猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体及其构建和表达方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201410377167.X

申请日:

2014.08.01

公开号:

CN104152479A

公开日:

2014.11.19

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法律详情:

实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/70申请日:20140801|||公开

IPC分类号:

C12N15/70; C12N15/66

主分类号:

C12N15/70

申请人:

中国农业科学院兰州兽医研究所

发明人:

周继章; 宫晓炜; 曹小安; 李兆才; 陈启伟

地址:

730046 甘肃省兰州市盐场堡徐家坪1号

优先权:

专利代理机构:

北京方圆嘉禾知识产权代理有限公司 11385

代理人:

董芙蓉

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内容摘要

本发明公开了猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体及其构建和表达方法,所述的共表达载体基于分子克隆技术将猪瘟病毒的主要囊膜蛋白(E2c)和非结构蛋白(NS2-3c)及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白(E2b)和非结构蛋白(NS2-3b)的编码基因分别与双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1连接。本发明的共表达载体能够同时表达猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白,可用于制备多价亚单位疫苗、防控猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒。

权利要求书

1.  猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体,其特征在于在同一宿主菌中表达的双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1上分别连接有猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因,双表达载体与编码基因的连接关系为pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b

2.
  根据权利要求1的共表达载体,其特征在于宿主菌为大肠杆菌。

3.
  权利要求1的共表达载体的构建方法,其特征在于包括将猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因连接到双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1的步骤。

4.
  根据权利要求3的构建方法,其特征在于具体包括下述步骤:1)扩增猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因;2)利用Nde I酶切pETDuet-1、pRSFDuet-1和pET-32a(+)载体,将酶切后的pETDuet-1、pRSFDuet-1分别与pET-32a(+)载体酶切回收后的Trx-tag序列片段连接得到改造后的pETDuet-1和pRSFDuet-1载体;3)将改造后的pETDuet-1、pRSFDuet-1载体分别进行EcoR I、Pst I双酶切和Pst I、HindIII双酶切,猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c编码基因用EcoR I、Pst I双酶切,牛粘膜病毒的非结构蛋白NS2-3b编码基因用Pst I、Hind III双酶切;将双酶切之后的pETDuet-1、pRSFDuet-1载体分别与双酶切后的猪瘟病毒主要囊膜蛋白E2c编码基因、牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS2-3b编码基因连接得到表达载体pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b;4)对步骤3)所得表达载体pETDuet-1-E2c进行Bgl II、Xho I双酶切,表达载体pRSFDuet-1-NS2-3b进行Nae I、Xho I双酶切,同时用BglII、Xho I双酶切猪瘟病毒非结构蛋白NS2-3c编码基因,用Nae I、Xho I双酶切牛病毒性腹泻病毒主要囊膜蛋白E2b编码基因,将上述双酶切后的表达载体与病毒蛋白编码基因进行连接,构建pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b双表达载体。

5.
  根据权利要求4的构建方法,其特征在于步骤1)以猪瘟病毒基因组为模版,扩增出主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c的编码基因,以牛病毒性腹泻病毒基因组为模版,扩增出主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基 因。

6.
  根据权利要求5的构建方法,其特征在于各编码基因对应的引物分别为
E2c-F:CTCGAATTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC
E2c-R:GGCCTGCAGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGT
NS2-3c-F:CGCAGATCTAGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG
NS2-3c-R:CCGCTCGAGTAGACCAACTACTTGTTTTAG
NS2-3h-F:CGCCTGCAGGGGCCTGCCGTGTGTAAGAAG
NS2-3h-R:CATAAGCTTITACGCGTTCTGATCAAAATCAG
E2h-F:CGCGCCGGCCACTTGGATTGCAAACCTG
E2h-R:CCGCTCGAGCCCTAAGGCCTTCTGTTCTGA。

7.
  权利要求1的共表达载体的表达方法,其特征在于将共表达载体转化到同一宿主菌进行涂板,过夜培养,挑取单克隆菌落接种于LB培养基中,摇菌过夜,转接至新LB培养基中,加入IPTG进行诱导。

8.
  根据权利要求7的表达方法,其特征在于培养最终达到OD值0.6-0.8,所用IPTG浓度为0.8mmol/L。

说明书

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体及其构建和表达方法
技术领域
本发明涉及一种猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体,属于生物基因工程领域。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病,临床上以发病急、高热稽留、全身泛发性点状出血和脾梗死为主要特征,给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。近年来,猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势,其流行趋势发生了很大的变化,呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存,隐性感染和持续感染并现,以及猪瘟疫苗免疫失败的现象。牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)与猪瘟病毒同属黄病毒科、瘟病毒属成员。BVDV不仅感染牛,而且能感染猪、绵羊、山羊及野生动物,很多国家地区的研究证实了BVDV在猪群中存在不同程度的感染。猪感染BVDV可出现类似猪瘟的临床症状和病理变化,导致繁殖障碍、产仔数下降和流产。此外,先天性感染的仔猪出生后还可能形成持续感染和免疫耐受,并长期带毒。
目前,世界各国主要推广使用的猪瘟疫苗为弱毒疫苗,这种疫苗存在安全性不高,无法区分野毒感染和免疫接种,以及弱毒疫苗返强等缺陷。当前控制BVDV感染的手段为传统的灭活疫苗和基因修饰弱毒疫苗接种,但灭活疫苗只能起到部分保护,而BVDV基因修饰弱毒疫苗会抑制机体淋巴细胞和中性粒细胞的活性,产生免疫抑制,增强其他病毒的致病力。此外,在CSFV和BVDV弱毒疫苗的生产过程中,使用BVDV污染的血清,造成了疫苗的污染更增加了病毒的潜在传播。
近年来,本领域也开始尝试使用病毒活载体疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗等新型疫苗,但这类疫苗无法避免使用过程中基因重组的问题,导致其防治效果不稳定。
因此本领域亟待发明一种可以长期使用而不产生毒力返强,培养生产过程中避免使用血清,并且能有效预防和控制猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒感染的多价亚单位疫苗。
发明内容
针对现有技术的需要,本发明公开了一种猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的主要囊膜蛋白(E2)和非结构蛋白(NS2-3)共表达载体,能够在宿主菌中同时表达CSFV主要囊膜蛋白(E2c)和非结构蛋白(NS2-3c)及BVDV主要囊膜蛋白(E2b)和非结构蛋白(NS2-3b),并且蛋白的免疫原性不受破坏和改变。
为实现上述目的,本发明是通过下述技术方案实现的:
猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体,是在同一宿主菌中表达的双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1,二者分别连接有猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因,双表达载体与编码基因的连接关系为pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b
本发明所用的载体pETDuet-1、pRSFDuet-1是双表达载体,每一个载体上有两个启动子,属于单一载体双启动子系统,每一个蛋白的编码基因都有独立的一个启动子,每个启动子独立驱动外源蛋白的表达。
与传统的构建融合基因相比,本发明的双表达载体避免了基因之间的相互影响,保证了蛋白稳定表达,克服了串联表达表达量不足的缺点。并且通过在同一宿主菌中表达的双质粒表达系统,pETDuet-1和pRSFDuet-1作为复制子相同不相容的两个质粒,在Amp和Kana两种抗生素存在的压力下子代菌能够有效存活,不会被抗生素杀死,从而可以同时转化进入同一宿主菌后有效的表达外源基因。
为了便于规模化生产,降低培养难度,本发明所用的宿主菌为大肠杆菌,其培养简单,可以采用发酵罐实现规模化生产,从而有效控制质量,保证疫苗生产的安全性和有效性。
常规的生物工程中所用的大肠杆菌均可用于本发明,包括大肠杆菌BL21(DE3),和BL21(DE3)PLySs等。
相应的,本发明公开了上述共表达载体的构建方法,通过将猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因连接到双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1中,具体的制备过程包括下述步骤:
1)扩增猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因;
2)利用Nde I酶切pETDuet-1、pRSFDuet-1和pET-32a(+)载体,将酶切后的pETDuet-1、pRSFDuet-1分别与pET-32a(+)载体酶切回收后的Trx-tag序列片段连接得到改造后的pETDuet-1和pRSFDuet-1载体;
3)将改造后的pETDuet-1、pRSFDuet-1载体分别进行EcoR I、Pst I双酶切和Pst I、Hind III双酶切,猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c编码基因用EcoR I、Pst I双酶切,牛粘膜病毒的非结构蛋白NS2-3b编码基因用Pst I、Hind III双酶切;将双酶切之后的pETDuet-1、pRSFDuet-1载体分别与双酶切后的猪瘟病毒主要囊膜蛋白E2c编码基因、牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS2-3b编码基因连接得到表达载体pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b
4)对步骤3)所得表达载体pETDuet-1-E2c进行BglII、Xho I双酶切,表达载体pRSFDuet-1-NS2-3b进行Nae I、Xho I双酶切,同时用Bgl II、Xho I双酶切猪瘟病毒非结构蛋白NS2-3c编码基因,用Nae I、Xho I双酶切牛病毒性腹泻病毒主要囊膜蛋白E2b编码基因,将上述双酶切后的表达载体与病毒蛋白编码基因进行连接,构建pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b双表达载体。
通过上述制备过程,将E2b和NS2-3b编码基因经酶切、连接、转化后插入双表达载体pETDuet-1,将NS2-3b和E2b编码基因插入双表达载体pRSFDuet-1,然后把携带四个蛋白对应的编码基因的两个载体共同转化入一个宿主菌,实现高线稳定的同时表达四种蛋白,这是本发明与现有技术中的其它技术方案相比所具有的突破性的技术优势。
其中,步骤1)的编码基因即可从相关的生物制品公司和实验室购买成品或者合成,也可以猪瘟病毒株、牛病毒性腹泻毒株的基因组为模版结合相应的特异性引物采用PCR方法自行扩增,可采用的引物序列对应如下所示:
E2c-F:CTCGAATTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC(含EcoR I酶切位点)
E2c-R:GGCCTGCAGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGT(含Pst I酶切位点)
NS2-3c-F:CGCAGATCTAGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG(含Bg1II酶切位点)
NS2-3c-R:CCGCTCGAGTAGACCAACTACTTGTTTTAG(含Xho I酶切位点)
NS2-3b-F:CGCCTGCAGGGGCCTGCCGTGTGTAAGAAG(含Pst I酶切位点)
NS2-3b-R:CATAAGCTTTTACGCGTTCTGATCAAAATCAG(含Hind III酶切位点)
E2b-F:CGCGCCGGCCACTTGGATTGCAAACCTG(含Nae I酶切位点)
E2b-R:CCGCTCGAGCCCTAAGGCCTTCTGTTCTGA(含Xho I酶切位点)
PCR的条件和参数采用本领域常规实验条件即可。
其中,步骤2)采用Nde I对pETDuet-1、pRSFDuet-1和pET-32a(+)酶切,切开的pET-32a(+)的315bp小片段作为Trx-tag回收,再将切开的pETDuet-1和pRSFDuet-1分别与Trx-tag小片段连接,将读码框正确插入的pETDuet-1和pRSFDuet-1在大肠杆菌中扩增。通过此种方式,本发明利用pETDuet-1、pRSFDuet-1第二个多克隆位点(MCS2)的Nde I位点插入了Trx-tag,使表达的外源蛋白在N端融合Trx标签,改善了蛋白的可溶性。
通过上述构建方法所得到的共表达载体在菌株中诱导表达的四种抗原蛋白以包涵体形式存在,纯化的蛋白经Western-blot检测表明,能够与抗CSFV和抗BVDV的阳性血清发生反应,证明表达的多种蛋白具有很好的免疫原性。
在此基础上,本发明公开了所述共表达载体的表达方法,将共表达载体转化到同一宿主菌进行涂板,过夜培养,挑取单克隆菌落接种于LB培养基中,摇菌过夜,转接至新LB培养基中,加入IPTG进行诱导。
其中,培养最终达到OD值0.6-0.8,所用IPTG浓度为0.8mmol/L。
其中,所用的载体菌株采用适合于外源蛋白表达的菌株,优选的是BL21(DE3)、BL21(DE3)PLySs等。
与传统的疫苗相比,用本发明所涉及的共表达方法制备的疫苗可以用发酵罐规模化生产,实现质量控制,保证所生产的疫苗安全有效;本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白质,与其他新型疫苗(如活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗)相比不会发生可能出现基因重组问题,因此不存在生物安全性问题,可大规模推广应用。
附图说明
图1为pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b的酶切结果,其中1为pRSFDuet-NS2-3b-E2b的双酶切,2是pETDuet-E2c-NS2-3c的双酶切,M是10000bp Marker;
图2是共表达载体在大肠杆菌中表达的四种免疫蛋白表达的SDS-PAGE图,其中:M为蛋白质分子质量标准;1为未诱导的菌体;2为质粒pETDuet-E2c-NS2-3c;3为质粒pRSFDuet-NS2-3b-E2b;4为质粒pETDuet-E2c-NS2-3c和质粒pRSFDuet-NS2-3b-E2b
图3是四种表达的蛋白抗原性效果图,其中1是未诱导的菌体;2为表达的蛋白与标签抗体的反应;3为表达的蛋白与阳性血清的反应;4为表达的蛋白与阴性血清的反应。
具体实施方式
在下述实施例中,申请人提供了一种具体的共表达载体构建和表达过程,并且详细描述了所用原料的来源,仅为示意,并非构成特别限定。本领域技术人员采用符合公知定义的相关原料和实验条件也可实现本发明的发明目的。
在下述实施中,所用原料来源如下:
猪瘟病毒株:石门株(Shimen),实验室常规保存,也可从其他实验室或国家菌种保藏中心购买。
牛病毒性腹泻毒株:VEDEVAC,实验室保存,也可从其他实验室或国家菌种保藏中心购买。
pETDuet-1和pRSFDuet-1双表达载体,pET-32a(+)载体,均购自Novagen公司。
BL21(DE3)是四个外源蛋白的表达宿主菌,购自北京全式金生物技术有限公司。
所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。
所用酶和试剂:限制性内切酶Nde I、Bgl II、EcoR I、Pst I、Hind III、Nae I、Xho I,T4DNA连接酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase聚合酶和AMV反转录酶均购自大连宝生物有限公司;IPTG、SDS(十二烷基磺酸钠)、核酸Marker、Agarose DNA extraction kit、DNA快速纯化回收试剂盒和质粒快速提取试剂盒均购自大连宝生物工程公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit,购自QIAGEN公司;琼脂糖购自Invitrogen公司;预染蛋白Marker购自Fermentas公司。
实施例1:共表达载体的构建
1.E2c、NS2-3c、NS2-3b和E2b蛋白编码基因的扩增
按QIAamp Viral RNA Mini Kit操作说明提取Shimen株PK15细胞上清和VEDEVAC株MDBK细胞培养上清的病毒RNA。以E2c-R、NS2-3c-R、NS2-3b-R、E2b-R为反转录引物进行反转录,合成cDNA。然后分别以此为模板扩增出各个目的基因。
RT-PCR 25μL反应体系:PrimeSTAR 0.25μL,5×PrimeSTAR缓冲液5μL,dNTP 2μL,上、下游引物各1μL,模板3μL,去离子水12.75μL。PCR产物用DNA胶回收试剂盒回收,从而得到四个蛋白目的蛋白的编码基因。
2.pETDuet-1和pRSFDuet-1载体的改造
将pETDuet-1和pRSFDuet-1和pET-32a(+)载体分别用Nde I酶切,40μL酶切体系:10×H缓冲液4μL,Nde I各2μL,载体24μL,去离子水10μL。
用胶回收试剂盒回收切开的pETDuet-1和pRSFDuet-1,将切开的pET-32a(+)的315bp小片段(即Trx-tag编码基因)也同样回收;再将切开的pETDuet-1和pRSFDuet-1分别与315bp的Trx-tag编码基因连接,连接体系:10×T4DNALigase Buffer 2.5μL,Trx-tag编码基因胶回收产物14μL,pETDuet-1或者pRSFDuet-12μL,T4DNALigase 1μL,去离子水5.5μL。对改造后的载体进行测序。
3.pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b载体的构建
pETDuet-1和pRSFDuet-1两个载体分别进行EcoR I、Pst I双酶切和Pst I、Hind III双酶切,40μL酶切体系:10×H或10×M缓冲液4μL,对应的限制性内切酶各2μL,载体24μL,去离子水10μL。
酶切产物经1%琼脂糖电泳后胶回收。
E2c编码基因用EcoR I、Pst I双酶切,NS2-3b编码基因用Pst I、Hind III双酶切;40μL酶切体系:10×H或10×M缓冲液4μL,对应的限制性内切酶各2μL,目的基因24μL,去离子水10μL。
酶切产物经1%琼脂糖电泳后胶回收,然后分别与双酶切的pETDuet-1、pRSFDuet-1的载体连接,两个连接体系分别是:①10×T4DNA Ligase Buffer 2.5μL,E2c编码基因胶回收产物14μL,pETDuet-12μL,T4DNALigase 1μL,去离子水5.5μL;②10×T4DNALigase Buffer 2.5μL,NS2-3b编码基因胶回收产物14μL,pRSFDuet-12μL,T4DNALigase 1μL,去离子水5.5μL。
16℃连接过夜,分别转化Trans109感受态细胞,挑取单克隆菌落分别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定,并对构建的载体测序,确定成功构建了pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b表达载体。
4.pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b载体的构建
对pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b分别进行Bgl II、Xho I和Nae I、Xho I双酶切,40μL酶切体系:10×H或10×L缓冲液4μL,限制性内切酶各2μL, 载体24μL,去离子水10μL。
酶切产物经1%琼脂糖电泳后胶回收。
用Bgl II、Xho I双酶切NS2-3c编码的基因,用Nae I、Xho I双酶切E2b编码的基因,40μL酶切体系:10×H或10×L缓冲液4μL,限制性内切酶各2μL,目的基因24μL,去离子水10μL。
酶切产物经1%琼脂糖电泳后胶回收。回收的酶切产物分别与双酶切后的pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b载体连接,两个连接体系分别是:①10×T4DNALigase Buffer 2.5μL,NS2-3c编码基因回收产物14μL,pETDuet-1-E2c回收产物2μL,T4DNALigase 1μL,去离子水5.5μL;②10×T4DNALigase Buffer 2.5μL,E2b的编码基因胶回收产物14μL,pRSFDuet-1-NS2-3b回收产物2μL,T4DNA Ligase 1μL,去离子水5.5μL。
16℃连接过夜,分别转化Trans109感受态细胞,挑取单克隆菌落分别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定,并对构建的载体测序,确定成功构建了pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b表达载体(参考图1)。
实施例2:共表达载体的表达
将pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b表达载体各0.5μL,同时转化BL21(DE3)宿主菌,涂板,过夜培养,挑取单克隆菌落接种于新鲜10mL LB培养基中,摇菌过夜,按1100比例转接新鲜10mL LB培养基中,OD值达0.6-0.8时取1mL菌液作为未诱导样品,其余加入终浓度0.8mM的IPTG,诱导4h,每小时收取1mL菌液样品。
表达完成后,进行SDS-PAGE检测以确定表达是否有效。
SDS-PAGE溶液组成如下:
Tris-甘氨酸缓冲液:25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸(pH 8.0)、0.1%SDS。
2×SDS Loading buffer:100mmol/L Tris Cl(pH8.0)、200mmol/L巯基乙醇、4%SDS、0.2%溴酚蓝、20%甘油。
考马斯亮蓝染色液:45mL甲醇、45mL水、10mL冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮蓝R250。
脱色液:30%甲醇、10%冰乙酸,蒸馏水补体积至100mL。
SDS-PAGE检测过程如下:
(1)洗净玻璃板,固定在电泳槽上,用2.0%琼脂糖封边。常规方法配制15% 的分离胶5mL,迅速注入两玻璃板之间,胶顶覆盖1mL双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆盖层液体,用去离子水冲洗凝胶顶部数次,倒置空干液体,加入2mL 5%的浓缩胶溶液,插上梳子,垂直放置电泳槽使其凝固。
(2)小心移去梳子,在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液,用注射器冲洗加样孔数次,将电源负极与上槽相连。
(3)收集的菌液12000rpm离心2min,用50μLpH7.4的PBS悬浮,加入等体积的2×SDS上样buffer,混匀,水浴煮沸10min,用微量进样器上样10μL,打开电源,用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶,把电压提高到120V,继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。
(4)染色:取下凝胶用蒸馏水冲洗,用5倍凝胶体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶,放在脱色摇床上室温染色3h。
(5)脱色:用30%甲醇、10%冰乙酸的混合液,在脱色摇床上脱色过夜,其间更换染色液3~4次。待蓝色背景完全脱净后,将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。
结果如附图2所示,由附图2可见,成功实现了四种蛋白的共表达。
在上述基础上,本发明还进行了四种蛋白的免疫原性检测(Western Blot),SDS-PAGE结束后,取下凝胶,切掉浓缩胶,根据分离胶的大小裁剪PVDF膜,然后将膜在甲醇中浸泡20s,转移至去离子水中漂洗一下,最后置于蛋白转移液中浸泡5min。在蛋白转移液中按照滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序铺好,注意凝胶对应负极,膜对应正极,夹紧夹子,放入转移槽内,接通电源,350mA转渍150min,将蛋白转印至PVDF膜上。将膜置于5%脱脂奶粉中封闭非特异性蛋白质,室温,2h。将膜置于标签抗体或阳性血清工作液中,在摇床上4℃摇晃过夜,PBST洗膜4次,每次15min,将膜置于二抗工作液中,在摇床上,室温摇晃孵育1.5h,PBST洗膜4次,每次15min。洗涤结束后,用去离子水清洗PVDF膜一次,稍微晾干,将膜置于塑料保鲜膜内,在暗室中等量混合ECL显色系统中A、B液,滴加至PVDF膜上,作用1min;裁剪X-胶片,放在膜上,盖上胶片夹,曝光适当时间,取出胶片显影,定影,扫描胶片,进行分析。
参考图3所示,显示了本发明的共表达载体表达的蛋白与血清的免疫反应效果,显示了本发明共表达的四种蛋白具有良好的免疫原性。

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1、10申请公布号CN104152479A43申请公布日20141119CN104152479A21申请号201410377167X22申请日20140801C12N15/70200601C12N15/6620060171申请人中国农业科学院兰州兽医研究所地址730046甘肃省兰州市盐场堡徐家坪1号72发明人周继章宫晓炜曹小安李兆才陈启伟74专利代理机构北京方圆嘉禾知识产权代理有限公司11385代理人董芙蓉54发明名称猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体及其构建和表达方法57摘要本发明公开了猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体及其构建和表达方法,。

2、所述的共表达载体基于分子克隆技术将猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2C和非结构蛋白NS23C及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2B和非结构蛋白NS23B的编码基因分别与双表达载体PETDUET1、PRSFDUET1连接。本发明的共表达载体能够同时表达猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白,可用于制备多价亚单位疫苗、防控猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒。51INTCL权利要求书2页说明书6页序列表2页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页序列表2页附图2页10申请公布号CN104152479ACN104152479A1/2页21猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒。

3、的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体,其特征在于在同一宿主菌中表达的双表达载体PETDUET1、PRSFDUET1上分别连接有猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2C和非结构蛋白NS23C及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2B和非结构蛋白NS23B的编码基因,双表达载体与编码基因的连接关系为PETDUETE2CNS23C和PRSFDUETNS23BE2B。2根据权利要求1的共表达载体,其特征在于宿主菌为大肠杆菌。3权利要求1的共表达载体的构建方法,其特征在于包括将猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2C和非结构蛋白NS23C及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2B和非结构蛋白NS23B的编码基因连接到双表达载体PETD。

4、UET1、PRSFDUET1的步骤。4根据权利要求3的构建方法,其特征在于具体包括下述步骤1扩增猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2C和非结构蛋白NS23C及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2B和非结构蛋白NS23B的编码基因;2利用NDEI酶切PETDUET1、PRSFDUET1和PET32A载体,将酶切后的PETDUET1、PRSFDUET1分别与PET32A载体酶切回收后的TRXTAG序列片段连接得到改造后的PETDUET1和PRSFDUET1载体;3将改造后的PETDUET1、PRSFDUET1载体分别进行ECORI、PSTI双酶切和PSTI、HINDIII双酶切,猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2C编。

5、码基因用ECORI、PSTI双酶切,牛粘膜病毒的非结构蛋白NS23B编码基因用PSTI、HINDIII双酶切;将双酶切之后的PETDUET1、PRSFDUET1载体分别与双酶切后的猪瘟病毒主要囊膜蛋白E2C编码基因、牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS23B编码基因连接得到表达载体PETDUET1E2C和PRSFDUET1NS23B;4对步骤3所得表达载体PETDUET1E2C进行BGLII、XHOI双酶切,表达载体PRSFDUET1NS23B进行NAEI、XHOI双酶切,同时用BGLII、XHOI双酶切猪瘟病毒非结构蛋白NS23C编码基因,用NAEI、XHOI双酶切牛病毒性腹泻病毒主要囊膜蛋白E2。

6、B编码基因,将上述双酶切后的表达载体与病毒蛋白编码基因进行连接,构建PETDUETE2CNS23C和PRSFDUETNS23BE2B双表达载体。5根据权利要求4的构建方法,其特征在于步骤1以猪瘟病毒基因组为模版,扩增出主要囊膜蛋白E2C和非结构蛋白NS23C的编码基因,以牛病毒性腹泻病毒基因组为模版,扩增出主要囊膜蛋白E2B和非结构蛋白NS23B的编码基因。6根据权利要求5的构建方法,其特征在于各编码基因对应的引物分别为E2CFCTCGAATTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACE2CRGGCCTGCAGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTNS23CFCGCAGATCTA。

7、GGGCCTGCCGTTTGCAAGAAGNS23CRCCGCTCGAGTAGACCAACTACTTGTTTTAGNS23HFCGCCTGCAGGGGCCTGCCGTGTGTAAGAAGNS23HRCATAAGCTTITACGCGTTCTGATCAAAATCAGE2HFCGCGCCGGCCACTTGGATTGCAAACCTGE2HRCCGCTCGAGCCCTAAGGCCTTCTGTTCTGA。7权利要求1的共表达载体的表达方法,其特征在于将共表达载体转化到同一宿主菌进行涂板,过夜培养,挑取单克隆菌落接种于LB培养基中,摇菌过夜,转接至新LB培养基中,加入IPTG进行诱导。8根据权利要求7的表达。

8、方法,其特征在于培养最终达到OD值0608,所用IPTG浓权利要求书CN104152479A2/2页3度为08MMOL/L。权利要求书CN104152479A1/6页4猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体及其构建和表达方法技术领域0001本发明涉及一种猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体,属于生物基因工程领域。背景技术0002猪瘟CLASSICALSWINEFEVER,CSF是由猪瘟病毒CLASSICALSWINEFEVERVIRUS,CSFV引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病,临床上以发病急、高热稽留、全身泛发性点状出血和脾梗死为主要特。

9、征,给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。近年来,猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势,其流行趋势发生了很大的变化,呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存,隐性感染和持续感染并现,以及猪瘟疫苗免疫失败的现象。牛病毒性腹泻病毒BOVINEVIRALDIARRHEAVIRUS,BVDV与猪瘟病毒同属黄病毒科、瘟病毒属成员。BVDV不仅感染牛,而且能感染猪、绵羊、山羊及野生动物,很多国家地区的研究证实了BVDV在猪群中存在不同程度的感染。猪感染BVDV可出现类似猪瘟的临床症状和病理变化,导致繁殖障碍、产仔数下降和流产。此外,先天性感染的仔猪出生后还可能形成持续感染和免疫耐受,并长期带毒。0003目前,世。

10、界各国主要推广使用的猪瘟疫苗为弱毒疫苗,这种疫苗存在安全性不高,无法区分野毒感染和免疫接种,以及弱毒疫苗返强等缺陷。当前控制BVDV感染的手段为传统的灭活疫苗和基因修饰弱毒疫苗接种,但灭活疫苗只能起到部分保护,而BVDV基因修饰弱毒疫苗会抑制机体淋巴细胞和中性粒细胞的活性,产生免疫抑制,增强其他病毒的致病力。此外,在CSFV和BVDV弱毒疫苗的生产过程中,使用BVDV污染的血清,造成了疫苗的污染更增加了病毒的潜在传播。0004近年来,本领域也开始尝试使用病毒活载体疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗等新型疫苗,但这类疫苗无法避免使用过程中基因重组的问题,导致其防治效果不稳定。0005因此本领域亟待发。

11、明一种可以长期使用而不产生毒力返强,培养生产过程中避免使用血清,并且能有效预防和控制猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒感染的多价亚单位疫苗。发明内容0006针对现有技术的需要,本发明公开了一种猪瘟病毒CLASSICALSWINEFEVERVIRUS,CSFV和牛病毒性腹泻病毒BOVINEVIRALDIARRHEAVIRUS,BVDV的主要囊膜蛋白E2和非结构蛋白NS23共表达载体,能够在宿主菌中同时表达CSFV主要囊膜蛋白E2C和非结构蛋白NS23C及BVDV主要囊膜蛋白E2B和非结构蛋白NS23B,并且蛋白的免疫原性不受破坏和改变。0007为实现上述目的,本发明是通过下述技术方案实现的0008猪瘟病。

12、毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体,是在同一宿主菌中表达的双表达载体PETDUET1、PRSFDUET1,二者分别连接有猪瘟病毒的说明书CN104152479A2/6页5主要囊膜蛋白E2C和非结构蛋白NS23C及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2B和非结构蛋白NS23B的编码基因,双表达载体与编码基因的连接关系为PETDUETE2CNS23C和PRSFDUETNS23BE2B。0009本发明所用的载体PETDUET1、PRSFDUET1是双表达载体,每一个载体上有两个启动子,属于单一载体双启动子系统,每一个蛋白的编码基因都有独立的一个启动子,每个启动子独立驱动外源蛋白的表。

13、达。0010与传统的构建融合基因相比,本发明的双表达载体避免了基因之间的相互影响,保证了蛋白稳定表达,克服了串联表达表达量不足的缺点。并且通过在同一宿主菌中表达的双质粒表达系统,PETDUET1和PRSFDUET1作为复制子相同不相容的两个质粒,在AMP和KANA两种抗生素存在的压力下子代菌能够有效存活,不会被抗生素杀死,从而可以同时转化进入同一宿主菌后有效的表达外源基因。0011为了便于规模化生产,降低培养难度,本发明所用的宿主菌为大肠杆菌,其培养简单,可以采用发酵罐实现规模化生产,从而有效控制质量,保证疫苗生产的安全性和有效性。0012常规的生物工程中所用的大肠杆菌均可用于本发明,包括大肠。

14、杆菌BL21DE3,和BL21DE3PLYSS等。0013相应的,本发明公开了上述共表达载体的构建方法,通过将猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2C和非结构蛋白NS23C及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2B和非结构蛋白NS23B的编码基因连接到双表达载体PETDUET1、PRSFDUET1中,具体的制备过程包括下述步骤00141扩增猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2C和非结构蛋白NS23C及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2B和非结构蛋白NS23B的编码基因;00152利用NDEI酶切PETDUET1、PRSFDUET1和PET32A载体,将酶切后的PETDUET1、PRSFDUET1分别与PET32A载体酶。

15、切回收后的TRXTAG序列片段连接得到改造后的PETDUET1和PRSFDUET1载体;00163将改造后的PETDUET1、PRSFDUET1载体分别进行ECORI、PSTI双酶切和PSTI、HINDIII双酶切,猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2C编码基因用ECORI、PSTI双酶切,牛粘膜病毒的非结构蛋白NS23B编码基因用PSTI、HINDIII双酶切;将双酶切之后的PETDUET1、PRSFDUET1载体分别与双酶切后的猪瘟病毒主要囊膜蛋白E2C编码基因、牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS23B编码基因连接得到表达载体PETDUET1E2C和PRSFDUET1NS23B;00174对步骤3所得表。

16、达载体PETDUET1E2C进行BGLII、XHOI双酶切,表达载体PRSFDUET1NS23B进行NAEI、XHOI双酶切,同时用BGLII、XHOI双酶切猪瘟病毒非结构蛋白NS23C编码基因,用NAEI、XHOI双酶切牛病毒性腹泻病毒主要囊膜蛋白E2B编码基因,将上述双酶切后的表达载体与病毒蛋白编码基因进行连接,构建PETDUETE2CNS23C和PRSFDUETNS23BE2B双表达载体。0018通过上述制备过程,将E2B和NS23B编码基因经酶切、连接、转化后插入双表达载体PETDUET1,将NS23B和E2B编码基因插入双表达载体PRSFDUET1,然后把携带四个蛋白对应的编码基因的。

17、两个载体共同转化入一个宿主菌,实现高线稳定的同时表达四种蛋白,说明书CN104152479A3/6页6这是本发明与现有技术中的其它技术方案相比所具有的突破性的技术优势。0019其中,步骤1的编码基因即可从相关的生物制品公司和实验室购买成品或者合成,也可以猪瘟病毒株、牛病毒性腹泻毒株的基因组为模版结合相应的特异性引物采用PCR方法自行扩增,可采用的引物序列对应如下所示0020E2CFCTCGAATTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC含ECORI酶切位点0021E2CRGGCCTGCAGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGT含PSTI酶切位点0022NS23CFCGCAGAT。

18、CTAGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG含BG1II酶切位点0023NS23CRCCGCTCGAGTAGACCAACTACTTGTTTTAG含XHOI酶切位点0024NS23BFCGCCTGCAGGGGCCTGCCGTGTGTAAGAAG含PSTI酶切位点0025NS23BRCATAAGCTTTTACGCGTTCTGATCAAAATCAG含HINDIII酶切位点0026E2BFCGCGCCGGCCACTTGGATTGCAAACCTG含NAEI酶切位点0027E2BRCCGCTCGAGCCCTAAGGCCTTCTGTTCTGA含XHOI酶切位点0028PCR的条件和参数采用本领域常规实验。

19、条件即可。0029其中,步骤2采用NDEI对PETDUET1、PRSFDUET1和PET32A酶切,切开的PET32A的315BP小片段作为TRXTAG回收,再将切开的PETDUET1和PRSFDUET1分别与TRXTAG小片段连接,将读码框正确插入的PETDUET1和PRSFDUET1在大肠杆菌中扩增。通过此种方式,本发明利用PETDUET1、PRSFDUET1第二个多克隆位点MCS2的NDEI位点插入了TRXTAG,使表达的外源蛋白在N端融合TRX标签,改善了蛋白的可溶性。0030通过上述构建方法所得到的共表达载体在菌株中诱导表达的四种抗原蛋白以包涵体形式存在,纯化的蛋白经WESTERNB。

20、LOT检测表明,能够与抗CSFV和抗BVDV的阳性血清发生反应,证明表达的多种蛋白具有很好的免疫原性。0031在此基础上,本发明公开了所述共表达载体的表达方法,将共表达载体转化到同一宿主菌进行涂板,过夜培养,挑取单克隆菌落接种于LB培养基中,摇菌过夜,转接至新LB培养基中,加入IPTG进行诱导。0032其中,培养最终达到OD值0608,所用IPTG浓度为08MMOL/L。0033其中,所用的载体菌株采用适合于外源蛋白表达的菌株,优选的是BL21DE3、BL21DE3PLYSS等。0034与传统的疫苗相比,用本发明所涉及的共表达方法制备的疫苗可以用发酵罐规模化生产,实现质量控制,保证所生产的疫苗。

21、安全有效;本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白质,与其他新型疫苗如活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗相比不会发生可能出现基因重组问题,因此不存在生物安全性问题,可大规模推广应用。附图说明0035图1为PETDUETE2CNS23C和PRSFDUETNS23BE2B的酶切结果,其中1为PRSFDUETNS23BE2B的双酶切,2是PETDUETE2CNS23C的双酶切,M是10000BPMARKER;0036图2是共表达载体在大肠杆菌中表达的四种免疫蛋白表达的SDSPAGE图,其中M为蛋白质分子质量标准;1为未诱导的菌体;2为质粒PETDUETE2CNS23C;3为质粒PRSFDUETNS23BE2B;。

22、4为质粒PETDUETE2CNS23C和质粒PRSFDUETNS23BE2B0037图3是四种表达的蛋白抗原性效果图,其中1是未诱导的菌体;2为表达的蛋白与说明书CN104152479A4/6页7标签抗体的反应;3为表达的蛋白与阳性血清的反应;4为表达的蛋白与阴性血清的反应。具体实施方式0038在下述实施例中,申请人提供了一种具体的共表达载体构建和表达过程,并且详细描述了所用原料的来源,仅为示意,并非构成特别限定。本领域技术人员采用符合公知定义的相关原料和实验条件也可实现本发明的发明目的。0039在下述实施中,所用原料来源如下0040猪瘟病毒株石门株SHIMEN,实验室常规保存,也可从其他实验。

23、室或国家菌种保藏中心购买。0041牛病毒性腹泻毒株VEDEVAC,实验室保存,也可从其他实验室或国家菌种保藏中心购买。0042PETDUET1和PRSFDUET1双表达载体,PET32A载体,均购自NOVAGEN公司。0043BL21DE3是四个外源蛋白的表达宿主菌,购自北京全式金生物技术有限公司。0044所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。0045所用酶和试剂限制性内切酶NDEI、BGLII、ECORI、PSTI、HINDIII、NAEI、XHOI,T4DNA连接酶、PRIMESTARHSDNAPOLYMERASE聚合酶和AMV反转录酶均购自大连宝生物有限公司;IPTG、SDS十二烷基磺。

24、酸钠、核酸MARKER、AGAROSEDNAEXTRACTIONKIT、DNA快速纯化回收试剂盒和质粒快速提取试剂盒均购自大连宝生物工程公司;QIAAMPVIRALRNAMINIKIT,购自QIAGEN公司;琼脂糖购自INVITROGEN公司;预染蛋白MARKER购自FERMENTAS公司。0046实施例1共表达载体的构建00471E2C、NS23C、NS23B和E2B蛋白编码基因的扩增0048按QIAAMPVIRALRNAMINIKIT操作说明提取SHIMEN株PK15细胞上清和VEDEVAC株MDBK细胞培养上清的病毒RNA。以E2CR、NS23CR、NS23BR、E2BR为反转录引物进行。

25、反转录,合成CDNA。然后分别以此为模板扩增出各个目的基因。0049RTPCR25L反应体系PRIMESTAR025L,5PRIMESTAR缓冲液5L,DNTP2L,上、下游引物各1L,模板3L,去离子水1275L。PCR产物用DNA胶回收试剂盒回收,从而得到四个蛋白目的蛋白的编码基因。00502PETDUET1和PRSFDUET1载体的改造0051将PETDUET1和PRSFDUET1和PET32A载体分别用NDEI酶切,40L酶切体系10H缓冲液4L,NDEI各2L,载体24L,去离子水10L。0052用胶回收试剂盒回收切开的PETDUET1和PRSFDUET1,将切开的PET32A的31。

26、5BP小片段即TRXTAG编码基因也同样回收;再将切开的PETDUET1和PRSFDUET1分别与315BP的TRXTAG编码基因连接,连接体系10T4DNALIGASEBUFFER25L,TRXTAG编码基因胶回收产物14L,PETDUET1或者PRSFDUET12L,T4DNALIGASE1L,去离子水55L。对改造后的载体进行测序。00533PETDUET1E2C和PRSFDUET1NS23B载体的构建0054PETDUET1和PRSFDUET1两个载体分别进行ECORI、PSTI双酶切和PSTI、HINDIII双酶切,40L酶切体系10H或10M缓冲液4L,对应的限制性内切酶各2L,载。

27、说明书CN104152479A5/6页8体24L,去离子水10L。0055酶切产物经1琼脂糖电泳后胶回收。0056E2C编码基因用ECORI、PSTI双酶切,NS23B编码基因用PSTI、HINDIII双酶切;40L酶切体系10H或10M缓冲液4L,对应的限制性内切酶各2L,目的基因24L,去离子水10L。0057酶切产物经1琼脂糖电泳后胶回收,然后分别与双酶切的PETDUET1、PRSFDUET1的载体连接,两个连接体系分别是10T4DNALIGASEBUFFER25L,E2C编码基因胶回收产物14L,PETDUET12L,T4DNALIGASE1L,去离子水55L;10T4DNALIGAS。

28、EBUFFER25L,NS23B编码基因胶回收产物14L,PRSFDUET12L,T4DNALIGASE1L,去离子水55L。005816连接过夜,分别转化TRANS109感受态细胞,挑取单克隆菌落分别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定,并对构建的载体测序,确定成功构建了PETDUET1E2C和PRSFDUET1NS23B表达载体。00594PETDUETE2CNS23C和PRSFDUETNS23BE2B载体的构建0060对PETDUET1E2C和PRSFDUET1NS23B分别进行BGLII、XHOI和NAEI、XHOI双酶切,40L酶切体系10H或10L缓冲液4L,限制性内切酶各2L,载体24L。

29、,去离子水10L。0061酶切产物经1琼脂糖电泳后胶回收。0062用BGLII、XHOI双酶切NS23C编码的基因,用NAEI、XHOI双酶切E2B编码的基因,40L酶切体系10H或10L缓冲液4L,限制性内切酶各2L,目的基因24L,去离子水10L。0063酶切产物经1琼脂糖电泳后胶回收。回收的酶切产物分别与双酶切后的PETDUET1E2C和PRSFDUET1NS23B载体连接,两个连接体系分别是10T4DNALIGASEBUFFER25L,NS23C编码基因回收产物14L,PETDUET1E2C回收产物2L,T4DNALIGASE1L,去离子水55L;10T4DNALIGASEBUFFER。

30、25L,E2B的编码基因胶回收产物14L,PRSFDUET1NS23B回收产物2L,T4DNALIGASE1L,去离子水55L。006416连接过夜,分别转化TRANS109感受态细胞,挑取单克隆菌落分别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定,并对构建的载体测序,确定成功构建了PETDUETE2CNS23C和PRSFDUETNS23BE2B表达载体参考图1。0065实施例2共表达载体的表达0066将PETDUETE2CNS23C和PRSFDUETNS23BE2B表达载体各05L,同时转化BL21DE3宿主菌,涂板,过夜培养,挑取单克隆菌落接种于新鲜10MLLB培养基中,摇菌过夜,按1100比例转接新鲜1。

31、0MLLB培养基中,OD值达0608时取1ML菌液作为未诱导样品,其余加入终浓度08MM的IPTG,诱导4H,每小时收取1ML菌液样品。0067表达完成后,进行SDSPAGE检测以确定表达是否有效。0068SDSPAGE溶液组成如下0069TRIS甘氨酸缓冲液25MMOL/LTRIS、250MMOL/L甘氨酸PH80、01SDS。00702SDSLOADINGBUFFER100MMOL/LTRISCLPH80、200MMOL/L巯基乙醇、4说明书CN104152479A6/6页9SDS、02溴酚蓝、20甘油。0071考马斯亮蓝染色液45ML甲醇、45ML水、10ML冰醋酸中溶解025G考马斯亮。

32、蓝R250。0072脱色液30甲醇、10冰乙酸,蒸馏水补体积至100ML。0073SDSPAGE检测过程如下00741洗净玻璃板,固定在电泳槽上,用20琼脂糖封边。常规方法配制15的分离胶5ML,迅速注入两玻璃板之间,胶顶覆盖1ML双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆盖层液体,用去离子水冲洗凝胶顶部数次,倒置空干液体,加入2ML5的浓缩胶溶液,插上梳子,垂直放置电泳槽使其凝固。00752小心移去梳子,在电泳装置上、下槽间加入TRIS甘氨酸缓冲液,用注射器冲洗加样孔数次,将电源负极与上槽相连。00763收集的菌液12000RPM离心2MIN,用50LPH74的PBS悬浮,加入等体积的2SDS上样BUFF。

33、ER,混匀,水浴煮沸10MIN,用微量进样器上样10L,打开电源,用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶,把电压提高到120V,继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。00774染色取下凝胶用蒸馏水冲洗,用5倍凝胶体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶,放在脱色摇床上室温染色3H。00785脱色用30甲醇、10冰乙酸的混合液,在脱色摇床上脱色过夜,其间更换染色液34次。待蓝色背景完全脱净后,将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。0079结果如附图2所示,由附图2可见,成功实现了四种蛋白的共表达。0080在上述基础上,本发明还进行了四种蛋白的免疫原性检测WESTERNBLOT,SDSPAGE结束后,取下凝胶,切掉浓缩胶,根据分。

34、离胶的大小裁剪PVDF膜,然后将膜在甲醇中浸泡20S,转移至去离子水中漂洗一下,最后置于蛋白转移液中浸泡5MIN。在蛋白转移液中按照滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序铺好,注意凝胶对应负极,膜对应正极,夹紧夹子,放入转移槽内,接通电源,350MA转渍150MIN,将蛋白转印至PVDF膜上。将膜置于5脱脂奶粉中封闭非特异性蛋白质,室温,2H。将膜置于标签抗体或阳性血清工作液中,在摇床上4摇晃过夜,PBST洗膜4次,每次15MIN,将膜置于二抗工作液中,在摇床上,室温摇晃孵育15H,PBST洗膜4次,每次15MIN。洗涤结束后,用去离子水清洗PVDF膜一次,稍微晾干,将膜置于塑料保鲜膜内,在暗室中等量混合ECL显色系统中A、B液,滴加至PVDF膜上,作用1MIN;裁剪X胶片,放在膜上,盖上胶片夹,曝光适当时间,取出胶片显影,定影,扫描胶片,进行分析。0081参考图3所示,显示了本发明的共表达载体表达的蛋白与血清的免疫反应效果,显示了本发明共表达的四种蛋白具有良好的免疫原性。说明书CN104152479A1/2页1000010002序列表CN104152479A102/2页11序列表CN104152479A111/2页12图1图2说明书附图CN104152479A122/2页13图3说明书附图CN104152479A13。

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