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1、10申请公布号CN104087564A43申请公布日20141008CN104087564A21申请号201410316859322申请日20140704C12N9/10200601C12N15/54200601C07K16/40200601C12P13/06200601A61K38/45200601A61K45/00200601A61K48/00200601A61P25/28200601A61P25/00200601A61K31/68520060171申请人福建医科大学地址350004福建省福州市台江区交通路88号72发明人朱玲74专利代理机构福州智理专利代理有限公司35208代理人王义星5。
2、4发明名称缓呆肽在制备磷脂酰丝氨酸及治疗神经系统疾病中的应用57摘要本发明公开了一种缓呆肽及其制备方法以及其在制备磷脂酰丝氨酸PHOSPHATIDYLSERINE，PS中的应用及其在治疗中枢神经系统疾病，包括脑力的保健药物中的应用。本发明描述了缓呆肽及其编码该蛋白多肽的多核苷酸序列。同时阐明了该蛋白多肽和多核苷酸的制备方法；并就其在制备磷脂酰丝氨酸中的应用及其在调节神经免疫系统的功能，拮抗阿尔茨海默病AD的作用等功能研究做了科学的表述。尤为重要的是指明了该蛋白多肽和多核苷酸在治疗中枢神经系统疾病，包括脑力的保健药物中的应用等巨大开发前景。51INTCL权利要求书2页说明书15页序列表4页附图3。
3、页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书15页序列表4页附图3页10申请公布号CN104087564ACN104087564A1/2页21一种新的缓呆肽及其编码该蛋白多肽的多核苷酸序列。它包含由各种表达载体表达的PEGFP缓呆肽融合蛋白，缓呆肽融合蛋白，或其保守性变体、生物活性片段、类似物或衍生物。也包含具有SEQIDN02氨基酸序列的多肽。2能编码该多肽的多核苷酸，具有SEQIDN01多核苷酸序列。它也包含选自能编码下组氨基酸的一种核苷酸序列或其变体。A编码具有SEQIDN02氨基酸序列的多肽的多核苷酸；B与多核苷酸A互补的多核苷酸；C与A或B的多核苷酸序列具有。
4、至少88相同性的多核苷酸；更佳地,该多核苷酸的序列是能编码选自下组的一种A具有SEQIDN02中4956位的序列；和B具有SEQIDN02中124131位的序列；和C具有SEQIDN02中170179位的序列。3如权利要求1或2所述的多核苷酸的变异体，其编码与该有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物；此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体；这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体；如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。4一种新的多肽一缓呆肽，其基。
5、本上是由SEQIDN02所示的氨基酸序列组成的；该多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞中产生；根据重组生产方案所用的宿主，该的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的；该多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。5含有编码权利要求2所述的缓呆肽的多核苷酸的重组载体，特别是表达载体；含有编码缓呆肽的多核苷酸的基因工程化宿主细胞；编码缓呆肽的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有该所述多核苷酸的重组载体；包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体；缓呆肽的。
6、多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞；术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞；代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或SF9；动物细胞如CHO、COS或BOWES黑素瘤细胞等。6一种缓呆肽的抗体,及涉及一种能与该多肽特异性结合的抗体。7本发明还涉及本发明的多肽或多核苷酸在制备磷脂酰丝氨酸中的应用。其特征在于融合蛋白缓呆肽的转酰基活性为2060U/MG。其生物学活性有效范围约在05NG/ML150M。
7、G/ML。最佳范围30NG/ML80G/ML,2MG/ML10MG/ML。8一种缓呆肽的多肽或多核苷酸在制备治疗中枢神经系统疾病,包括脑力的保健药物中的应用。其特征在于缓呆肽的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可治疗中枢神经系统疾病,包括脑力的保健等；包括将该的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用；这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合；组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。权利要求书CN104087564A2/2页39根据权利要求8、9所述用途，其特征在于将缓呆肽或由其。
8、制备的磷脂酰丝氨酸或缓呆肽与磷脂酰丝氨酸的不同比例混合物，添加适当的药用辅料，按常规的制剂工艺，即可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、口服液等口服药物制剂和冻干粉剂、水剂的注射药物制剂等。权利要求书CN104087564A1/15页4缓呆肽在制备磷脂酰丝氨酸及治疗神经系统疾病中的应用0001本发明描述了缓呆肽及其编码该蛋白多肽的多核苷酸序列。同时阐明了该蛋白多肽和多核苷酸在制备磷脂酰丝氨酸PHOSPHATIDYLSERINE，PS和治疗神经系统疾病中的应用等功能研究做了科学的表述。尤为重要的是指明了该蛋白多肽和多核苷酸的巨大开发前景。0002技术领域本发明所属领域包括以下内容。00031分子生。
9、物学范畴。00042蛋白分子研究领域。00053免疫学功能研究领域。00064疾病治疗医学研究领域。背景技术00071分子生物学本申请的主体是缓呆肽及其编码该蛋白多肽的多核苷酸序列。而该蛋白质基因是从DAUDI细胞中提取MRNA，经剪切、拼接变构，克隆获得了不含膜结合部位及信号肽的，可编码199个氨基酸的缓呆肽CDNA序列。00082蛋白分子研究同时建立了稳定表达有增强型绿色荧光蛋白和无绿色荧光蛋白的融合蛋白的CHO细胞株，大批量提取蛋白，检测其水解和磷脂酰基转移活性，并进行体内用药的示踪定位，从而为进一步研究缓呆肽的生物催化作用及其药效奠定基础。00093生物催化功能研究0010缓呆肽也是一。
10、种活性酶，其底物有磷脂酰肌醇PHOSPHATEIDYLINASITOL，磷脂酰乙醇胺PHOSPHATIDYLETHANOLAMINE等，但其主要的底物为磷脂酰胆碱PHOSPHATIDYLCHOLINE，PC。在生理条件下，缓呆肽水解PC产生PA和胆碱；另一方面，PLD在有合适醇类受体存在的情况下，还能催化各种含羟基的底物结合到磷脂的碱基上,形成新的磷脂。这一特性即转酰基活性，该反应叫做转磷脂酰基反应TRANSPHOSPHATIDYLATIONREACTION或碱基交换反应BASEEXCHANGE。在短链伯醇存在的情况下，PLD优先催化PC与短链伯醇发生转磷脂酰基TRANSPHOSPHATIDY。
11、IATION反应，产生稳定的磷脂酰醇PHASPHATIDYIALEOHO1和水。转磷脂酰基反应是目前检测PLD活性的特异性反应，许多研究也利用此反应抑制缓呆肽的生理性产物PA的生成。00114抗炎及神经免疫调节功能的研究0012通过运用A140脑内注射建立AD模型，并采用免疫组化、尼氏染色、ELISA等多种实验手段，我们证实了缓呆肽不仅脑内注射无明显毒性，而且和与PS一样对阿尔茨海默病AD干预有效。0013因为缓呆肽注入脑内后可迁移至皮质、丘脑，少部分停留于海马，通过与细胞膜融合定位于细胞膜表面，对AD起到与PS干预效果类似的减轻作用。另缓呆肽不仅可以对AD的行为学改变起到减轻作用，还能抑制A。
12、D病程中的神经元丢失、椎体层断裂等病理改变，对神经元起到保护作用。缓呆肽还能够抑制T淋巴细胞向AD模型脑实质中的浸润以及脑内TGF1的分泌；并能抑制外周血TH1型细胞的增多；尤其是我们的实验还首次证实了说明书CN104087564A2/15页5缓呆肽能够抑制AD模型中TREG细胞的减少，促进FOXP3表达的作用。0014缓呆肽拮抗AD的可能机制为发挥其转酰基活性催化得到PS，进而通过PS发挥抗AD的效果；通过缓呆肽本身所具有的神经元保护功能，提高神经元的存活率；还可能通过抑制TGF1、IFN等炎性介质的释放以及促进TREG细胞的增多等功能，发挥拮抗AD的作用。发明内容0015一缓呆肽的应用本申。
13、请的主体是缓呆肽具有磷脂酰基转移活性，能催化大豆卵磷脂PC生成磷脂酰丝氨酸PS产品；不仅可体内定位示踪，还可以具有调节神经免疫系统的功能，达到拮抗阿尔茨海默病AD的作用。0016二发明的特征00171、缓呆肽的特征00181本研究室已纯化干燥的缓呆肽蛋白产品是一种无味的白色或淡黄色的粉末。较易溶于水，其溶解度在常温下为88100。缓呆肽蛋白分子量为48KD。0019融合蛋白缓呆肽的转酰基活性为2060U/MG。其生物学活性有效范围约在05NG/ML150MG/ML。最佳范围30NG/ML80G/ML,2MG/ML10MG/ML。00202其编码基因序列为不含膜结合部位及信号肽的，可编码199个。
14、氨基酸的缓呆肽CDNA序列,全长605BP。详见SEQIDNO1。00213缓呆肽的氨基酸多肽序列,全长199个氨基酸。详见SEQIDNO2。00222、缓呆肽的应用特点00231本发明人通过基因变构重组表达了具有较高活性的缓呆肽。现经实验证实该物质具有水解活性，而且具有磷脂酰基转移活性。可利用缓呆肽催化大豆卵磷脂与L丝氨酸制备得到磷脂酰丝氨酸PHOSPHATIDYLSERINE，PS。00242本发明人通过大量实验数据表明缓呆肽和PS一样均具有拮抗阿尔茨海默病AD的作用。0025本发明的目的00261提供分离的新的缓呆肽多肽，它包含具有SEQIDN02氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活。
15、性片段、类似物或衍生物。00272提供编码该多肽的多核苷酸。它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体0028A编码具有SEQIDN02氨基酸序列的多肽的多核苷酸；0029B与多核苷酸A互补的多核苷酸；0030C与A或B的多核苷酸序列具有至少88相同性的多核苷酸。0031即本发明提供了分离的核酸多核苷酸，基本由编码具有SEQIDN02氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括SEQIDN01的核苷酸序列。00323本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括CDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟。
16、多肽的编码区序列可以与SEQIDN01所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。编码SEQIDN02的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列和任选的附加编码序列以及非编说明书CN104087564A3/15页6码序列。00334本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代。
17、、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。00345本发明提供了一种新的多肽一一缓呆肽，其基本上是由SEQIDN02所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。00356提供含有编码缓呆肽的多核苷酸的重组载体。特别是表达载体；本发明中，编码缓呆肽的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体。
18、、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。0036本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件如启动子、增强子等和选择性标记基因。00377提供含有编码缓呆肽的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。本发明中，缓呆肽的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或SF9；动物细胞如CHO、CO。
19、S或BOWES黑素瘤细胞等。00388提供生产缓呆肽的方法。用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CACL2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MGCL2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。0039通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的缓呆肽。一般来说有以下步骤00401用本发明的编码缓呆肽的。
20、多核苷酸或变异体，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；2在合适的培养基中培养宿主细胞；3从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。0041在步骤2中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法如温度转换或化学诱导诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。0042在步骤3中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。说明书CN104087564A4/15页7这些方法是本领域技术人员所熟知的。。
21、这些方法包括但并不限于常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理盐析方法、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析HPLC和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。00439本发明的编码缓呆肽的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于1用探针与基因组或CDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和2表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段。004410提供针对本发明的缓呆肽的抗体,及涉及一种能与本发明多肽特异性结合的抗体。004511本发明涉及本发明的多肽或多核苷酸在制备磷脂酰丝。
22、氨酸中的应用。即本发明提供了一种用缓呆肽酶解大豆磷脂生产磷脂酰丝氨酸的工艺流程和技术。004612可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于中枢神经系统疾病阿尔茨海默病AD的防治,包括脑力的保健等。0047本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明0048下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。0049图1是。
23、本发明缓呆肽的PCR产物凝胶电泳图。0050图2为缓呆肽蛋白的WESTERNBLOT检测图。蛋白质的分子量为48KDA。0051图1PCR产物凝胶电泳图图2蛋白的WESTERNBLOT检测图0052MMARKER1重组质粒PEGFP缓呆肽MMARKER；00532HIND和BAMH双酶切重组质粒PEGFP缓呆肽1PEGFP缓呆肽转染COS7细胞00542空质粒转染COS7细胞；00553COS7细胞4不加样品0056图3是本发明缓呆肽和人磷脂酶的氨基酸序列同源性比较图。FROMNET是缓呆肽。0057图4缓呆肽催化大豆卵磷脂PC生成磷脂酰丝氨酸PS的薄层层析图0058泳道1,2为标准PS,曝光。
24、前后PS斑点均可清晰显示0059泳道3,4为大豆卵磷脂PC,PC斑点显示清晰0060泳道5,6,7为为用缓呆肽催化大豆卵磷脂PC和L丝氨酸后的反应生成物,在与标准PS位点同一水平上可见清晰的斑点,说明反应生成物中含有PS。说明书CN104087564A5/15页8具体实施方式0061一实施案例0062下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如SANLBROOK等人，分子克隆实验室手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，1989中所述的条件，或。
25、按照制造厂商所建议的条件。0063实施例1缓呆肽的克隆0064缓呆肽的克隆系列根据研究及应用的需要，我们构建了一系列的缓呆肽克隆。0065根据GENBANK公布的已知的CDNA序列进行引物设计与合成。含有HKD1结构基因PLD2CDNA的上下游引物为0066克隆11F5CGAAGCTTGTGTCCGTGTGTCTATTCTG3SEQIDN03；1R5GCGATATCTCCAAGGTCAGTCAGTCGG3SEQIDN04；预期扩增片段长248BP。0067克隆2含有HKD2结构基因CDNA的上下游引物为2F5CGGATATCTCAATCCTGCATCGCCT3SEQIDN05；2R5CGGGT。
26、ACCGGCCAGCTCACTGTCCCG3SEQIDN06；预期扩增片段长219BP。0068克隆3含有CT结构基因CDNA的上下游引物为3F5CGGGTACCTTGGCTCGGTCTGAGCTC3SEQIDN07；3R5CGGGATCCCTATGTCCACACTTCTAGGG3SEQIDN08；预期扩增片段长132BP。0069克隆4PEGFPC1缓呆肽6HIS0070根据重组质粒PEGFP缓呆肽的测序报告，委托上海英骏生物工程技术服务有限公司进行引物的设计与合成。在原下游引物3端连续引入6个编码组氨酸的序列，上下游引物分别引入相应的酶切位点上游用HIND限制性酶切位点；下游用BAMHI限。
27、制性酶切位点和保护碱基。引物序列如下0071上游引物为F5CGAAGCTTGTGTCCGTGTGTCTATTCTG3SEQIDN090072下游引物为R5CGGGATCCCTAATGATGATGATGATGATGTGTCCACACTTCTAGGG3SEQIDN0100073将引物用灭菌双蒸水溶解，每条引物浓度均为10M,20保存备用。并分别引入HIND、ECOR、KPNI、BAMHI限制性内切酶位点。0074克隆5重组质粒PCDNA31缓呆肽6HIS0075具体步骤参照分子克隆。DNA序列测定表明PCR产物的DNA序列与序列表1所示的1605BP完全相同。见图10076表1RTPCR的引物序列。
28、0077PRIMER15CGAAGCTTGTGTCCGTGTGTCTATTCTG3SEQIDNO30078PRIMER25GCGATATCTCCAAGGTCAGTCAGTCGG3SEQIDNO40079PRIMER35CGGATATCTCAATCCTGCATCGCCT3SEQIDNO50080PRIMER45CGGGTACCGGCCAGCTCACTGTCCCG3SEQIDNO60081PRIMER55CGGGTACCTTGGCTCGGTCTGAGCTC3SEQIDNO70082PRIMER65CGGGATCCCTATGTCCACACTTCTAGGG3SEQIDNO80083PRIMER75CG。
29、AAGCTTGTGTCCGTGTGTCTATTCTG3SEQIDNO9说明书CN104087564A6/15页90084PRIMER85CGGGATCCCTAATGATGATGATGATGATGTGTCCACACTTCTAGGG3SEQIDNO100085实施例2缓呆肽表达载体的构建0086PCR产物采用基因内引物PCR扩增和基因内限制性内切酶酶切方法进行分析鉴定正确后，克隆到载体PUCMTVECTOR/PSK或PEGFPC1真核表达载体上。分别采用酶切、PCR及测序鉴定其正确性。继而获得了不含膜结合部位及信号肽的，可编码199个氨基酸的缓呆肽CDNA序列。0087克隆2重组质粒PCDNA31。
30、缓呆肽6HIS0088克隆3PEGFPC1缓呆肽6HIS0089实施例3缓呆肽蛋白的鉴定及活性分析0090缓呆肽蛋白的检测0091具体检测方法同3332，设1泳道加预染蛋白MARKER10L，用上样缓冲液补至30L，另设3个泳道分别加PEGFP缓呆肽转染的CHO细胞株，空质粒PEGFPC1转染的CHO细胞株，未转染CHO细胞株的总蛋白各30L，依次用鼠抗人PLD2一抗和山羊抗小鼠二抗孵育。0092融合蛋白PEGFP缓呆肽活性的测定0093融合蛋白PEGFP缓呆肽水解活性的测定0094样品准备00951准备好60MM细胞培养皿的待测培养细胞约5106细胞。00962小心加入3MLGENMED清理。
31、液，覆盖细胞生长表面。00973小心抽去清理液。00984使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞。00995加入3MLGENMED清理液，混匀细胞。01006移入到预冷的15ML锥形离心管01017放进4台式离心机，300G离心5MIN。01028小心抽去上清液。01039加入500LGENMED裂解液，充分混匀。010410转移到预冷的15ML的离心管中。010511强力漩涡震荡15秒。010612置于冰槽里孵育30分钟。010713放进4台式离心机，16000G离心5MIN。010814小心移取500L上清液到新的预冷的15ML离心管。010915取20L进行蛋白定量检测。011016即刻放进80保存。
32、或置于冰槽里继续后续操作。0111细胞总蛋白的定量测定0112用BRAFORD方法测定蛋白浓度，具体方法见下01131配制蛋白标准品05MGBSA加入到1MLPBS中，完全溶解。01142将蛋白标准品按照0L，1L，2L，4L，8L，12L，16L，20L分别加入到96孔酶标反应板中，再加入PBS至总体积20L。说明书CN104087564A7/15页1001153将所提取的蛋白样品10L加入到96孔酶标板中，用PBS补充到20L。做2个复孔。01164各孔加入200LG250染色液，室温放置5MIN。将标准品的第一个孔设为试剂对照组，用酶标仪测定波长570NM处的吸光度，结果见表3。0117。
33、5根据蛋白标准的浓度与吸光度之间的关系，绘制标准曲线，计算的蛋白样品浓度。0118缓呆肽水解活性的测定0119用GENMED细胞缓呆肽水解活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒检测缓呆肽的水解活性，其具体的检测原理为磷脂酰胆碱在突触核蛋白敏感性缓呆肽的作用下，水解产生磷脂酸和胆碱后，通过肌胆碱激酶，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶系统，测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的峰值变化，来定量分析缓呆肽的水解活性。缓呆肽连续循环反应体系为01200121具体操作步骤见下01221背景对照测定0123移取170LGENMED缓冲液到新的15ML的离心管。0124加入25LGENMED反应。
34、液。0125加入10LGENMED阴性液。0126漩涡震荡5秒。0127在30温度下孵育10MIN,期间漩涡震荡3次，每次5秒。0128煮沸5分钟，室温下静置15MIN冷却。说明书CN104087564A108/15页110129转移到250L的比色皿中，加入25LGENMED酶促液，充分混匀。0130放进分光光度仪中，置零。0131取出比色皿，加入20LGENMED底色液，充分混匀。0132即刻放进分光光度仪中检测，此为背景空对照读数0分钟读数5分钟读数。01332样品总活性测定0134移取170LGENMED缓冲液到新的15ML的离心管。0135加入25LGENMED反应液。0136加入1。
35、0LPEGFP缓呆肽转染细胞株的总蛋白。0137漩涡震荡5秒。0138在30温度下孵育10MIN,期间漩涡震荡3次，每次5秒。0139煮沸5分钟，室温下静置15MIN冷却。0140转移到250L的比色皿中，加入25LGENMED酶促液，充分混匀。0141放进分光光度仪中，置零。0142取出比色皿，加入20LGENMED底色液，充分混匀。0143即刻放进分光光度仪中检测，此为样品总活性读数0分钟读数5分钟读数。01443样品非特异活性测定0145移取160LGENMED缓冲液到新的15ML的离心管。0146加入10LGENMED专性液。0147加入10LPEGFP缓呆肽转染细胞株的总蛋白。014。
36、8在30温度下孵育5分钟，加入25LGENMED反应液，漩涡震荡5秒。0149在30温度下孵育10MIN，期间漩涡震荡3次，每次5秒。0150煮沸5分钟，室温下静置15MIN冷却。0151转移到250L的比色皿中，加入25LGENMED酶促液，充分混匀。0152放进分光光度仪中，置零。0153取出比色皿，加入20LGENMED底色液，充分混匀。0154即刻放进分光光度仪中检测，此为样品非特异活性读数0分钟读数5分钟读数。01554计算样品活性0156样品总活性和非特异性活性0157样品读数背景读数025样品稀释倍数/00162210样品蛋白浓度0158样品特异活性0159样品特异活性样品总活性。
37、样品非特异性活性0160缓呆肽磷脂酰基转移活性的测定0161用酶标仪测定标准品在570NM波长处的吸光度，根据蛋白标准的浓度与吸光度之间的关系，绘制的标准曲线。0162用GENMED细胞缓呆肽D2磷脂转移活性比色法定量检测试剂盒检测缓呆肽的磷脂酰基转移活性，其具体原理底物磷脂对硝基苯酚在乳状液系统里，由于突触核蛋白敏感性磷脂酶D2的催化作用，转移磷脂基团到乙醇羟基上，产生磷脂醇，释放出显色产物对硝基苯说明书CN104087564A119/15页12酚，用酶标仪观察其峰值的变化405NM波长，来定量分析突触核蛋白敏感性磷脂酶D2的磷脂酰基转移活性。其反应系统见下0163PLD20164PHOSP。
38、HATIDYLPNITROPHENOLETHANOLPHOSPHATIDYLALCOHOLPNITROPHENOL0165具体操作步骤见下01661背景对照测定0167移取350LGENMED反应液到新的15ML的离心管。0168放进37恒温培养箱或恒温水槽孵育5分钟。0169加入50LGENMED阴性液，放进37恒温培养箱或恒温水槽孵育10分钟。0170加入100LGENMED终止液，混匀。0171加入100LGENMED中和液，混匀。0172加入400LGENMED萃取液，漩涡震荡5秒。0173放进4台式离心机，16000G离心10MIN。0174移取200L上层液相到新的EP管中。017。
39、5加入800LGENMED清理液，混匀。0176即刻吸取200L用酶标仪检测波长405NM处的吸光度，此为背景空白对照读数。01772样品总活性测定0178移取350LGENMED反应液到新的15ML的离心管。0179放进37恒温培养箱或恒温水槽孵育5分钟。0180加入50LPEGFP缓呆肽融合蛋白，放进37恒温培养箱或恒温水槽孵育10分钟。0181加入100LGENMED终止液，混匀。0182加入100LGENMED中和液，混匀。0183加入400LGENMED萃取液，漩涡震荡5秒。0184放进4台式离心机，16000G离心10MIN。0185移取200L上层液相到新的EP管中。0186加入。
40、800LGENMED清理液，混匀。0187即刻吸取200L用酶标仪检测波长405NM处的吸光度，此为样品活性读数。01883样品非特异活性测定0189检测开始前，移取50LPEGFP缓呆肽转染细胞株的总蛋白到15ML的离心管中，加入10LGENMED专性液，混匀，室温下孵育5分钟。0190移取350LGENMED反应液到新的15ML的离心管，放进37恒温培养箱或恒温水槽孵育5分钟。0191加入60L溶液到溶液中，放进37恒温培养箱或恒温水槽孵育10分钟。0192加入100LGENMED终止液，混匀。0193加入100LGENMED中和液，混匀。0194加入400LGENMED萃取液，漩涡震荡5。
41、秒。说明书CN104087564A1210/15页130195放进4台式离心机，16000G离心10分钟。0196移取200L上层液相到新的EP管中。0197加入800LGENMED清理液，混匀。0198即刻吸取200L用酶标仪检测波长405NM处的吸光度，。01993计算样品活性0200样品总活性和非特异性活性0201样品读数背景读数15样品稀释倍数/06001187510样品蛋白浓度0202样品特异活性0203样品特异活性样品总活性样品非特异性活性0204实施例4缓呆肽在制备磷脂酰丝氨酸中的应用0205将冷冻干燥的缓呆肽粉3MG用10MLPBS制成酶液。02061超滤30KD100KD超滤。
42、膜，氮气加压超滤后收集滤液。对超滤前后酶的活性测定。02072将缓呆肽03MG/ML蛋白，溶于10ML含有004G氧化铝的TRIS缓冲液PH65中。用磁力搅拌器在25剧烈搅拌30分钟，并向搅拌的酶溶液中滴加非离子型表面活性剂选择蔗糖酯；司盘；吐温。分两组，组一用一定条件声波处理10KHZ30KHZ频率10MIN，组二不做处理，然后在25搅拌8小时。得到的沉淀物通过离心12000RMP，4收集，然后在20冷冻过夜并进行冷冻干燥。避光密封冷藏。02083将25GL丝氨酸置于装有25ML的002MMOL/L醋酸钠缓冲液的反应器中，让丝氨酸完全溶解。02094将15G的大豆磷脂含70以上PC溶于50M。
43、L乙醚。将其与3混合，混合物置于28的温箱用磁力棒搅拌052小时。02105向反应介质中加入15MG酶制剂，反应混合物密闭置于28，200RMP搅拌412小时，然后停止搅拌直到酶制剂沉淀到反应器的底部。02116静置分层后，有机相再与L丝氨酸混合，并加入回收的酶制剂，重复步骤6，静置分层后，有机相用于提取PS。水相进行蒸发结晶后获得过量的丝氨酸，可用于回收利用。02127沉淀的酶制剂回收，过滤后直接加入用于二次提取。要对固定化酶的可用次数进行估计。用HPLC进行测定计算，对重回收利用后反应结果进行对比。02138PS的纯化。首先用醋酸缓冲液洗涤，静置分层除去过量的丝氨酸。用多层溶剂法除去其他磷。
44、脂成分加入碱性水溶液，搅拌、冻结、解冻，滤除沉淀，除去剩余的磷脂，然后将上清液调PH36，蒸除乙醚得粗磷脂酰丝氨酸。再将粗磷脂酰丝氨酸干粉溶于正己烷中，再加入醋酸钠乙醇溶液，搅拌、静置分层，除去含有肌醇磷脂的下层，上部正己烷减压蒸干得高纯度磷脂酰丝氨酸粉末最终获得的制剂密封避光20摄氏度冷藏保存。对纯化前，纯化后的PS过色谱柱分析纯度。0214实施例5PS的定性定量0215薄层层析法定性0216标准样品的准备分别称取1MG标准PC,PS,溶于1ML氯仿或乙醚溶液中，密封冷藏备用。薄层层析板的准备将03G羟甲基纤维素钠加入到60ML蒸馏水中，70水浴加热说明书CN104087564A1311/1。
45、5页14完全溶解后按31的比例加入20G硅胶粉，研磨均匀涂抹在玻璃板上，阴干，完全干燥后放入烘箱在110下活化30MIN，取出自然冷却到室温后，放入干燥箱备用。0217PS展开剂的选择0218氯仿甲醇丙酮水氨水73271024V/V0219点样用毛细吸管分别吸取适量的标准品溶液和待测样品，在薄层板上点样。点样完毕后放入装有展开剂的层析缸展开。0220显色方法待经过展开剂展开的薄层板表面的有机溶剂挥发干净后置于碘缸染色。0221需要试剂硅胶，羟甲基纤维素钠，氯仿，丙酮，醋酸钠，甲醇，乙醚，氨水，PC标准品，PS标准品0222PS定量0223经过薄层层析完全展开的硅胶板，将其上面含磷脂的斑点分别从。
46、薄层板上刮下来转移到大针筒中，每个样品加同等量的乙醚反复加压冲洗，冲洗后的液体装入预先经过经过精密称量的容器中。隔夜放置，待乙醚蒸发完毕后重新测量，根据前后差值计算各样品中的磷脂含量。0224实施例6缓呆肽对阿尔茨海默病AD动物模型的干预研究0225实验方法0226AD动物模型的干预0227腹腔注射2戊巴比妥钠40MG/KG麻醉大鼠后，将大鼠固定于立体定位仪上，常规备皮消毒，切开头部皮肤，参照大鼠立体定位图谱，定位双侧海马CA1区以前囟为原点，向后30MM，左右旁开20MM，颅骨表面下深度为35MM。然后钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量进样器自脑表面定位点垂直进针，缓慢将4L含10GA140和008。
47、L缓呆肽纯化液低剂量组、04L缓呆肽纯化液中剂量组或08L缓呆肽2纯化液高剂量组的无菌生理盐水注入，注射时间10MIN，留针10MIN，使药物充分浸润局部组织，退针，缝合切口，常规饲养；隔日进行相同注射。并分别在末次注射后的第3、6、9天单独使用相应剂量的PS进行双侧海马注射干预。0228动物标本采集0229所有缓呆肽注射组及缓呆肽干预组大鼠均于最后一次水迷宫检测后当天进行标本采集。腹腔注射2戊巴比妥钠40MG/KG麻醉大鼠后行心脏采血，血标本常温静置2H，待血液凝固后3500RPM离心10MIN，取上清，80保存用于ELISA检测。每组取6只动物快速断头，冰上取脑，分开左右半脑，左半脑置于中。
48、性甲醛中固定48H，右半脑称重后加按10质量体积比加入4预冷的生理盐水充分研磨，3000RPM离心5MIN，取匀浆上清80保存用于ELISA检测。剩余大鼠行心脏灌注。大鼠深度麻醉后固定于解剖板上，剖开胸腹部，曝露心脏，左心尖进针，剪开右心耳，灌注200MLPBS至心脏、肺、肝等脏器褪白后灌注200ML4多聚甲醛至大鼠出现四肢僵直。断头取脑，分开左右半脑，左脑置于中性甲醛过夜后用于石蜡包埋。各组大鼠保留脾、淋巴结中性甲醛固定后用于石蜡包埋。0230MORRIS水迷宫检测0231各组大鼠在术后相应时间进行水迷宫定位导航试验检测，历时3天，分别从4个不同的标记点，将大鼠于象限边缘1/2弧度处头朝池壁。
49、放入水中，记录2MIN内寻找平台所需说明书CN104087564A1412/15页15时间逃避潜伏期。若大鼠入水后2MIN内未能找到平台，则将其置于平台上并停留15S，引导学习记忆，逃避潜伏期记录为2MIN。每次训练间隔60S以上。0232ELISA检测0233按照试剂盒说明进行操作，对缓呆肽干预组及缓呆肽注射组大鼠血清、脑匀浆中的IL17、IL4、TGF1、IL21以及IFN进行检测。0234实验结果显示02351缓呆肽脑内注射无明显毒性。0236缓呆肽毒性实验结果显示，大鼠在术后均未出现乏力、呕吐、食欲不振、燥乱、竖毛、呼吸困难、痉挛甚至死亡等中毒症状。时间梯度实验结果显示缓呆肽注射后各天数大鼠海马均未见出现锥体束断层现象，各天数大鼠海马细胞排列紧密有序，细胞饱满，仅在0天及2天组大鼠脑组织出现轻微水肿，间隙略增宽，并可见较多量的活化。