一种耐辐射青霉及在吸附放射性锶90生物处理中的应用.pdf

本发明公开一种耐辐射青霉及在吸附放射性锶90生物处理中的应用。通过取样，筛选、分离、筛选、生理生化鉴定获得青霉（Penicilliumsp.）F161CGMCCNo.8381，利用该菌在吸附放射性生物处理中的应用，对于Pb2+、Zn2+，Ni+，Co2+，Cr2+，Hg2+等六种重金属具耐受性，可达200mg/L；特别是在放射性核素锶90吸附中应用获得显著明显的技术效果，从而证明了该菌种在吸附锶生物处理中具有良好的应用前景。

1.  一种青霉（Penicillium sp.）F161，其特征在于，所述的青霉（Penicillium sp.Aspergillus sp.）F161 菌种保藏编号为CGMCC NO.8381。

2.  如权利要求1所述的青霉（Penicillium sp.）F161在放射性核素吸附中应用。

3.  一种利用耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381在吸附锶90生物处理中的应用。

4.  一种利用耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381在对Pb²⁺、Zn ²⁺，Ni⁺， Co²⁺ ，Cr²⁺，Hg²⁺六种重金属耐受性中应用。

一种耐辐射青霉及在吸附放射性锶90生物处理中的应用
技术领域
本发明涉及一种微生物菌种及其应用于生物吸附放射性核素技术领域，具体的，本发明涉及一种耐辐射青霉及其在放射性核素吸附中应用的技术领域。
背景技术
锶90（⁹⁰Sr）是锶元素的一种具放射性的同位素，是铀的裂变产物之一，半衰期为28.8年。 一般来自核爆炸或核燃料产物。锶-90可做β射线的放射源，对人体有相当大的危害，它在核试验中由铀产生，以粉尘的形态被人体吸入，对人体产生放射性伤害。
放射性污染是造成人类癌症、生殖病变、遗传障碍、老年痴呆、健忘症的重要原因，高剂量辐射（>6.5Gy）直接导致人死亡；低剂量照射（<1.5Gy）可造成遗传物质的损伤、破坏造血干细胞系统和免疫系统等，引起基因突变和染色体畸变，诱发癌症。同时，遗传物质的变异可遗传到下一代,导致新生儿畸形或严重的先天性疾病。放射性污染已经成为急迫解决的重大问题。在治理放射性环境污染方面，传统方法是工程法、化学法。工程法是物理性地收集和隔离放射性物质的方法，化学法是采用特殊的化学品来固定和清除放射性污染。上述方法虽然已得到成功的应用，如日本的广岛和长崎两个城市、马绍尔群岛共和国的比基尼环礁核试验场和澳大利亚的马拉林加核试验场的修复与重建，但其成本很高，难以用于大面积辐射区的修复，因此，工程与化学的方法局限性很大。生物修复是利用特殊的生物富集和固定放射性污染物的方法，主要是微生物和植物，特别是微生物功能利用最受关注,因其成本低，适合于大面积修复，因而生物修复放射性污染成为当前研究的热点。
研究表明：微生物不仅可通过溶解和沉淀、生物吸附和吸收、氧化还原等作用来治理环境中的放射性核素污染,并且可以通过改变植物根际微环境 ,从而提高植物对重金属离子和放射性核素的吸收、挥发或固定的效率。相关的研究也取得了积极进展，如Jana Sitte 等研究证明放射性核素铀（U）在土壤中的迁移率受环境中微生物及环境因子的影响，Eva-Maria Burkhardt 研究表明Fe(III)还原菌的增生有利于包括U在内的重金属离子由土壤向地下水迁移。Copplestone等分离获得可大量积累¹³⁷Cs、^238+239+240Pu等放射性核素的微生物菌株，Hu等的研究表明许多微生物都能吸附U，如Pseudomonas aeruginosa CSU、Aspergillus fumigatus 和Saccharomyces cerevisiae。Entry等研究发现施用AM菌根菌可促进行植物对¹³⁷Cs、⁹⁰Sr的积累，Oneidensis希瓦氏菌MR-1，可以有效将可溶性U⁶⁺、Cr⁶⁺和Tc⁷⁺还原为不溶性U⁵⁺、Cr³⁺和Tc⁴⁺。
利用微生物修复放射性的污染环境必须考虑到以下两个方面:第一，必须是强耐辐射的微生物;第二，微生物修复环境时不能威胁到公共安全，也不能产生二次污染。由于大多数的细菌对放射性比较敏感，因此它们修复放射性污染环境的能力会受到较大的限制。因此，需要从自然环境中去分离具有辐射抗性的微生物，或者通过基因工程技术来改造一些微生物使之获得辐射抗性。目前尚无耐辐射真菌吸附放射性核素的报导。
发明内容
针对目前国内外尚报道有关耐辐射菌种及其在放射性核素锶吸附中应用的相关报道，特别是没有耐辐射青霉在吸附锶90生物处理中的应用相关报道。本发明目的旨在于提供一种利用耐辐射菌在放射性核素锶90吸附中应用，特别是本发明提供一种利用耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO. 8381在吸附锶90生物处理中的应用。
本发明采用的主要技术方案：
本发明从新疆某地辐射污染环境中取样，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为F161的菌株，经过微生物菌种的生理生化特性、菌落形态、菌种的分子水平等系列试验验证确定，该菌种是一种耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161，经菌种指定保藏机构，获得保藏号为CGMCC NO.8381，利用该菌种在放射性锶生物处理中应用，通过试验证明该菌种耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381对于Pb²⁺、Zn ²⁺，Ni⁺， Co²⁺ ，Cr²⁺，Hg²⁺等六种重金属具耐受性，其中对Pb²⁺、Zn ²⁺，Ni⁺的耐受浓度最大，分别可达1000 mg/L和500 mg/L，500 mg/L；对Co²⁺ Cr²⁺，Hg²⁺的耐受性次之，都可达200 mg/L；特别是在放射性核素锶90吸附中应用获得显著明显的技术效果，从而证明了该菌种在吸附锶生物处理中具有良好的的应用前景。
本发明具体提供一种利用耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381。本发明所使用的耐辐射青霉（Penicillium sp.）由新疆农业科学院微生物应用研究所从新疆某地辐射污染环境中取样分离，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好可耐受10000 KGy的微生物菌株，从中优选出一株编号为F161的菌株保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101,保藏日期为2013年10月22日，菌种保藏号为CGMCC NO.8381，该菌株培养温度28-30℃，最适培养温度28℃左右；该菌种生长于PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然，经28℃、48h培养，通过插片和水压片的镜检观察，该菌株初生菌落白色，绒毛状，向外扩展快，菌丝无色分隔，后期孢子堆紫粉绿色，呈绒粉状。分生孢子梗从气丝上垂直生出，无厚壁足细胞。分生孢子梗有隔不分枝，光滑，在略膨大的顶端对称排列着单居瓶状小梗，小梗上着生呈链状分生孢子，孢子椭圆形，表面光滑带有土黄的杂绿色。根据以上形态特征，初步鉴定该菌株为半知菌纲丛梗孢目丛梗孢科单梗曲霉属的一个种。参照《真菌鉴定手册》，结合对F161菌株进行形态学，生理生化鉴定，鉴定为青霉（Penicillium sp.），命名为耐辐射青霉F161。
经Biolog实验 ，F161可利用以下碳源：熊果苷，糊精，赤藻糖醇，D-葡萄糖酸，a-D-葡萄糖-1-磷本盐，丙三醇，D-核糖，水杨苷，D-木糖， y-氨基丁酸， ?-羟基丁酸，奎尼酸，D-葡萄糖二酸，琥珀酸甲基酯，L-丙胺酸酰胺，L-丙胺酸，L-丙胺酰氨基乙酸，L-天冬酰胺  ，L-谷氨酸，甘氨酰-L-谷氨酸，鸟氨酸，L-苯基柄氨酸，脯氨酸，L-苏胺酸，2-氨基乙醇，腺苷-5’一磷酸盐。    本发明通过总DNA的提取、ITS1基因的PCR扩增和测序，根据测序结果，用Blast搜索软件从GenBank、EMBL等数据库中调出相似性较高的相关放线菌菌株的ITS1基因序列，用CLUSTAL X 进行多序列比对，并采用 Saitou和Nei 的邻接法（Neighbor Joining）用MEGA 5.0软件进行系统进化树的构建和同源性比较。经测定，耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381的ITS1基因序列为574bp。
通过上述结果及ITS1rRNA同源分析、系统发育分析结果，将纯化的菌株F161进行系统进化树的构建及多样性分析，菌种编号为F161与Eupenicillium javanicum isolate FREII57同源性最高，将菌种编号为F161菌株鉴定为青霉属的一个种（Penicillium sp.）。
将增殖培养的菌株耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381接种于PDA培养基中，180～200rpm、28℃、培养48h；发酵培养所获得的培养物经4000rpm离心收集菌体。通过50℃烘干的方法获得干菌体；将0.1g干菌体加入pH 5.0、浓度20mg/L的锶离子溶液中，适当搅拌，室温吸附30min，可以达到吸附溶液中锶的目的，最大吸附率达到84.5%。
同时，本发明具体提供一种利用耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381进行放射性锶生物处理中应用技术方案:本发明所用的菌株青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381对Pb²⁺、Zn ²⁺，Ni⁺， Co²⁺ ，Cr²⁺，Hg²⁺等六种重金属具耐受性，其中对Pb²⁺、Zn ²⁺，Ni⁺的耐受浓度最大，分别可达1000 mg/L和500 mg/L，500 mg/L；对Co²⁺ Cr²⁺，Hg²⁺的耐受性次之，都可达200 mg/L，特别是在放射性核素锶吸附中应用获得显著明显的技术效果，从而证明了该菌种在吸附锶生物处理中具有良好的的应用前景。
本发明进而提供耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381的分离和培养方法。
1. 分离培养基采用：PDA培养基为马铃薯200g，葡萄糖20g。
2. 分离和筛选条件：采取梯度稀释法，称取10g土壤样品于90mL无菌生理盐水中，30°C活化30min后进行梯度稀释，选取10^-2、10^-3、10^-4稀释液分别涂布于分离培养基淀粉PDA培养基平板，每个处理3个重复，置30°C培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。
经培养筛选确定的耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381在经28℃、48h培养，通过插片和水压片的镜检观察，该菌株初生菌落白色，绒毛状，向外扩展快，菌丝无色分隔，后期孢子堆紫粉绿色，呈绒粉状。分生孢子梗从气丝上垂直生出，无厚壁足细胞。分生孢子梗有隔不分枝，光滑，在略膨大的顶端对称排列着单居瓶状小梗，小梗上着生呈链状分生孢子，孢子椭圆形，表面光滑带有土黄的杂绿色。根据以上形态特征，初步鉴定该菌株为半知菌纲丛梗孢目丛梗孢科单梗曲霉属的一个种。参照《真菌鉴定手册》进行鉴定，结合对F161菌株进行形态学，生理生化鉴定，鉴定为青霉（Penicillium sp.），命名为耐辐射青霉F161青霉（Penicillium sp.）。
经Biolog  FF鉴定板试验证明F161可利用以下碳源：熊果苷，糊精，赤藻糖醇，D-葡萄糖酸，a-D-葡萄糖-1-磷本盐，丙三醇，D-核糖，水杨苷，D-木糖， y-氨基丁酸， ?-羟基丁酸，奎尼酸，D-葡萄糖二酸，琥珀酸甲基酯，L-丙胺酸酰胺，L-丙胺酸，L-丙胺酰氨基乙酸，L-天冬酰胺   ，L-谷氨酸，甘氨酰-L-谷氨酸，鸟氨酸，L-苯基柄氨酸，脯氨酸，L-苏胺酸，2-氨基乙醇，腺苷-5’一磷酸盐。
通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：
本发明提供的耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381及其在锶离子及放射性锶90吸附中的应用，CGMCC NO.8381对Pb²⁺、Zn ²⁺，Ni⁺， Co²⁺ ，Cr²⁺，Hg²⁺等六种重金属具耐受性，其中对Pb²⁺、Zn ²⁺，Ni⁺的耐受浓度最大，分别可达1000 mg/L和500 mg/L，500 mg/L；对Co²⁺ ，Cr²⁺，Hg²⁺的耐受性次之，都可达200 mg/L,通过本法可以利用菌体的生长吸附锶离子，和放射性锶，也可以直接使用干菌体吸附，最大吸附能力可达28.5mg/g干菌体。
附图说明
图1为耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381水压片图。
图2所示为耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381系统发育树状图。
图3为耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381在20mg/LSr²⁺压力下生长曲线及吸附特性图。
图4 所示为pH对耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381生长吸附锶离子的影响。
图5所示为不同金属离子对耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381吸附锶离子影响图。
图6所示为不同菌体量对耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381吸附锶离子的影响。
图7所示为吸附时间对青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381菌体吸附锶离子的影响图。
图8所示为青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381 对稳定锶离子和放射性锶的吸附率比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，当然，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明要求保护的范围。
本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备：
培养基选用：PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然。
主要仪器与试剂：MSSPX-250型生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，SW-CJ-1F B型单人双面净化工作台，E360K离心机，恒温摇床HWY-100。PCR仪 Eppendorf No:5345，电泳仪Bio-Rad Mode 200/2.0，凝胶成像仪United-Bio,GK-330C plus，PCR预混液(TaKaRa Biotechnology)，其余试剂均为分析纯。超声波破碎仪为美国Sonics，VC 130。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：耐辐射青霉（Penicillium sp.）F161 CGMCC NO.8381的分离、筛选
1. 分离：本发明所使用的耐辐射青霉（Penicillium sp.）由新疆农业科学院微生物应用研究所从新疆某地辐射污染环境中取样分离，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为F161的菌株。
分离步骤：依据梯度稀释法，称取10g土壤样品于90mL无菌生理盐水中，30°C活化30min后进行梯度稀释，选取10^-2、10^-3、10^-4稀释液分别涂布于PDA培养基的平板，每个处理3个重复，置30°C培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于新的分离培养基PDA培养基，直至无杂菌落。将纯化后的菌株一部分采用冻干物安瓿管、甘油管和液氮等方式保藏，一部分保存于4°C直接用于后续研究。
2. 培养条件：该菌株培养温度28-30℃，最适培养温度28℃左右；该菌种生长于PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然，经28℃、48h培养。
本发明所使用的耐辐射青霉（Penicillium sp.）由新疆农业科学院微生物应用研究所以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为F161的菌株保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101,保藏日期为2013年10月22日，菌种保藏号为CGMCC NO.8381，该菌株培养温度28-30℃，最适培养温度28℃左右；该菌种生长于PDA培养基表面为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水IL，pH自然，经28℃、48h培养，通过插片和水压片的镜检观察，该菌株初生菌落白色，绒毛状，向外扩展快，菌丝无色分隔，后期孢子堆紫粉绿色，呈绒粉状。分生孢子梗从气丝上垂直生出，无厚壁足细胞。分生孢子梗有隔不分枝，光滑，在略膨大的顶端对称排列着单居瓶状小梗，小梗上着生呈链状分生孢子，孢子椭圆形，表面光滑带有土黄的杂绿色，参见附图1。根据以上形态特征，初步鉴定该菌株为半知菌纲丛梗孢目丛梗孢科单梗曲霉属的一个种。参照《真菌鉴定手册》进行鉴定，结合对F161菌株进行形态学，生理生化鉴定，命名为耐辐射青霉（Penicillium sp.）。相关生理生化结果结果见表1。
           表1：温度、pH等因素对菌株F161生长的影响