曲霉菌基因检测芯片及其制作方法和使用方法.pdf

本发明公开了一种曲霉菌基因检测芯片及其制作方法和使用方法。本发明的曲霉菌基因检测芯片，是根据曲霉菌基因组DNA序列，设计使每个探针解链温度相近，相同序列尽量减少，通用探针选取同一菌属中各菌种相同的序列区，并确定条探针，在醛基修饰的载玻片表面点阵并固定。本发明的曲霉菌基因检测芯片可用于患者曲霉菌种的检测。本发明的曲霉菌基因检测芯片只需一次PCR扩增反应和杂交反应就可确定曲霉菌和隐球菌的种类，具有高的灵敏度和杂交特异性，使临床检测成为可能。

1.  一种曲霉菌基因检测芯片，其特征在于，在载玻片表面点阵并固定有下列18条探针：
A.terreus           5’-CGCATTTATTTGCAACTTGT-3’
A.niger             5’-CGACGTTTTCCAACCATTT-3’
A.fumigatus         5’-CCGACACCCAACTTTATTTT-3’
A.nidulans          5’-GGCGTCTCCAACCTTATCTT-3’
A.tamarii           5’-AACGCAAAACAACCATTCTT-3’
A.aculeatus         5’-CTCGACCCCCAATCTTCT-3’
A.carbonarius       5’-GACAACTCCAACCTTTTTTTC-3’
A.japonicus         5’-TCGACCCCCAATCTTCTC-3’
A.heteromorphus     5’-CGACCTCTCCAACCATTTTC-3’
A.nomius            5’-GAACGCAAAACAACCATTCT-3’
A.oryza             5’-CCGAACGCAAATCAATCTT-3’
A.parasiticus       5’-AACGCAAAACAACCATTCTT-3’
A.sydowii           5’-CAGCCGACGTCTCCAAC-3’
A.flavus            5’-CCGAACGCAAATCAATCTTT-3’
A.candidus          5’-AGCCGACCAACCCAACCAT-3’
A.clavatus          5’-CTGTCGACACCAACCCAATT-3’
A.ochraceus         5’-ACGCTGAAAAGCAACCAATC-3’
A.common            5’-TTTTT(c)T(c)C(t)C(a)AGGTTGACCTCGG-3’

2.  根据权利要求1所述的曲霉菌基因检测芯片，其特征在于，所说的载玻片为醛基修饰的载玻片。

3.  根据权利要求1所述的曲霉菌基因检测芯片的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)芯片上探针的设计
根据曲霉菌基因组DNA序列，设计使每个探针解链温度上下波动5℃，相同序列避免单一碱基连续重复7次以上，通用探针选取同一菌属中各菌种相同的序列区，并确定上述18条探针；
(2)芯片的制备
先在18条探针的寡核苷酸5’端加上一段15聚的Poly T，同时进行氨基修饰，用水将探针稀释，并与spotting solution等体积混合，使终浓度为10uM，采用常规的方法点阵于醛基修饰的载玻片表面，并固定，即制成了具有18条探针的曲霉菌基因检测芯片。

4.  权利要求1所述的曲霉菌基因检测芯片用于患者曲霉菌种的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)样品制备：
提取临床标本，采用常规的方法培养提取菌株DNA，沉淀溶于无菌水中；
(2)样品DNA的PCR扩增并标记：
取制备好的DNA样品5ul与20ul PCR扩增体系混合，通过以下热循环过程制备荧光标记的DNA样品目的片断：首先94℃，5mins，以94℃，30s，58℃，30s，72℃，1min循环30次，最后，72℃延伸5min；
(3)PCR扩增产物与曲霉菌基因检测芯片杂交：
取经PCR扩增并标记荧光的目的DNA片段4ul，与10ul杂交液混匀，98℃变性5min，然后滴于芯片表面的点阵区域，盖上盖玻片，置于42℃湿盒中杂交40min，然后于洗液(2×SSC，0.1％SDS)中荡洗5mins，凉干；
(4)结果获得：
用激光共聚焦扫描仪扫描上述第(3)步的杂交芯片，配合其配套软件分析，最终获得实验结果。

曲霉菌基因检测芯片及其制作方法和使用方法
技术领域
本发明与曲霉菌病病诊断有关，特别是一种曲霉菌基因检测芯片及其制作方法及利用该曲霉菌基因检测芯片用于患者曲霉菌种的检测方法。
技术背景
DNA芯片，即基因芯片，是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。它是微电子学、物理学、化学、材料科学与生命科学交叉结合的高科技。DNA芯片利用微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的特殊序列的生物样品有序地固化在硅衬底或玻璃上，利用DNA芯片技术可以快速地获取或处理大量的生命信息(包括基因的识别、基因突变检测、基因表达谱检测等)，其在基因表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域获得成功应用。
曲霉菌病(aspergillosis)是由曲霉菌属(aspergillus)的多种曲霉菌引起的传染病。常侵犯人体的皮肤、粘膜、内脏、神经系统、骨骼等，引起急性炎症和慢性肉芽肿等病理改变，严重者可发生曲霉菌败血症，甚至死亡。本病属机会性真菌感染，也可侵袭正常人组织，临床表现多种多样，大致可分为组织侵入型、变态反应型、播散型和局灶型四种。一些曲霉菌毒素可引起急性中毒或有致癌作用。
曲霉菌属在自然界广泛分布，致病性曲霉菌有10余种，包括烟曲霉菌(A.fumigams)和黄曲霉菌(A.glaucus)；黑曲霉(A.niger)、白曲霉菌(A.candidus)、棒曲霉菌(A.clavatus)、土曲霉菌(A.terreus)、构巢曲霉菌(A.nidulans)、赭曲霉菌(A.ochaceus)、聚多曲霉菌(A.sydowii)、A.tamarii、A.aculeatus、A.carbonarius、A.japonicus、A.heteromorphus、A.nomius、A.oryza和A.parasiticus等。其中以烟曲霉菌最为常见。每种曲霉菌都有自己的形态学特征。迄今已从各种曲霉菌中分离到100余种对人、畜代谢有影响的毒素，其中黄曲霉菌素等有致癌作用。
由于缺乏对曲霉菌属各种菌种相应特异性的抗体，传统的血清学检测技术不能用于曲霉菌的检测。而PCR法用于检测曲霉菌种类，需多对特异性的引物，操作过程繁琐，在临床上无实用性。传统的培养法耗时长(7天)。因此目前绝大多数医院均未开展临床真菌学检测工作，医生往往凭经验诊治，容易造成误诊，难以准确治疗。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是公开一种曲霉菌基因检测芯片，以克服现有技术存在的检测灵敏度不高和检测速度较慢的缺陷，以满足医疗领域的需要；
本发明需要解决技术问题之二是提供所述曲霉菌基因检测芯片的制作方法；
本发明再一个需要解决的技术问题是公开所述曲霉菌基因检测芯片的使用方法。
本发明的曲霉菌基因检测芯片，其特征是在醛基修饰的载玻片表面点阵并固定有下列18条探针：
A.terreus          5’-CGCATTTATTTGCAACTTGT-3’
A.niger            5’-CGACGTTTTCCAACCATTT-3’
A.fumigatus        5’-CCGACACCCAACTTTATTTT-3’
A.nidulans         5’-GGCGTCTCCAACCTTATCTT-3’
A.tamarii          5’-AACGCAAAACAACCATTCTT-3’
A.aculeatus        5’-CTCGACCCCCAATCTTCT-3’
A.carbonarius      5’-GACAACTCCAACCTTTTTTTC-3’
A.japonicus        5’-TCGACCCCCAATCTTCTC-3’
A.heteromorphus    5’-CGACCTCTCCAACCATTTTC-3’
A.nomius        5’-GAACGCAAAACAACCATTCT-3’
A.oryza         5’-CCGAACGCAAATCAATCTT-3’
A.parasiticus   5’-AACGCAAAACAACCATTCTT-3’
A.sydowii       5’-CAGCCGACGTCTCCAAC-3’
A.flavus        5’-CCGAACGCAAATCAATCTTT-3’
A.candidus      5’-AGCCGACCAACCCAACCAT-3’
A.clavatus      5’-CTGTCGACACCAACCCAATT-3’
A.ochraceus     5’-ACGCTGAAAAGCAACCAATC-3’
A.common        5’-TTTTT(c)T(c)C(t)C(a)AGGTTGACCTCGG-3’
本发明的曲霉菌基因检测芯片的制作方法，包括如下步骤：
(1)芯片上探针的设计
根据曲霉菌基因组DNA序列，设计使每个探针解链温度相近，解链温度上下波动5℃，以避免发夹，二聚体形成，相同序列尽量减少，相同序列避免单一碱基连续重复7次以上，通用探针选取同一菌属中各菌种相同的序列区，并确定上述18条探针；
(2)芯片的制备
探针合成，为了减少杂交时的空间位阻，合成时，在18条探针的寡核苷酸5’端加上一段15聚的Poly T，即连接臂，同时进行氨基修饰。用去离子水将探针稀释，并与spotting solution等体积混合，使终浓度为？～10uM，采用常规的方法点阵于醛基修饰的载玻片表面，并固定，如可通过Cartesian microarray制作系统点阵于醛基修饰的载玻片表面，置于75％的相对湿度、室温条件下48-72小时进行固定。取出后于沸水中30秒，晾干，4℃保存，即制成了具有18条探针的曲霉菌基因检测芯片。
本发明的曲霉菌基因检测芯片用于患者曲霉菌种的检测方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)样品制备：
提取临床标本(咽拭子、中段尿、痰液、血液等)在沙氏培养基上培养7天，温度为30℃；然后分别刮取菌并稀释在100μl缓冲液(100mM Tris，30mM EDTA，0.5％SDS，pH 7.5)，采用传统的溶酶破壁(加入20ul溶细胞酶10U/ul，30℃水中30min，离心2min，沉淀加入25ul蛋白酶K 20ug/ul)、酚/氯仿抽提法提取菌株DNA，无水乙醇处理，最后将凉干的DNA沉淀溶于100ul无菌水中。
(2)样品DNA的PCR扩增并标记
取制备好的DNA样品5ul与20ul PCR扩增体系混合，(扩增体系包括2.5ul 10^*PCR反应缓冲液，2ul各2.5mM的dATP、dGTP、dCTP、dTTP，各15pmol的上游及下游引物，其中下游引物为5’端CY5荧光标记，1.25Upfu DNA聚合酶)通过以下热循环过程制备荧光标记的DNA样品目的片断：首先94℃，5mins，以94℃，30s，58℃，30s，72℃，1min循环30次，最后，72℃延伸5min。
(3)PCR扩增产物与曲霉菌基因检测芯片杂交
取经PCR扩增并标记荧光的目的DNA片段4ul，与10ul杂交液混匀，98℃变性5min，迅速插入冰浴，然后滴于芯片表面的点阵区域，盖上盖玻片，置于42℃湿盒中杂交40min，然后于洗液(2×SSC，0.1％SDS)中荡洗5mins，凉干。
(4)结果获得
用激光共聚焦扫描仪(GenePix 4000B)以合适的扫描强度扫描上述第(3)步的杂交芯片，配合其配套软件分析，最终获得实验结果。
本发明的优点与效果：
(1)本发明的曲霉菌基因检测芯片只需一次PCR扩增反应和杂交反应就可确定曲霉菌和隐球菌的种类，具有高的灵敏度和杂交特异性，使临床检测成为可能。
(2)本发明所采用的菌属通用探针，使检测分类更为具体和准确。
附图说明
图1是曲霉菌检测芯片的点样矩阵图
图2是样品为黄曲菌的芯片检测结果
图3是样品为烟曲菌的芯片检测结果
具体实施方式
                        实施例1
芯片的制备和探针设计
在醛基修饰的载玻片表面点阵并固定有下列18条探针：
A.terreus          5’-CGCATTTATTTGCAACTTGT-3’
A.niger            5’-CGACGTTTTCCAACCATTT-3’
A.fumigatus        5’-CCGACACCCAACTTTATTTT-3’
A.nidulans         5’-GGCGTCTCCAACCTTATCTT-3’
A.tamarii          5’-AACGCAAAACAACCATTCTT-3’
A.aculeatus        5’-CTCGACCCCCAATCTTCT-3’
A.carbonarius      5’-GACAACTCCAACCTTTTTTTC-3’
A.japonicus        5’-TCGACCCCCAATCTTCTC-3’
A.heteromorphus    5’-CGACCTCTCCAACCATTTTC-3’
A.nomius           5’-GAACGCAAAACAACCATTCT-3’
A.oryza            5’-CCGAACGCAAATCAATCTT-3’
A.parasiticus      5’-AACGCAAAACAACCATTCTT-3’
A.sydowii          5’-CAGCCGACGTCTCCAAC-3’
A.flavus           5’-CCGAACGCAAATCAATCTTT-3’
A.candidus         5’-AGCCGACCAACCCAACCAT-3’
A.clavatus         5’-CTGTCGACACCAACCCAATT-3’
A.ochraceus        5’-ACGCTGAAAAGCAACCAATC-3’
A.common           5’-TTTTT(c)T(c)C(t)C(a)AGGTTGACCTCGG-3’
(1)芯片上探针的设计：根据曲霉菌基因组DNA序列，设计使每个探针解链温度相近，避免发夹，二聚体形成，相同序列尽量减少，通用探针选取同一菌属中各菌种相同的序列区。
(2)芯片的制备：探针合成，为了减少杂交时的空间位阻，合成时，在18条探针的寡核苷酸5’端加上一段15聚的Poly T(连接臂)，同时进行氨基修饰。用去离子水将探针稀释，并与spotting solution等体积混合，使终浓度为10uM，通过Cartesian microarray制作系统点阵于醛基修饰的载玻片表面，置于75％的相对湿度、室温条件下48-72小时进行固定。取出后于沸水浴中30秒，晾干，4℃保存，即制成了具有18条探针的曲霉菌基因检测芯片。见图1。由图1可见，每一种探针重复点四个点，左一竖排为通用探针(A.common)，即对所有曲霉菌都有杂交信号的探针。右边每一横排四个一组的为一种曲霉菌特异探针。右边地文字相对应于点样矩阵探针名称。
                        实施例2
样品的处理和标记
对二例分别用探针杂交法(探针杂交法：用特异的PCR引物扩增以后，再与相对应的一条探针杂交，根据杂交结果作出判断)进行验证的样品(其中1例为烟曲菌A.fumigatus，另1例为黄曲菌A.flavus)，用常规办法处理样品，备用。
样品的PCR扩增和标记处理：取制备好的DNA样品5ul与20ul PCR扩增体系混合，(扩增体系包括2.5ul 10^*PCR反应缓冲液，2ul各2.5mM的dATP、dGTP、dCTP、dTTP，各15pmol的上游及下游引物，其中游引物为5’端CY5荧光标记，1.25U pfu DNA聚合酶)通过以下热循环过程制备荧光标记的DNA样品目的片断：首先94℃，5mins，以94℃，30s，58℃，30s，72℃，1min循环30次，最后，72℃延伸5min。
                         实施例3
PCR扩增产物与曲霉菌基因检测芯片杂交
取经PCR扩增并标记荧光的目的DNA片段4ul，与10ul杂交液混匀，98℃变性5min，迅速插入冰浴，然后滴于芯片表面的点阵区域，盖上盖玻片，置于42℃湿盒中杂交40min，然后于洗液(2×SSC，0.1％SDS)中荡洗5mins，凉干。用激光共聚焦扫描仪(GenePix 4000B)以合适的扫描强度扫描上述第(3)步的杂交芯片，配合其配套软件分析，最终获得实验结果。结果如图2、图3所示。
                         实施例4
样品的序列测定
取制备好的DNA样品20ul与80ul PCR扩增体系混合，(扩增体系包括10ul 10^*PCR反应缓冲液，8ul各2.5mM的dATP、dGTP、dCTP、dTTP，各50pmol的上游及下游引物，5U pfu DNA聚合酶)通过以下热循环过程制备DNA样品目的片段：首先94℃，5min，以94℃，30s，58℃，30s，72℃，1min循环30次，最后，72℃延伸5min。送与博亚(BioAsia)生物工程公司进行测序。
芯片检测结果与测序结果的符合率为100％。由此可见，用基因芯片来检测曲霉菌种类灵敏度高，特异性为100％。
用曲霉菌检测芯片，从样品制备到PCR扩增，得到检测结果，需6-8小时，大大缩短了病人的诊断时间，具有较好的临床推广使用价值。