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1、(10)申请公布号 CN 102807595 A (43)申请公布日 2012.12.05 CN 102807595 A *CN102807595A* (21)申请号 201110152947.0 (22)申请日 2011.06.02 C07H 17/07(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (71)申请人 汉中天然谷生物科技有限公司 地址 723206 陕西省城固县沙河营镇汉中天 然谷生物科技有限公司 (72)发明人 王平 李雪松 任晓峰 李建 卢义德 苗志宏 (54) 发明名称 一种从淫羊藿属植物制备高含量 (98 ) 淫 羊藿甙的技术 (57) 摘要 本发明涉及一种从。
2、淫羊藿属植物中制备含量 大于 98的淫羊藿甙的方法。它是将淫羊藿叶子 粉碎过目， 从淫羊藿中提取淫羊藿甙， 利用极性或 者弱极性的大孔树脂进行初分离， 利用溶剂处理 法对粗分离淫羊藿甙进行纯化， 利用溶剂处理法 对初结晶物进行重结晶处理 ； 该发明的技术优势 在于 ： a) 联合使用大孔树脂和有机溶剂纯化法相 结合， 使产品的回收率和纯度都有明显的提高。 b) 简化生产工艺， 缩短生产周期， 使生产成本有所降 低。c) 使用了无毒无害的有机溶剂， 大大降低了 产品中有毒有害溶剂的残留量， 提高了产品的品 质。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中。
3、华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种从淫羊藿属植物制备高含量 (98 ) 淫羊藿甙的技术， 其特征在于 ： 1) 从淫羊藿中提取淫羊藿甙 ： 将淫羊藿叶子粉碎过 10 目， 加其重量 12-15 倍量的含水 有机溶剂()加热回流提取三次， 每次提取1.5小时， 过滤提取液， 用含水有机溶剂() 洗涤提取渣， 合并提取液及洗涤液， 减压浓缩至一定的比重， 就得到淫羊藿甙的粗提液 ； 上 述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂的含量为 40-95v ； 上述有机溶剂包括 ： 甲醇、 乙醇、 甘 油、 丙酮、 正丁。
4、醇、 乙酸乙酯 ； 2) 粗分离淫羊藿甙 ： 利用极性或者弱极性的大孔树脂进行初分离 ； 将非离子型的极性 或者弱极性大孔网状吸附树脂置于乙醇中浸泡 24 小时， 然后用乙醇、 去离子水依次冲洗树 脂 ； 将经过上述过程活化过的树脂， 用重力沉降法装柱 ； 将过程 1) 中得到的粗提液经过滤 后， 清夜上样， 在采用含水有机溶剂 ( ) 对大孔树脂进行洗脱， 分段收集， 用 HPLC 法检测 洗脱过程， 在 270nm 直到检测不出淫羊藿甙 ； 减压浓缩收集的各部分洗脱液， 就得到粗分离 的淫羊藿甙产物 ； 上述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂的含量为 20-90v ； 上述含水有机 溶剂 (。
5、 ) 中的有机溶剂包括 ： 甲醇、 乙醇、 丙酮、 正丁醇 ； 3)纯化粗分离淫羊藿甙 ： 利用溶剂处理法对粗分离淫羊藿甙进行纯化 ； 将过程2)得到 的粗分离的淫羊藿甙产物， 用含水有机溶剂 ( ) 加热溶解， 过滤， 不溶物再用含水有机溶 剂 ( ) 加热溶解一次， 合并两次过滤液， 减压浓缩至含有机溶剂至一定浓度， 静置， 放凉， 析晶， 过滤结晶物， 用有机溶剂 ( ) 洗涤结晶物 ； 上述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂的 含量为 30-90v ； 上述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂包括 ： 甲醇、 乙醇、 丙酮、 异丙醇 ； 上 述有机溶剂 ( ) 包括 ： 甲醇、 乙醇、 丙酮。
6、 ； 4)重结晶处理 ： 利用溶剂处理法对初结晶物进行重结晶处理 ； 将过程3)得到的初结晶 物， 用含水有机溶剂()加热回流溶解， 过滤， 清夜浓缩至一定的浓度， 静置， 结晶， 过滤结 晶物， 再用含水有机溶剂()对结晶物加热溶解， 过滤， 过滤液静置， 结晶， 过滤结晶物， 就 得到含量大于98的淫羊藿甙产物 ； 上述含水有机溶剂()中有机溶剂含量为50-90v； 上述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂包括 ： 甲醇、 乙醇、 丙酮、 异丙醇中的一种或者更多 ； 上 述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂含量为 70-95v； 上述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂 包括 ： 甲醇、 乙醇、 丙。
7、酮、 异丙醇。 2. 按权利要求 1 所述的一种从淫羊藿属植物制备高含量 (98 ) 淫羊藿甙的技术， 其 特征在于 ： 所述步骤 1) 中淫羊藿属植物包括心叶淫羊藿、 柔毛淫羊藿、 朝鲜淫羊藿和巫山 淫羊藿。 3. 按权利要求 1 所述的一种从淫羊藿属植物制备高含量 (98 ) 淫羊藿甙的技术， 其 特征在于 ： 所述步骤 2) 中所用的大孔网状吸附树脂包括聚丙乙烯树脂、 聚苯乙烯树脂、 聚 甲基丙烯酸酯树脂、 丙烯酰胺与苯乙烯共聚物树脂。 4. 按权利要求 1 所述的一种从淫羊藿属植物制备高含量 (98 ) 淫羊藿甙的技术， 其 特征在于 ： 所述步骤 3)、 过程 4) 中有机溶剂的用量。
8、为 15-30 倍量 ； 所述步骤 3)、 过程 4) 中 静置， 析晶时间为 24-48 小时。 权 利 要 求 书 CN 102807595 A 2 1/4 页 3 一种从淫羊藿属植物制备高含量 (98 ) 淫羊藿甙的技术 技术领域 0001 本发明涉及一种从淫羊藿属植物中制备含量大于 98的淫羊藿甙的方法。 背景技术 0002 淫羊藿属小檗科植物心叶淫羊藿 (Epimedium brevicornum Maxim.)、 箭叶淫羊 藿 (Epimedium sagittatum Maxim.)、 柔毛淫羊藿 (Epimedium pubescens Maxim.)、 或朝 鲜淫羊藿 (Ep。
9、imedium koreanum Nakai) 的干燥茎叶。淫羊藿主要含有主要含黄酮类化 合物、 木脂素、 生物碱、 挥发油等， 其中黄酮类主要包括淫羊藿甙 (icariin)、 淫羊藿次甙 (icarisoside) 等， ； 朝鲜淫羊藿含淫羊藿甙、 淫羊藿新甙 (epimedoside)A、 B、 C、 D、 E 等 ； 箭 叶淫羊藿含淫羊藿甙、 脱水淫羊藿甙元 -3-O- 鼠李糖甙， 淫羊藿甙元 -3-O- 鼠李糖 甙， 槲皮素等。 目前主要研究内容是分离纯化淫羊藿甙的工艺， 淫羊藿甙主要用于改善心脑 血管系统功能、 增强机体免疫能力、 促进 DNA 合成及预防和治疗性功能障碍等， 淫羊。
10、藿甙还 有抗衰老和抗肿瘤作用。 0003 目前， 淫羊藿甙提取方法主要有水提醇沉、 醇提水沉、 酶法提取、 超声波提取、 微波 助提等， 纯化方法有絮凝剂纯化法、 大孔树脂联合纯化法、 硅胶层析柱纯化法、 聚酰胺层析 纯化法等。 但是现有工艺生产的产品存在以下几个问题 ： 产品含量普遍偏低、 产品生产成本 较高、 产品有毒有机溶剂残留量较高、 提纯步骤冗长、 生产周期长、 生产工艺对环境污染较 严重。 0004 中国专利文献公开的 “一种制备高纯度淫羊藿甙的方法” ( 申请号 ： 01120115)， 其特征在于 ： 它是采用高速逆流色谱 (HSCCC) 法从淫羊藿粗提物中制备高纯度的淫羊 藿。
11、甙， 其溶剂体系由 A、 B、 C 三个组分组成， A 组分可以为氯仿， 二氯甲烷， 四氯化碳， 1， 2- 二氯乙烷等氯代物 ； B 组分可以为甲醇， 乙醇， 乙腈， 丙酮等 ； C 组分为水， 体积比依次为 2-6 1-5 1-4。 0005 “从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷及总黄酮的方法” ( 申请号 ： 200810196890)， 其特 征在于包括如下步骤 ： a. 将淫羊藿药材加至逆流提取罐内， 再将 20-40乙醇缓慢倒入提 取罐中， 乙醇用量为淫羊藿重量的 10-30 倍， 提取 2-4 次， 每次 1-1.5 小时 ； 每次按 5L/kg 药材量添加新的溶剂 ； b. 合并上述数。
12、次提取液， 以离心机分离 ； 收集上清液 ； c. 以孔径为 0.02-0.1m的微滤膜除沉过滤， 跨膜压力为0.1-0.3Mpa， 料液温度为30-60度， 得透过液 ； d.将所得透过液通过截留分子量为1000-50000的超滤膜分离， 跨膜压力0.5-1Mpa， 料液温 度 30-50， 得超滤液 ； e. 将所得超滤液以截留分子量为 200-500 的纳滤膜处理， 跨膜压力 为1-2Mpa， 料液温度30-50， 得截留液 ； f.将截留液干燥， 干燥温度60以下， 干燥物水份 5.0， 干燥物即为淫羊藿有效成分富集物。 发明内容 0006 本发明的目的是为从淫羊藿属植物中制备高含量 。
13、(98 ) 淫羊藿甙开发一种新工 艺， 以便解决目前市场上生产该产品的技术中所存在的问题， 以便得到高回收率和高含量 说 明 书 CN 102807595 A 3 2/4 页 4 的淫羊藿甙产品。 0007 本发明的目的主要通过以下技术过程来实现 ： 0008 具体步骤如下 ： 0009 1) 从淫羊藿中提取淫羊藿甙 ： 将淫羊藿叶子粉碎过 10 目， 加其重量 12-15 倍量的 含水有机溶剂 ( ) 加热回流提取三次， 每次提取 1.5 小时， 过滤提取液， 用含水有机溶剂 ( ) 洗涤提取渣， 合并提取液及洗涤液， 减压浓缩至一定的比重， 就得到淫羊藿甙的粗提 液 ； 上述含水有机溶剂 。
14、( ) 中有机溶剂的含量为 40-95v ； 上述有机溶剂包括 ： 甲醇、 乙 醇、 甘油、 丙酮、 正丁醇、 乙酸乙酯 ； 0010 2) 粗分离淫羊藿甙 ： 利用极性或者弱极性的大孔树脂进行初分离。将非离子型的 极性或者弱极性大孔网状吸附树脂置于乙醇中浸泡 24 小时， 然后用乙醇、 去离子水依次冲 洗树脂 ； 将经过上述过程活化过的树脂， 用重力沉降法装柱 ； 将过程 1) 中得到的粗提液经 过滤后， 清夜上样， 在采用含水有机溶剂 ( ) 对大孔树脂进行洗脱， 分段收集， 用 HPLC 法 检测洗脱过程， 在 270nm 直到检测不出淫羊藿甙 ； 减压浓缩收集的各部分洗脱液， 就得到粗。
15、 分离的淫羊藿甙产物 ； 上述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂的含量为 20-90v ； 上述含水 有机溶剂 ( ) 中的有机溶剂包括 ： 甲醇、 乙醇、 丙酮、 正丁醇 ； 0011 3)纯化粗分离淫羊藿甙 ： 利用溶剂处理法对粗分离淫羊藿甙进行纯化。 将过程2) 得到的粗分离的淫羊藿甙产物， 用含水有机溶剂 ( ) 加热溶解， 过滤， 不溶物再用含水有 机溶剂()加热溶解一次， 合并两次过滤液， 减压浓缩至含有机溶剂至一定浓度， 静置， 放 凉， 析晶， 过滤结晶物， 用有机溶剂 ( ) 洗涤结晶物 ； 上述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂 的含量为 30-90v ； 上述含水有机溶剂 (。
16、 ) 中有机溶剂包括 ： 甲醇、 乙醇、 丙酮、 异丙醇 ； 上述有机溶剂 ( ) 包括 ： 甲醇、 乙醇、 丙酮 ； 0012 4) 重结晶处理 ： 利用溶剂处理法对初结晶物进行重结晶处理。将过程 3) 得到的 初结晶物， 用含水有机溶剂()加热回流溶解， 过滤， 清夜浓缩至一定的浓度， 静置， 结晶， 过滤结晶物， 再用含水有机溶剂 ( ) 对结晶物加热溶解， 过滤， 过滤液静置， 结晶， 过滤结 晶物， 就得到含量大于 98的淫羊藿甙产物 ； 上述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂含量为 50-90v ； 上述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂包括 ： 甲醇、 乙醇、 丙酮、 异丙醇 ； 上。
17、述含水 有机溶剂 ( ) 中有机溶剂含量为 70-95v ； 上述含水有机溶剂 ( ) 中有机溶剂包括 ： 甲醇、 乙醇、 丙酮、 异丙醇 ； 0013 所述步骤 1) 中淫羊藿属植物包括心叶淫羊藿、 柔毛淫羊藿、 朝鲜淫羊藿和巫山淫 羊藿。 0014 所述步骤 2) 中所用的大孔网状吸附树脂包括聚丙乙烯树脂、 聚苯乙烯树脂、 聚甲 基丙烯酸酯树脂、 丙烯酰胺与苯乙烯共聚物树脂。 0015 所述步骤 3)、 过程 4) 中有机溶剂的用量为 15-30 倍量 ； 0016 所述步骤 3)、 过程 4) 中静置， 析晶时间为 24-48 小时。 0017 该发明所述说的一种从淫羊藿属植物制备高含量。
18、 (98 ) 淫羊藿甙的技术优势在 于 ： 0018 a) 联合使用大孔树脂和有机溶剂纯化法相结合， 使产品的回收率和纯度都有明显 的提高。 0019 b) 简化生产工艺， 缩短生产周期， 使生产成本有所降低。 说 明 书 CN 102807595 A 4 3/4 页 5 0020 c) 使用了无毒无害的有机溶剂， 大大降低了产品中有毒有害溶剂的残留量， 提高 了产品的品质。 附图说明 0021 图 1 为粗分离淫羊藿甙产物的 HPLC 分析图谱 0022 图 2 为初结晶淫羊藿甙产物的 HPLC 分析图谱 0023 图 3 为重结晶淫羊藿甙产物 (98 ) 的 HPLC 分析图谱 0024 。
19、具体实施实例 0025 实例 1 ： 0026 1) 提取 ： 将 200g 淫羊藿甙含量为 0.6原料经过粉碎， 放入 3000ml 三角瓶中， 加入 2000ml、 70含水乙醇溶液， 提取三次， 一次 1.5H/ 次， 合并三次提取液， 减压浓缩至 d 1.08( 比重 )， 约 300ml， 加去离子水稀释至 500ml， 静置、 放凉、 过滤， 清夜 490ml 待用， 经 HPLC 检测， 清夜中淫羊藿甙的浓度为 2.4mg/ml， 有效成分回收率为 98。 0027 2) 粗分离 ： 将 1) 中待用的 490ml 清夜上样于经过处理的 200g 大孔树脂 HPD-100( 沧州。
20、宝恩 )， HPLC 检测上样过程， 上样结束后， 用去离子水洗脱杂质， 再用梯度洗 脱淫羊藿甙， 收集 50含水乙醇洗脱部分， 减压浓缩， 得到粗分离产物 3.0g， 经 HPLC 检测， 含量为 38， 有效成分回收率为 94.8 . 0028 3) 初结晶 ： 将 2) 中得到的粗分离产物 3.0g， 用 65含水丙加热溶解， 回流两次， 合并两次清夜， 浓缩至 d 1.05( 比重 )， 加丙酮调节浓缩液中丙酮含量为 50， 静置、 结 晶、 过滤， 得到初结晶粉末 1.65g， 经 HPLC 检测含量为 65.4， 有效成分回收率为 90。 0029 4) 重结晶 ： 将 3) 中得。
21、到的 1.65g 初结晶用不含水丙酮热回流溶解两次， 每次 30min， 合并两次清夜， 浓缩至 1/3 体积， 冷却结晶， 结晶再用不含水丙酮重结晶一次， 得到 最终结晶产物 0.98g， 经 HPLC 检测含量为 98.23， 有效成分回收率为 80。 0030 实例 2 ： 0031 1) 提取 ： 将 200g 淫羊藿甙含量为 0.6原料经过粉碎， 放入 3000ml 三角瓶中， 加入 2000ml、 70含水乙醇溶液， 提取三次， 一次 1.5H/ 次， 合并三次提取液， 减压浓缩至 d 1.06( 比重 )， 约 350ml， 加去离子水稀释至 600ml， 静置、 放凉、 过滤，。
22、 清夜 580ml 待用， 经 HPLC 检测， 清夜中淫羊藿甙的浓度为 2.07mg/ml， 有效成分回收率为 100。 0032 2) 粗分离 ： 将 1) 中待用的 580ml 清夜上样于经过处理的 200g 大孔树脂 DM-130( 山东鲁抗 )， HPLC 检测上样过程， 上样结束后， 用去离子水洗脱杂质， 再用梯度洗脱 淫羊藿甙， 收集40含水乙醇洗脱部分， 减压浓缩， 得到粗分离产物2.45g， 经HPLC检测， 含 量为 47.2， 有效成分回收率为 96 . 0033 3) 初结晶 ： 将 2) 中得到的粗分离产物 2.45g， 用 80含水丙加热溶解， 回流两次， 合并两次。
23、清夜， 浓缩至 d 1.08( 比重 )， 加丙酮调节浓缩液中丙酮含量为 70， 静置、 结 晶、 过滤， 得到初结晶粉末 1.58g， 经 HPLC 检测含量为 70.2， 有效成分回收率为 92。 0034 4)重结晶 ： 将3)中得到的1.58g初结晶用乙醇热回流溶解两次， 每次30min， 合并 两次清夜， 浓缩至 l/4 体积， 冷却结晶， 结晶再用无水乙醇重结晶一次， 得到最终结晶产物 1.05g， 经 HPLC 检测含量为 98.86， 有效成分回收率为 87。 0035 实例 3 ： 说 明 书 CN 102807595 A 5 4/4 页 6 0036 1) 提取 ： 将 2。
24、00g 淫羊藿甙含量为 0.6原料经过粉碎， 放入 3000ml 三角瓶中， 加入 2000ml、 70含水乙醇溶液， 提取三次， 一次 1.5H/ 次， 合并三次提取液， 减压浓缩至 d 1.08( 比重 )， 约 300ml， 加去离子水稀释至 500ml， 静置、 放凉、 过滤， 清夜 500ml 待用， 经 HPLC 检测， 清夜中淫羊藿甙的浓度为 2.3mg/ml， 有效成分回收率为 95.8。 0037 2)粗分离 ： 将1)中待用的500ml清夜上样于经过处理的200g大孔树脂LX-11(西 安蓝晓 )， HPLC 检测上样过程， 上样结束后， 用去离子水洗脱杂质， 再用梯度洗脱。
25、淫羊藿 甙， 收集 50含水乙醇洗脱部分， 减压浓缩， 得到粗分离产物 3.2g， 经 HPLC 检测， 含量为 35.7， 有效成分回收率为 95 . 0038 3) 初结晶 ： 将 2) 中得到的粗分离产物 3.2g， 用 80含水丙加热溶解， 回流两次， 合并两次清夜， 浓缩至 d 1.08( 比重 )， 加丙酮调节浓缩液中丙酮含量为 60， 静置、 结 晶、 过滤， 得到初结晶粉末 1.7g， 经 HPLC 检测含量为 63.9， 有效成分回收率为 91。 0039 4) 重结晶 ： 将 3) 中得到的 1.7g 初结晶用 80热回流溶解两次， 每次 30min， 合并 两次清夜， 浓缩至 1/4 体积， 调节乙醇含量至 50， 冷却结晶， 结晶再用不含水丙酮重结晶 一次， 得到最终结晶产物 1.02g， 经 HPLC 检测含量为 98.67， 有效成分回收率为 84。 说 明 书 CN 102807595 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102807595 A 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 102807595 A 8 。