP4-KLH4/6KLH1/6PBS2/6
如以上所示，6只接受AP4-KLH结合物的小鼠中有4只在经历8天观察期后存活。相比之下，接种KLH的对照小鼠中仅一只(1/6)和用PBS模拟物免疫的小鼠中有2只(2/6)在观察期后存活。
抗体效价的分析显示结合物和免疫方案引发效价在1∶1000范围内的免疫反应，所述稀释度即如使用标准ELISA方法所测试，仍观察到最大信号强度的50％的稀释度。这一分析还显示免疫作用可诱导AIP4特异性免疫反应以及与AIP1和AIP3的交叉反应性(抗AIP4效价：高达1∶6400；抗AIP1效价：高达1∶6400；抗AIP3效价：高达1∶3200)。
实例23-抗AIP1抗体的评估
针对I型金黄色葡萄球菌菌株RN6390B测试所有获得的抗AIP1mAb。图10B中的结果显示多种抗API抗体有效地抑制I型金黄色葡萄球菌的群体感应，从而导致溶血素表达的变化。在免疫实验中，mAb AP1-15B4(4号)展现最有效活性。
还在mAb AP1-15B4存在下评估金黄色葡萄球菌菌株RN6390B的生物膜形成，因为已描述生物膜形成响应于金黄色葡萄球菌的agr QS信号传导抑制而增加。图10B中的结果显示在mAb AP1-15B4存在下金黄色葡萄球菌菌株RN6390B的生物膜形成增加。
实例24-使用噬菌体呈现技术选择人类scFv抗体
使用高(Gao)等人(美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.)99：12612-6(2002))所述的方法产生噬菌体呈现文库，使用AP1-BSA、AP3-BSA和AP4-BSA结合物筛选所述文库以鉴别人类抗AIP-1、抗AIP-3和抗AIP-4scFv抗体。首先针对BSA去除抗体呈现噬菌体粒子以除去BSA特异性克隆以及非特异性结合物。4轮淘选后，通过DNA测序和针对BSA和AP1-BSA、AP3-BSA和AP4-BSA的ELISA来分析所选克隆。以下表格中展示scFv抗体的氨基酸序列、编码可变重链和可变轻链的DNA序列以及编码scFv抗体的DNA序列。













实例25-通过抗AIP4人类scFv(AP4-4-20)抑制RN4850的溶血素表达
在通过淘选抗体-噬菌体呈现文库所获得的20种克隆中，最有效克隆AP4-4-20在大肠杆菌中表达为scFv抗体。纯化所表达的scFv抗体且如下评估其抑制金黄色葡萄球菌RN4850的溶血素表达的能力。
在CYGP培养基中在scFv AP4-4-20(2.7μM)存在下将金黄色葡萄球菌RN4850培育24小时，且通过西方分析，使用金黄色葡萄球菌培养物上清液评估α-溶血素表达。结果展示于图11中。分别使用mAb AP4-24H-11(1.3μM)和无关scFv抗体对照组(10μM)作为阳性和阴性对照组。在AIP-4特异性抗体4-20和AP4-24H11存在下，可检测到溶血素分泌显著减少，这有力地表明金黄色葡萄球菌的AlP依赖性QS受到抑制。
实例26-抗AIP1mAb AP1-15B4在暴露后疗法中保护小鼠免受致命全身性MRSAUSA300攻毒
在使用mAb AP1-15B4的暴露后方案中，在致命金黄色葡萄球菌攻毒小鼠模型中证明我们的被动免疫方法的有效性。C57BL/6小鼠在受至少1×10⁸个金黄色葡萄球菌USA300(agrIMRSA菌株)感染后2小时接受1mg AP1-15B4(腹膜内)、同型对照IgG或PBS。参见迪普(Diep)等人，柳叶刀(Lancet)2006，367，(9512)，731-739。USA300事实上是最常见的社区获得性MRSA(CA-MRSA)菌株且对平民和军人的威胁日益增加。哈格曼(Hageman)等人，诊断微生物学和传染病(Diagn Microbiol Infect Dis)2008；詹姆斯(James)等人，儿童疾病档案-胎儿和新生儿版(Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed)2008，93，(1)，F40-4；特诺威(Tenover)等人，临床微生物学杂志(J Clin Microbiol)2006，44，(1)，108-18；贝尔曼(Beilman)等人，手术感染(Larchmt)(Surg Infect(Larchmt))2005，6，(1)，87-92。如图12中所示，6只接受AP1-15B4的小鼠中有4只在经历48小时观察期后存活。相比之下，用PBS处理的对照小鼠中仅2只小鼠(2/6)存活超过24小时且用对照IgG处理的小鼠中有2只小鼠(2/6)存活超过24小时。这些数据首次证明存在用于金黄色葡萄球菌的群体感应猝灭策略的治疗窗。这进一步验证我们的预防金黄色葡萄球菌感染的免疫药物治疗方法，因为其显示可在患者感染后投与我们的群体感应猝灭抗体。
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所引用的文献
1.C.富卡(Fuqua，C.)，S.C.魏南斯(Winans，S.C.)，和E.P.格林伯格(Greenberg，E.P.)(1996).细菌生态系统的种群普查和共识：群体感应转录调节子的LuxR-LuxI家族(Census and consensus in bacterial ecosystems：the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators).微生物学年度评论(Annu Rev Microbiol)50，727-751。
2.K.H.尼尔逊(Nealson，K.H.)，T.皮埃特(Piatt，T.)，和J.W.黑斯廷斯(Hastings，J.W.)(1970).细菌发光系统的合成和活性的细胞控制(Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system).细菌学杂志(J Bacteriol)104，313-322。
3.T.R.德奇威(de Kievit，T.R.)，和艾格乐维斯基B.H.(Iglewski，B.H.)(2000).与致病有关的细菌群体感应(Bacterial quorum sensing in pathogenic relationships).感染与免疫(Infect Immun)68，4839-4849。
4.H.B.卡普兰(Kaplan，H.B.)，和E.P.格林伯格(Greenberg，E.P.)(1985).自身诱导物的扩散与费希尔狐菌发光系统有关(Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system).细菌学杂志(J Bacteriol)163，1210-1214。
5.B.A.拉扎泽尔(Lazazzera，B.A.)，和A.D.格罗斯曼(Grossman，A.D.)(1998).肽信号传导的详情(The ins and outs of peptide signaling).微生物学趋势(Trends Microbiol)6，288-294。
6.R.P.诺维卡(Novick，R.P.)(2003).葡萄球菌毒力调控中的自身诱导和信号转导(Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence).分子微生物学(Mol Microbiol)48，1429-1449。
7.M.M.梅杰乐(Meijler，M.M.)，L.G.宏恩(Horn，L.G.)，G.F.考夫曼(Kaufmann，G.F.)，K.M.麦肯锡(McKenzie，K.M.)，C.孙(Sun，C.)，J.A.莫斯(Moss，J.A.)，M.松下(Matsushita，M.)，和K.D.真达(Janda，K.D.)(2004).普遍存在的群体感应分子的合成和生物学验证(Synthesis and biological validation of a ubiquitous quorum-sensing molecule).应用化学(英文版)(Angew Chem Int Ed Engl)43，2106-2108。
8.S.肖德尔(Schauder，S.)，K.修卡特(Shokat，K.)，M.G.苏特(Surette，M.G.)，和B.L.贝斯勒(Bassler，B.L.)(2001).细菌自身诱导物的LuxS家族：新颖群体感应信号分子的生物合成(The LuxS family of bacterial autoinducers：biosynthesis of a novel quorum-sensing signal molecule).分子微生物学(Mol Microbiol)41，463-476。
9.F.高茲(Gotz，F.)(2002).葡萄球菌和生物膜(Staphylococcus and biofilms).分子微生物学(Mol Microbiol)43，1367-1378。
10.L.霍尔-斯图德勒(Hall-Stoodley，L.)，J.W.库斯特顿(Costerton，J.W.)，和P.斯图德勒(Stoodley，P.)(2004).细菌生物膜：从自然环境到传染病(Bacterial biofilms：from the natural environment to infectious diseases).自然评论：微生物学(Nat Rev Microbiol)2，95-108。
11.G.J.里昂(Lyon，G.J.)，和T.W.穆尔(Muir，T.W.)(2003).细菌之间的化学信号传导及其抑制(Chemical signaling among bacteria and its inhibition).化学生物学(Chem Biol)10，1007-1021。
12.T.B.雷拉斯穆森(Rasmussen，T.B.)，和M.吉维斯科夫(Givskov，M.)(2006).群 体感应抑制剂：效应协议(Quorum sensing inhibitors：a bargain of effects).微生物学(Microbiology)152，895-904。
13.R.S.史密斯(Smith，R.S.)，和艾格乐维斯基B.H.(Iglewski，B.H.)(2003).绿脓杆菌群体感应系统和毒力(P.aeruginosa quorum-sensing systems and virulence).微生物学新见(Curr Opin Microbiol)6，56-60。
14.W.C.陈(Chan，W.C.)，B.J.科勒(Coyle，B.J.)，和P.威廉姆斯(Williams，P.)(2004).葡萄球菌感染的毒力调控和群体感应：作为群体感应抑制剂的竞争性AgrC拮抗剂(Virulence regulation and quorum sensing in staphylococcal infections：competitive AgrC antagonists as quorum sensing inhibitors).医学化学杂志(J Med Chem)47，4633-4641。
15.G.D.格斯克(Geske，G.D.)，R.J.维泽曼(Wezeman，R.J.)，A.P.西格尔(Siegel，A.P.)，和H.E.布雷克威尔(Blackwell，H.E.)(2005).细菌群体感应和生物膜形成的小分子抑制剂(Small molecule inhibitors of bacterial quorum sensing and biofilm formation).美国化学会志(J Am Chem Soc)127，12762-12763。
16.G.J.里昂(Lyon，G.J.)，P.梅维尔(Mayville，P.)，T.W.穆尔(Muir，T.W.)，和R.P.诺维卡(Novick，R.P.)(2000).金黄色葡萄球菌的毒力反应的完全抑制剂的合理设计，部分基于抑制位点定位于受体-组氨酸激酶AgrC(Rational design of a global inhibitor of the virulence response in Staphylococcus aureus，based in part on localization of the site of inhibition to the receptor-histidine kinase，AgrC).美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)97，13330-13335。
17.U.穆(Muh，U.)，B.J.黑尔(Hare，B.J.)，B.A.杜尔科普(Duerkop，B.A.)，M.舒斯特(Schuster，M.)，B.L.汗泽尔卡(Hanzelka，B.L.)，R.海姆(Heim，R.)，E.R.奥尔森(Olson，E.R.)，和E.P.格林伯格(Greenberg，E.P.)(2006).绿脓杆菌酰基高丝氨酸内酯群体感应信号的结构无关模拟物(A structurally unrelated mimic of a Pseudomonas aeruginosa acyl-homoserine lactone quorum-sensing signal).美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)103，16948-16952。
18.K.M.史密斯(Smith，K.M.)，Y.布(Bu，Y.)，和H.菅原(Suga，H.)(2003).绿脓杆菌自身诱导物的合成促效剂和拮抗剂的文库筛选(Library screening for synthetic agonists and antagonists of a Pseudomonas aeruginosa autoinducer).化学生物学(Chem Biol)10，563-571。
19.G.F.考夫曼(Kaufmann，G.F.)，R.萨托里奥(Sartorio，R.)，S.H.李(Lee，S.H.)，J.M.米(Mee，J.M.)，L.J.阿尔托贝尔(Altobell，L.J.)，第3，D.P.库加瓦(Kujawa，D.P.)，E. 杰弗里斯(Jeffries，E.)，B.科拉普汉(Clapham，B.)，M.M.梅杰乐(Meijler，M.M.)，和K.D.真达(Janda，K.D.)(2006).N-酰基高丝氨酸内酯介导的细菌群体感应的抗体干扰(Antibody interference with N-acyl homoserine lactone-mediated bacterial quorum sensing).美国化学会志(J Am Chem Soc)128，2802-2803。
20.S.宫入(Miyairi，S.)，K.河野(Tateda，K.)，E.T.芙斯(Fuse，E.T.)，C.上田(Ueda，C.)，H.斋藤(Saito，H.)，T.高畠(Takabatake，T.)，Y.石井(Ishii，Y.)，M.堀川(Horikawa，M.)，M.石黑(Ishiguro，M.)，T.J.史坦迪福特(Standiford，T.J.)，和K.山口(Yamaguchi，K.)(2006).用3-氧代十二烷酰基-L-高丝氨酸内酯-蛋白质结合物免疫可保护小鼠免受致命绿脓杆菌肺部感染(Immunization with 3-oxododecanoyl-L-homoserine lactone-protein conjugate protects mice from lethal Pseudomonas aeruginosa lung infection).医学微生物学杂志(J Med Microbiol)55，1381-1387。
21.R.C.玛斯(Massey，R.C.)，M.J.霍斯布鲁格(Horsburgh，M.J.)，G.林娜(Lina，G.)，M.虎克(Hook，M.)，和M.卢克(Recker，M.)(2006).金黄色葡萄球菌毒力的进化和维持：造成宿主与宿主之间的传播？(The evolution and maintenance of virulence in Staphylococcus aureus：a role for host-to-host transmission？)自然评论：微生物学(Nat Rev Microbiol)4，953-958。
22.E.A.乔治(George，E.A.)，和T.W.穆尔(Muir，T.W.)(2007).毒性葡萄球菌的agr群体感应的分子机制(Molecular mechanisms of agr quorum sensing in virulent staphylococci).化学与生物化学(Chembiochem)8，847-855。
23.G.萨科拉斯(Sakoulas，G.)，G.M.埃利奥普洛斯(Eliopoulos，G.M.)，R.C.Jr.莫勒林(Moellering，R.C.，Jr.)，R.P.诺维卡(Novick，R.P.)，L.文卡塔拉曼(Venkataraman，L.)，C.温纳斯顿(Wennersten，C.)，P.C.蒂吉拉米(DeGirolami，P.C.)，M.J.施瓦伯(Schwaber，M.J.)，和H.S.戈尔德(Gold，H.S.)(2003).II型金黄色葡萄球菌辅助基因调节子(agr)：与中等水平的糖肽耐药性的形成有关？(Staphylococcus aureus accessory gene regulator(agr)group II：is there a relationship to the development of intermediate-level glycopeptide resistance？)传染病杂志(J Infect Dis)187，929-938。
24.J.S.赖特(Wright，J.S.)，第3，R.金(Jin，R.)，和R.P.诺维卡(Novick，R.P.)(2005).对葡萄球菌群体感应的短暂干扰可阻止脓肿形成(Transient interference with staphylococcal quorum sensing blocks abscess formation).美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)102，1691-1696。
25.G.季(Ji，G.)，R.碧维斯(Beavis，R.)，和R.P.诺维卡(Novick，R.P.)(1997).由 自身诱导肽变异体引起的细菌干扰(Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants).科学(Science)276，2027-2030。
26.P.梅维尔(Mayville，P.)，G.季(Ji，G.)，R.碧维斯(Beavis，R.)，H.杨(Yang，H.)，M.格格尔(Goger，M.)，R.P.诺维卡(Novick，R.P.)，和T.W.穆尔(Muir，T.W.)(1999).引起毒力的来自金黄色葡萄球菌的合成自身诱导硫内酯肽的结构-活性分析(Structure-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactone peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence).美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)96，1218-1223。
27.A.片仓(Shigenaga，A.)，J.A.莫斯(Moss，J.A.)，F.T.阿什莉(Ashley，F.T.)，G.F.考夫曼(Kaufmann，G.F.)，K.D.真达(Janda，K.D.)(2006).通过酰基苯基二氮烯活化来进行群体感应肽类似物的固相合成和环裂解(Solid-phase synthesis and cyclative cleavage of quorum sensing depsipeptide analogs by acylphenyldiazene activation).合成有机化学快报(SYNLETT)4，551-554。
28.G.F.考夫曼(Kaufmann，G.F.)，R.萨托里奥(Sartorio，R.)，S.H.李(Lee，S.H.)，C.J.罗格斯(Rogers，C.J.)，M.M.梅杰乐(Meijler，M.M.)，J.A.莫斯(Moss，J.A.)，B.科拉普汉(Clapham，B.)，A.P.布罗根(Brogan，A.P.)，T.J.迪科尔森(Dickerson，T.J.)，和K.D.真达(Janda，K.D.)(2005).群体感应回顾：3-氧代-N-酰基高丝氨酸内酯的其它化学和生物学功能的发现(Revisiting quorum sensing：Discovery of additional chemical and biological functions for 3-oxo-N-acylhomoserine lactones).美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)102，309-314。
29.C.王(Vuong，C.)，H.L.萨恩兹(Saenz，H.L.)，F.高兹(Gotz，F.)，和M.奥托(Otto，M.)(2000).agr群体感应系统对附着于葡萄球菌中的聚苯乙烯的影响(Impact of the agr quorum-sensing system on adherence to polystyrene in Staphylococcus aureus).传染病杂志(J Infect Dis)182，1688-1693。
30.N.哈拉格伊(Harraghy，N.)，S.科杜斗(Kerdudou，S.)，和M.赫尔曼(Herrmann，M.)(2007).作为治疗标靶的葡萄球菌的群体感应系统(Quorum-sensing systems in staphylococci as therapeutic targets).分析化学与生物分析化学(Anal Bioanal Chem)387，437-444。
31.R.P.诺维卡(Novick，R.P.)，H.F.罗斯(Ross，H.F.)，S.J.普罗简(Projan，S.J.)，J.孔恩布鲁(Kornblum，J.)，B.克丽丝维斯(Kreiswirth，B.)，和S.莫格兹(Moghazeh，S.)(1993).葡萄球菌毒力因子的合成受调节RNA分子控制(Synthesis of staphylococcal  virulence factors is controlled by a regulatory RNA molecule).欧洲分子生物学学会志(Embo J)12，3967-3975。
32.J.瓦里(Valle，J.)，A.托利多-阿拉纳(Toledo-Arana，A.)，C.柏拉珊(Berasain，C.)，J.M.吉勾(Ghigo，J.M.)，B.阿莫雷纳(Amorena，B.)，J.R.贝纳德斯(Penades，J.R.)，和I.拉沙(Lasa，I.)(2003).SarA而非sigmaB是金黄色葡萄球菌形成生物膜所必需的(SarA and not sigmaB is essential for biofilm development by Staphylococcus aureus).分子微生物学(Mol Microbiol)48，1075-1087。
33.Y.Q.熊(Xiong，Y.Q.)，J.维尔德(Willard，J.)，M.R.耶曼(Yeaman，M.R.)，A.L.张(Cheung，A.L.)，和A.S.拜耳(Bayer，A.S.)(2006).在活体外且在实验感染性心内膜炎中通过agr、sarA和sae来调控金黄色葡萄球菌α-毒素基因(hla)表达(Regulation of Staphylococcus aureus alpha-toxin gene(hla)expression by agr，sarA，and sae in vitro and in experimental infective endocarditis).传染病杂志(J Infect Dis)194，1267-1275。
34.S.杰劳德(Jarraud，S.)，G.J.里昂(Lyon，G.J.)，A.M.菲格雷多(Figueiredo，A.M.)，L.杰拉德(Gerard，L.)，F.范德那池(Vandenesch，F.)，J.埃蒂安(Etienne，J.)，T.W.穆尔(Muir，T.W.)，和R.P.诺维卡(Novick，R.P.)(2000).产生脱皮毒素的菌株定义为金黄色葡萄球菌中的第四种agr特异性类型(Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus).细菌学杂志(J Bacteriol)182，6517-6522。
35.N.巴拉班(Balaban，N.)，T.戈德科恩(Goldkorn，T.)，R.T.尼汉(Nhan，R.T.)，L.B.当(Dang，L.B.)，S.斯科特(Scott，S.)，R.M.瑞吉利(Ridgley，R.M.)，A.拉索里(Rasooly，A.)，S.C.赖特(Wright，S.C.)，J.W.拉里克(Larrick，J.W.)，R.拉索里(Rasooly，R.)，和J.R.卡尔松(Carlson，J.R.)(1998).作为针对金黄色葡萄球菌的疫苗和疗法的标靶的毒力自身诱导物(Autoinducer of virulence as a target for vaccine and therapy against Staphylococcus aureus).科学(Science)280，438-440。
36.L.N.肖(Shaw，L.N.)，I.M.约翰森(Jonnson，I.M.)，V.K.星(Singh，V.K.)，A.塔科夫斯基(Tarkowski，A.)，和G.C.斯图尔特(Stewart，G.C.)(2007).trap的失活对金黄色葡萄球菌的Agr群体感应系统或毒力无影响(Inactivation of trap has no effect on the Agr quorum sensing system or virulence of Staphylococcus aureus).感染与免疫(Infect Immun)。
37.L.H.曾(Tsang，L.H.)，S.T.德利(Daily，S.T.)，E.C.威斯(Weiss，E.C.)，和M.S.斯每泽(Smeltzer，M.S.)(2007).金黄色葡萄球菌的trap突变对agr表达或生物膜形成无影响(Mutation of trap in Staphylococcus aureus has no impact on expression of agr or  biofilm formation).感染与免疫(Infect Immun)。
38.H.邦特(Bantel，H.)，B.辛哈(Sinha，B.)，W.多姆斯克(Domschke，W.)，G.彼得斯(Peters，G.)，K.舒尔兹-奥斯多夫(Schulze-Osthoff，K.)，和R.U.杰里克(Janicke，R.U.)(2001).α-毒素是金黄色葡萄球菌诱导性细胞死亡的介体且通过与死亡受体信号传导无关的固有死亡途径使卡斯蛋白酶活化(alpha-Toxin is a mediator of Staphylococcus aureus-induced cell death and activates caspases via the intrinsic death pathway independently of death receptor signaling).细胞生物学杂志(J Cell Biol)155，637-648。
39.A.卡萨德瓦利(Casadevall，A.)，E.达乔瓦(Dadachova，E.)，和L.A.皮罗夫斯基(Pirofski，L.A.)(2004).传染病的被动抗体疗法(Passive antibody therapy for infectious diseases).自然评论：微生物学(Nat Rev Microbiol)2，695-703。
40.G.杨(Yang，G.)，Y.高(Gao，Y.)，J.董(Dong，J.)，C.刘(Liu，C.)，Y.薛(Xue，Y.)，M.范(Fan，M.)，B.沈(Shen，B.)，和N.邵(Shao，N.)(2005).由噬菌体文库筛选的新颖肽可模拟针对金黄色葡萄球菌感染的TRAP抗原表位(A novel peptide screened by phage display can mimic TRAP antigen epitope against Staphylococcus aureus infections).生物化学杂志(J Biol Chem)280，27431-27435。
41.G.杨(Yang，G.)，Y.高(Gao，Y.)，J.董(Dong，J.)，Y.薛(Xue，Y.)，M.范(Fan，M.)，B.沈(Shen，B.)，C.刘(Liu，C.)，和N.邵(Shao，N.)(2006).从噬菌体文库分离得到并且用复杂系统替代针对葡萄球菌感染的疫苗的新颖肽(A novel peptide isolated from phage library to substitute a complex system for a vaccine against staphylococci infection).疫苗(Vaccine)24，1117-1123。
42.R.P.诺维卡(Novick，R.P.)(1991).葡萄球菌的遗传系统(Genetic systems in staphylococci).酶学方法(Methods Enzymol)204，587-636。
43.G.A.奥图尔(O’Toole，G.A.)，L.A.普瑞特(Pratt，L.A.)，P.I.瓦特尼克(Watnick，P.I.)，D.K.纽曼(Newman，D.K.)，V.B.维弗尔(Weaver，V.B.)，和R.科尔特(Kolter，R.)(1999).研究生物膜的遗传方法(Genetic approaches to study of biofilms).酶学方法(Methods Enzymol)310，91-109。
44.H.埃洛姆(Eleaume，H.)，和S.佳波里(Jabbouri，S.)(2004).比较实时定量RT-PCR中用于在活体外生长期间追踪金黄色葡萄球菌基因表达的两种标准化方法(Comparison of two standardisation methods in real-time quantitative RT-PCR to follow Staphylococcus aureus genes expression during in vitro growth).生物学方法杂志(J Microbiol Methods)59，363-370。
45.W.F.迪格拉德(DeGrado，W.F.)；E.T.凯撒(Kaiser，E.T.)作为固相肽合成的支撑物的与聚合物结合的肟酯(Polymer-bound oxime esters as supports for solid-phase peptide synthesis).制备受保护的肽片段(The preparation of protected peptide fragments).有机化学杂志(J.Org.Chem.)1980，45，1295-1300。
46.W.F.迪格拉德(DeGrado，W.F.)；E.T.凯撒(Kaiser，E.T.)在与聚合物结合的肟上固相合成受保护的肽：制备包含细胞毒性26肽类似物的序列的区段(Solid-phase synthesis of protected peptides on a polymer-bound oxime：preparation of segments comprising the sequence of a cytotoxic 26-peptide analog).有机化学杂志(J.Org.Chem.)1982，47，3258-3261。
47.S.H.中川(Nakagawa，S.H.)；E.T.凯撒(Kaiser，E.T.)在与聚合物结合的肟上合成受保护的肽区段和其组合体：应用于合成血浆脱脂蛋白A-I的肽模型(Synthesis of protected peptide segments and their assembly on a polymer-bound oxime：application to the synthesis of a peptide model for plasma apolipoprotein A-I).有机化学杂志(J.Org.Chem.)1983，45，678-685。
48.S.H.中川(Nakagawa，S.H.)；H.S.劳(Lau，H.S.)；F.J.科兹迪(Kezdy，F.J.)；E.T.凯撒(Kaiser，E.T.)使用与聚合物结合的肟来合成可用于区段缩合的大肽：合成脱脂蛋白A-I的具有44个氨基酸的两性肽模型(The use of polymer-bound oximes for the synthesis of large peptides usable in segment condensation：synthesis of a 44 amino acid amphiphilic peptide model of apolipoprotein A-I).美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)1985，107，7087-7092。
49.E.T.凯撒(Kaiser，E.T.)；H.米哈拉(Mihara，H.)；G.A.拉弗蕾(Laforet，G.A.)；J.W.科利(Kelly，J.W.)；L.沃特斯(Walters，L.)；M.A.费德斯(Findeis，M.A.)；T.佐佐木(Sasaki，T.)通过区段合成-缩合来合成肽和蛋白质(Peptide and protein synthesis by segment synthesis-condensation).科学(Science)1989，243，187-192。
50.G.奥斯柏(Osapay，G.)；J.W.泰勒(Taylor，J.W.)多环多肽模型化合物(Multicyclic Polypeptide Model Compounds).2.受三个侧链与侧链内酰胺桥键限制的高度α-螺旋Uncosapeptide的合成和构形性质(Synthesis and Conformational Properties of a Highly a-Helical Uncosapeptide Constrained by Three Side-Chain to Side-Chain Lactam Bridges).美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)1992，114，6966-6973。
51.J.W.泰勒(Taylor，J.W.)与侧链内酰胺桥接的肽的合成和研究(The Synthesis and Study of Side-Chain Lactam-Bridged Peptides).生物聚合物(Biopolymers)2002，66， 49-75。
52.P.李(Li，P.)；P.P.罗乐(Roller，P.P.)；J.徐(Xu，J.)肽的现代合成方法和肽模拟物环化(Current Synthetic Approaches to Peptide and Peptidomimetic Cyclization).现代有机化学(Curr.Org.Chem.)2002，6，411-440。
53.M.库乐维(Chorev，M.)部分逆反修饰：共同进行的途径(The Partial Retro-Inverso Modification：A Road Traveled Together).生物聚合物(Biopolymers)2005，80，67-84。
54.R.文斯(Vince，R.)；J.布劳内尔(Brownell，J.)L.B.阿克拉(Akella，L.B.)γ-(L-γ-氮杂谷氨酰基)-S-(对溴苯甲基)-L-半胱氨酰基甘氨酸的合成和活性：乙二醛酶I的代谢稳定抑制剂(Synthesis and activity ofγ-(L-γ-azaglutamyl)-S-(p-bromobenzyl)-L-cysteinylglycine：A metabolically stable inhibitor of glyoxalase I).生物有机化学和药物化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)1999，9，853-856。