说明书用于宫颈癌的检测和预后的方法和生物标志物
【技术领域】
本发明涉及检测生物学样品中的宫颈癌的方法和生物标志物，且尤其涉及与相关于宫颈癌的缺氧关联的标志物。
【背景技术】
功能肿瘤成像(如动态对比度增强的磁共振成像(DCE-MRI))可用于获得关于癌疾病的生物学信息，和由此评定肿瘤进攻性。已由此建议，这些成像技术(DCE-MRI)可为在临床中有用的工具，以向个性化的治疗的方式将患者分级到不同治疗方案。尤其是，由于放射治疗计划中成像的中心作用，用放射治疗法治疗的患者可显著受益于该方法(1)。未来放射治疗法改善的有力的策略可为将抗放射性分子生物标志物的发现与功能成像技术中的发展相关联(Coleman)。PET和MRI是现在用于检测转移及评定疾病传播的癌患者操作中必不可少的工具。但是，它们可视化肿瘤生物学和进攻性的能力未被利用，主要因为尚不清楚如何自像最佳提取预后参数，更不清楚它们的生物学含义。
几个研究最近展示了组合相同的肿瘤的成像数据和基因表达数据的潜力，以发现关于各种成像参数的背景的有价值的信息(15～21)。但是，像中仍有未探索的信息，其需要被阐明，以能在宫颈癌中有效使用DCE-MRI作为生物标志物。
【发明概述】
本发明涉及检测生物学样品中的宫颈癌的方法和生物标志物，且尤其涉及与缺氧关联的标志物。
在一些实施方式中，本发明提供预测受试者中的至宫颈癌的倾向， 诊断受试者中的宫颈癌，预测受试者中宫颈癌复发的似然性，提供患宫颈癌的受试者的预后，或就用特定治疗法治疗选择患宫颈癌的受试者的方法，包括：测定来自患者的组织或组织的分部的患者缺氧特征；及比较患者缺氧特征与参照缺氧特征，其中相对于参照特征的患者的改变的特征提供选自下列的指示：受试者至宫颈癌的倾向的指示，受试者患宫颈癌的指示，受试者中宫颈癌复发的似然性的指示，受试者存活的指示，及宫颈癌的进攻性的指示，宫颈癌治疗的可能结果的指示和受试者是用特定治疗法治疗的候选体的指示。
在一些实施方式中，患者缺氧特征通过使用磁共振成像(MRI)测量ABrix参数来测定。
在一些实施方式中，患者缺氧特征如下测定：(a)使来自受试者的生物学样品接触至少一种用于检测一种或更多缺氧特征基因产物的表达水平的缺氧特征信息指示剂；(b)检测一种或更多缺氧特征基因产物的表达水平使用体外测定，其中一种或更多基因的改变的表达水平提供选自下列的指示：受试者至宫颈癌的倾向的指示，受试者患宫颈癌的指示，受试者中宫颈癌复发的似然性的指示，受试者存活的指示，及宫颈癌的进攻性的指示，宫颈癌治疗的可能结果的指示和受试者是用特定治疗法治疗的候选体的指示。
在一些实施方式中，改变的表达水平通过与参照特征比较来测定。
在一些实施方式中，缺氧特征通过使用体外测定检测来自选自下列的至少一种基因的基因产物的表达水平来测定：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1，且其中将来自至少5种基因的基因产物的表达水平与至少一种基因的参照表达水平进行比较。在一些实施方式中，缺氧特征通过使用体外测定检测来自选自下列的至少5种基因的基因产物的表达水平来测定：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20， ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1，且其中将来自至少5种基因的基因产物的表达水平与至少5种基因的参照表达水平进行比较。在一些实施方式中，缺氧特征通过使用体外测定检测来自选自下列的至少10种基因的基因产物的表达水平来测定：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1，且其中将来自至少10种基因的基因产物的表达水平与至少10种基因的参照表达水平进行比较。在一些实施方式中，缺氧特征通过使用体外测定检测来自选自下列的至少15种基因的基因产物的表达水平来测定：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1，且其中将来自至少15种基因的基因产物的表达水平与至少15种基因的参照表达水平进行比较。在一些实施方式中，缺氧特征通过使用体外测定检测来自选自下列的至少20种基因的基因产物的表达水平来测定：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1，且其中将来自至少20种基因的基因产物的表达水平与至少20种基因的参照表达水平进行比较。在一些实施方式中，缺氧特征通过使用体外测定检测来自选自下列的至少25种基因的基因产物的表达水平来测定：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20， ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1，且其中将来自至少25种基因的基因产物的表达水平与至少25种基因的参照表达水平进行比较。在一些实施方式中，缺氧特征通过使用体外测定检测来自选自下列的至少30种基因的基因产物的表达水平来测定：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1，且其中将来自至少30种基因的基因产物的表达水平与至少30种基因的参照表达水平进行比较。在一些实施方式中，缺氧特征通过使用体外测定检测下列之表达水平来测定：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1，且其中将来自所述基因的基因产物的表达水平与至少30种基因的参照表达水平进行比较。
在一些实施方式中，基因产物是信使RNA。在一些实施方式中，基因产物是蛋白。在一些实施方式中，生物学样品是子宫颈肿瘤样品。在一些实施方式中，患者已被诊断患宫颈癌。在一些实施方式中，改变的基因产物的表达水平表示为肿瘤的缺氧分值。在一些实施方式中，缺氧分值通过对基因产物的中位数居中的基因表达水平取平均来测定。在一些实施方式中，正缺氧分值与差的预后相关。在一些实施方式中，正缺氧分值指示化学放射疗法抗性。
在一些实施方式中，受试者是淋巴结阴性的。在一些实施方式中，受试者中的正缺氧分值指示减小的无进展存活的概率。在一些实施方式中，正缺氧分值指示化学放射疗法抗性。
在一些实施方式中，方法还包括：(c)使用步骤(a)和(b)的结果产生风险特征。
在一些实施方式中，方法还包括测定受试者的预后，测定受试者的诊断，或就用特定治疗法治疗选择受试者。
在一些实施方式中，本发明提供一组适合于诊断或预测宫颈癌的检测试剂，其包含用于来自选自下列的至少1，2，3，5，10，15，20，25，30或31种基因的基因产物的特异性检测的试剂：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。在一些实施方式中，本发明提供所述组的检测试剂用于确定受试者中的宫颈癌的诊断或预后的用途。
在一些实施方式中，本发明提供检测哺乳动物中宫颈癌的存在的试剂盒，试剂盒包含对于检测和/或表征来自选自下列的至少1，2，3，5，10，15，20，25，30或31种基因的基因产物的水平或存在有用的，足够的或必需的试剂：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。
在一些实施方式中，本发明提供用于预测受试者中的至宫颈癌的倾向，诊断受试者中的宫颈癌，预测受试者中宫颈癌复发的似然性，提供患宫颈癌的受试者的预后，测定进攻性宫颈癌，或就用特定治疗法治疗选择患宫颈癌的受试者的缺氧特征信息指示剂，所述试剂包含一种或更多检测选自下列的一种或更多基因产物的试剂：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53， C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1，其中一种或更多基因的改变的表达水平提供选自下列的指示：受试者至宫颈癌的倾向的指示，受试者患宫颈癌的指示，受试者中宫颈癌复发的似然性的指示，受试者存活的指示，及宫颈癌的进攻性的指示，宫颈癌治疗的可能结果的指示和受试者是用特定治疗法治疗的候选体的指示。
在一些实施方式中，试剂包含一种或更多检测选自下列的5种或更多基因产物的试剂：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。在一些实施方式中，试剂包含一种或更多检测选自下列的10种或更多基因产物的试剂：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。在一些实施方式中，试剂包含一种或更多检测选自下列的20种或更多基因产物的试剂：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。在一些实施方式中，试剂包含一种或更多检测选自下列的25种或更多基因产物的试剂：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。在一些实施方式中，试剂包含一种或更多检测下列的试剂：ALDOA， AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。
在一些实施方式中，基因产物是信使RNA。在一些实施方式中，基因产物是蛋白。在一些实施方式中，试剂用于在体外测定中检测子宫颈肿瘤样品中的基因产物。在一些实施方式中，受试者已被诊断患宫颈癌。在一些实施方式中，受试者是淋巴结阴性的。在一些实施方式中，试剂用于产生缺氧分值。在一些实施方式中，缺氧分值通过对基因产物的中位数居中的基因表达水平取平均来测定。在一些实施方式中，正缺氧分值与差的预后相关。在一些实施方式中，正缺氧分值指示化学放射疗法抗性。在一些实施方式中，受试者中的正缺氧分值指示减小的无进展存活的概率。
另外的实施方式会基于本文含有的教导对于关联领域技术人员是显而易见的。
【附图说明】
图1A，B和C提供与在患宫颈癌的患者中ABrix参数的测量相关的数据。
图2A，B，C和D提供患宫颈癌的患者中基因表达的描绘(热图谱和图形)。
图3A，B和C提供患宫颈癌的患者中基因表达的描绘(热图谱和图形)。
图4提供箱线图(中位值,第1和第3四分位数)显示分别具有负(n＝65)和正(n＝74)缺氧分值的患者中HIF1α蛋白表达的分布。箱须延伸至不是离群值的最远点。自Mann-Whitney U检验的P-值。
图5提供在淋巴结阴性(左)和阳性(右)患者中，具有负(点线)及正(实线)缺氧分值的患者的无进展的存活的Kaplan-Meier曲线。自时间等级检验的P值和患者数显示在Kaplan-Meier图中。
图6提供在淋巴结阴性(左)和阳性(右)患者中，具有低(点线)及高(实线)HIF1α表达的患者的无进展的存活(右)的Kaplan-Meier曲线。自时间等级检验的P-值和患者数显示在Kaplan-Meier图中。
【定义】
为了辅助本发明的理解，许多术语和短语定义如下：
如本文所用，术语“灵敏度”定义为测定(例如,方法,测试)性能的统计学量度，通过真阳性数除以真阳性和假阴性的和来计算。
如本文所用，术语“特异性”定义为测定(例如,方法,测试)性能的统计学量度，通过真阴性数除以真阴性和假阳性之和来计算。
如本文所用，术语“信息指示的”或“信息指示”指称标志物或标志物组的质量，及特别指称在阳性样品中发现标志物(或标志物组)的似然性。
本文所用的术语“肿瘤”指称组织的任何新和异常生长。由此，肿瘤可为恶变前肿瘤或恶性肿瘤。术语“肿瘤-特异性标志物”指称可用于指示肿瘤存在的任何生物材料。生物材料的例包括，无限制地，核酸，多肽，碳水化合物，脂肪酸，细胞组分(例如,细胞膜和线粒体)，及全体细胞。
术语“子宫颈肿瘤-特异性标志物”指称可用于指示子宫颈肿瘤(例如,恶变前子宫颈肿瘤；恶性子宫颈肿瘤)的存在的任何生物材料。子宫颈肿瘤-特异性标志物的例包括，但不限于，ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。
如本文所用，术语“缺氧特征信息指示剂”指称对于鉴定与子宫颈肿瘤相关的缺氧特征的表达是信息指示的试剂。在一些实施方式中，试剂是检测以下基因的基因表达产物(例如,RNA转录物或蛋白)的 引物，探针或抗体：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。
如本文所用，术语“扩增子”指称通过使用引物对产生的核酸。扩增子一般是单链DNA(例如,不对称扩增的结果)，但是，其可为RNA或dsDNA。
在核酸的情景中，术语"扩增"或"扩增"指称多拷贝的多核苷酸，或部分多核苷酸，一般起始于少量的多核苷酸(例如,单多核苷酸分子)的产生，其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增包括各种化学和酶促过程。在聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR；见,例如,美国专利No.5,494,810；通过引用以其整体在本文合并)期间自一个或少拷贝的靶或模板DNA分子产生多DNA拷贝是扩增的形式。扩增的另外的类型包括，但不限于，等位基因-特异性PCR(见,例如,美国专利No.5,639,611；通过引用以其整体在本文合并)，组装PCR(见,例如,美国专利No.5,965,408；通过引用以其整体在本文合并)，解螺旋酶-依赖性扩增(见,例如,美国专利No.7,662,594；通过引用以其整体在本文合并)，热-起始PCR(见,例如,美国专利No.5,773,258和5,338,671；各通过引用以其整体在本文合并)，序列间-特异性PCR，倒转PCR(见,例如,Triglia等人(1988)Nucleic Acids Res.,16:8186；通过引用以其整体在本文合并)，连接-介导的PCR(见,例如,Guilfoyle,R等人,Nucleic Acids Research,25:1854-1858(1997)；美国专利No.5,508,169；各通过引用以其整体在本文合并)，甲基化-特异性PCR(见,例如,Herman等人，(1996)PNAS 93(13)9821-9826；通过引用以其整体在本文合并)，小引物PCR，多重连接-依赖性探针扩增(见,例如,Schouten等人，(2002)Nucleic Acids Research 30(12)：e57；通过引用以其整体在本文合并)，多重PCR(见,例如,Chamberlain等人，(1988)Nucleic Acids Research 16(23)11141-11156；Ballabio等人，(1990)Human Genetics84(6)571-573；Hayden等人，(2008)BMC Genetics 9:80；各通过引用以其整体在本文合并)，套式PCR，重叠-延伸PCR(见,例如,Higuchi等人，(1988)Nucleic Acids Research 16(15)7351-7367；通过引用以其整体在本文合并)，实时PCR(见,例如,Higuchi,etl al，(1992)Biotechnology 10:413-417；Higuchi等人，(1993)Biotechnology11:1026-1030；各通过引用以其整体在本文合并)，反转录PCR(见,例如,Bustin,S.A。(2000)J.Molecular Endocrinology25:169-193；通过引用以其整体在本文合并)，固相PCR，热不对称交错的PCR，及降落PCR(见,例如,Don等人,Nucleic Acids Research(1991)19(14)4008；Roux,K.(1994)Biotechniques 16(5)812-814；Hecker等人，(1996)Biotechniques 20(3)478-485；各通过引用以其整体在本文合并)。多核苷酸扩增也可通过使用数字PCR实现(见,例如,Kalinina等人,Nucleic Acids Research.25；1999-2004，(1997)；Vogelstein和Kinzler,Proc Natl Acad Sci USA.96；9236-41，(1999)；国际专利公开No.WO05023091A2；US专利申请公开No.20070202525；各通过引用以其整体在本文合并)。
如本文所用，术语"互补"或"互补性"参照由碱基-配对规则相关的多核苷酸(即,核苷酸序列)使用。例如，序列"5’-A-G-T-3',"互补于序列"3’-T-C-A-5'"。互补性可为"部分"，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，可有核酸之间"完全"或"总体"互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著效应。此在扩增反应，以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中具有特定重要性。
如本文所用，术语"引物"指称寡核苷酸，无论如在纯化的限制性消化中天然地发生或合成产生，其当放置在诱导互补于核酸链的引物延伸产物的合成的条件(例如,在核苷酸和诱导剂诸如生物催化剂(例如,DNA聚合酶等)的存在下及在适合的温度和pH)下时，能作为合成起始点发挥作用。为了在扩增中最大效率，引物一般是单链，但可 替代性地是双链。如果双链，引物通常首先在用于制备延伸产物之前，被处理以分离其链。在一些实施方式中，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物对于在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成而言足够长。引物的确切的长度会依赖于许多因素，包括温度，引物来源和方法使用。在特定实施方式中，引物是捕获引物。
如本文所用，术语"核酸分子"指称任何含有核酸的分子，包括但不限于，DNA或RNA。术语包括包含DNA和RNA的任何已知道的碱基类似物的序列，所述碱基类似物包括但不限于：4乙酰胞嘧啶，8-羟基-N6-甲基腺苷，氮丙啶基胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-(羧基羟基-甲基)尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶，5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，肌苷，N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤，1-甲基假-尿嘧啶，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2,2-二甲基-鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基-胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫代尿嘧啶，β-D-甘露糖基辫苷，5’-甲氧基羰基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧基乙酸，OXYBUTOXOSINE，假尿嘧啶，辫苷，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧基乙酸，假尿嘧啶，辫苷，2-硫代胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
如本文所用，术语“核碱基”与本领域使用的其他术语同义，包括“核苷酸”，“脱氧核苷酸”，“核苷酸残基”，“脱氧核苷酸残基”，“核苷酸三磷酸酯(NTP)”，或脱氧核苷酸三磷酸酯(dNTP)。
“寡核苷酸"指称包括至少2个核酸单体单元(例如,核苷酸)，一般多于3个单体单元，及更一般多于10个单体单元的核酸。寡核苷酸的确切的尺寸通常依赖于各种因素，包括最终功能或寡核苷酸的用途。为了进一步例证，寡核苷酸一般少于200个残基长(例如,15和100个之间)，但是，如本文所用，术语也旨在包括更长多核苷酸链。 寡核苷酸常常以它们的长度指称。例如24个残基寡核苷酸被称为"24聚体"。一般而言，核苷单体由磷酸二酯键或其类似物，包括硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯，苯胺基硫代磷酸酯，苯胺基磷酸酯，氨基磷酸酯，等(包括关联的对离子，例如，H+，NH4+，Na+，等(如果该对离子存在))连接。而且，寡核苷酸一般是单链。寡核苷酸任选地由任何适合的方法制备，包括但不限于既有的或天然的序列的分离，DNA复制或扩增，反转录，克隆及适当的序列的限制性消化，或由以下方法直接化学合成，所述方法诸如Narang等人(1979)Meth Enzymol.68:90-99的磷酸三酯方法；Brown等人(1979)Meth Enzymol.68:109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等人(1981)Tetrahedron Lett.22:1859-1862的二乙基氨基磷酸酯方法；Matteucci等人(1981)J Am Chem Soc.103:3185-3191的三酯方法；自动化的合成方法；或1984年7月3日授权的名称为"PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES"的，Caruthers等人的美国专利No.4,458,066的固体支持方法，或本领域技术人员知道的其他方法。将全部这些参考文献通过引用合并。
生物聚合体的"序列"指称生物聚合体中单体单元(例如,核苷酸等)的顺序和同一性。核酸的序列(例如,碱基序列)一般以5’至3’方向读取。
如本文所用，术语"受试者"指称任何动物(例如,哺乳动物)，包括但不限于人，非-人灵长类动物，啮齿动物，等，其是特定处理的受者。一般而言，在说到人受试者时，术语"受试者"和"患者"在本文互换使用。
如本文所用，术语"非-人动物"指称全部非-人动物包括，但不限于，脊椎动物，诸如啮齿动物，非-人灵长类动物，绵羊，牛，反刍动物，兔类动物，猪，山羊，马科动物，犬科动物，猫科动物，鸟类，等。
术语"基因"指称包含对于多肽，RNA(例如,包括但不限于,mRNA,tRNA和rRNA)或前体产生必需的编码序列的核酸(例如, DNA)序列。多肽，RNA或前体可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保留全长或片段的期望的活性或官能性质(例如,酶促活性,配体结合,信号转导,等)。术语也包括结构基因的编码区，和包括在5’和3’端的任一端位于相邻于编码区约1kb的距离的序列，使得基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5’侧及在mRNA上存在的序列被称为5’未翻译的序列。位于编码区的3’侧或下游及在mRNA上存在的序列被称为3’未翻译的序列。术语"基因"包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有用被称为"内含子"或"介入区"或"介入序列"的非-编码序列间断的编码区。内含子是转录为核RNA(hnRNA)的基因段；内含子可含有调控元件诸如增强子。内含子自核或初级转录物移去或"剪接去"；内含子因此在信使RNA(mRNA)处理的转录物中缺失。mRNA在翻译期间发挥功能，以确定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。
本文所用的术语“座位”指称染色体或连接图谱上的核酸序列及包括编码序列以及在基因调节中涉及的5’和3’序列。
【发明详述】
本发明涉及检测生物学样品中的宫颈癌的方法和生物标志物，且尤其涉及与缺氧关联的标志物。
局部进展的宫颈癌是作为初级治疗而用治疗性放射治疗法治疗(常常组合顺铂)的最大恶性疾病组之一。治疗是有挑战的，及常常与骨盆之内的关键器官的严重的并发症关联，由于确保局部区域控制需要高辐射剂量。MRI是宫颈癌操作中有价值的工具，由于其用于分期，治疗计划及应答监测，其中记录解剖和形态学特征(2～5)。通过整合这些具有功能的特征，利用功能MRI如DCE-MRI来改善疾病操作受到越来越多的关注。最近，已推荐，可通过鉴定与结果关联的MRI参数，使用DCE-MRI来达到疾病的功能信息。此技术可通过选择需求更攻击性的治疗的患者来用于改善诊断。通过给出关于该患者需求的另外的处理的信息，和可能通过指向特定分子靶，对于临床环 境中的新可能性，预后像的分子背景的知识会进一步打开。
DCE-MRI测量在一定时期期间肿瘤中造影剂的摄取，及摄取曲线依赖于毛细管的血灌注，血管供应及通透性。通常使用的造影剂Gd-DTPA(二甲基葡胺三胺五乙酸钆)是被灌注限制的，由此摄取曲线会通常反映细胞外，血管外空间的血灌注和体积。药代动力学建模用于定量描述这些生物学因素(13)。相比更通常使用的Tofts模型，由于不需要动脉输入功能，Brix模型(14)的使用是特别有吸引力的。
由此，本发明澄清宫颈癌患者中预后DCE-MR参数的分子背景，以鉴定它们反映进攻性的成为基础的原因，以便改善临床中DCE-MRI的可用性。本发明人首先实施与ABrix关联的基因的未监督的基因本体论(GO)分析，以发现在具有低水平的此参数的肿瘤中表现的生物学过程过。基于这些结果，确定缺氧和快速增殖在这些肿瘤中是重要的，并实施应用缺氧和增殖相关的基因组(与血管化和进攻性关联的其他基因组一起)的监督的基因组分析。为了优化此分析，从3种宫颈癌细胞系产生宫颈癌特异性缺氧基因组。此导致与DCE-MRI发现高度关联的缺氧标记的鉴定，及在宫颈癌患者的独立同群中具有预后影响。
在本发明的一些实施方式中，将患宫颈癌的患者的DCE-MRI和基因表达谱组合。实验结果展示在检测预后基因标记中此方法的有用性。已首次显示，在癌患者中，DCE-MRI参数ABrix在分子水平与缺氧相关，而同时提供用于干预的潜在新靶。这些发现展示，DCE-MRI可用于描绘缺氧，及对于治疗抗性肿瘤的非-侵袭性检测具有重要含义，由此是靶向缺氧的替代性的治疗的候选。
鉴定几种生物学过程的GO分析与ABrix显著地关联，但未指向一种特定表型。但是，未监督的基因组分析明显将缺氧鉴定为与患者中ABrix水平相关。尽管GO分析依赖于被标注到全部关联GO的基因，基因组分析允许基于关联研究或自自身研究的结果而利用与表型相关的基因组。对缺氧的应答是被差地标注的GO的一例，由此可不在GO分析中新出现，尽管其对于数据组分析是重要的。尽管我们的研究中 GO分析未将缺氧鉴定为重要，其指向缺氧相关的过程，诸如代谢和DNA损伤修复，由此支持基因组分析的结果。由Hagtvet等人(33)的研究发现了由哌莫硝唑测定的ABrix和缺氧级分之间的关联。此外，缺氧已知相关于宫颈癌中的抗放射性(34)，其证明此表型和预后ABrix参数之间的关系的发现。
本发明人首次显示，在宫颈癌患者中，ABrix的水平在分子水平与缺氧关联。在一些优选的实施方式中，本发明提供与以下基因中的一种或更多相关的缺氧基因特征：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。如在实施例中更详细显示，在全部3个宫颈癌细胞系中由缺氧被上调或下调的89个基因基因中的32个，包括DCE-MRI缺氧特征中的基因中的2个，未之前显示是缺氧-调控的。即使我们未确认这些基因关于缺氧，当研究子宫颈肿瘤中缺氧的重要性时，此发现指示对宫颈癌特异性缺氧应答特征的需求。
在DCE-MRI缺氧特征中的31个基因中，8个是已知道的HIF-1α靶基因，即ALDOA，ERO1L，GAPDH，PFKFB4，P4HA2，C4orf3，HMOX1和STC2。所述基因中的2个可能与HIF-1α间接偶联；PYGL已显示与VEGF强烈关联，其再次受HIF-1α调控(35)，及RHOC与Von Hippel-Lindau(VHL)相互作用(36)，其降解HIF-1α，而一种基因是HIF-2靶基因(SCARB1)(37)。此外，所述基因中的3个(AK2,DDIT3(也被称为CHOP)和STC2)已被发现涉及UPR(38～40)，而余下基因在缺氧中具有未知的功能。由此看着像是与HIF-1α，HIF-2关联的过程，及UPR可在由低ABrix描绘的缺氧表型中被活化。对于DCE-MRI缺氧特征中存活最重要的基因是STC2，DDIT3和C19orf53。尽管C19orf53的功能未知，STC2和DDIT3是关于缺氧感兴趣的基因。STC2已在几种癌类型中与差的预后相关(41～43)， 且已显示诱导增殖，抑制凋亡及在缺氧期间响应HIF-1α或ER应激而诱导侵袭性和上皮-间叶转变(EMT)(40,44,45)。另一方面，DDIT3是促-凋亡性蛋白，其功能是诱导G1-S阻拦。但是，最近已显示，DDIT3在缺氧期间通过调节自噬涉及肿瘤细胞的保护(46)，及由此建议，DDIT3可在影响自噬和凋亡之间的平衡中具有作用。DDIT3和STC2是活化转录因子4(ATF4)的靶，其响应缺氧应激而被真核生物翻译起始因子2-α激酶3(EIF2AK3/PERK)诱导。涵盖的是，具有低ABrix的肿瘤中这些基因的组合的作用是通过抑制凋亡及诱导自噬来辅助肿瘤细胞适应于缺氧。但是，阐明具有低Abrix的缺氧子宫颈肿瘤中这31种基因的作用需要进一步研究。
用于分析增殖，创伤应答和辐射应答的基因组不特异于宫颈癌。如果它们已特异性，关于这些基因组的分析结果会多少不同是可能的。与创伤治愈及增殖的p-值不是非常高的事实组合，我们无法要求这些表型不与ABrix相关。
使用DCE-MRI作为生物标志物是有利的，由于其在患者护理中已是常规步骤，不仅客观，还快和可重复。此外，使用非-侵袭性成像作为分子表型的替代品减少侵袭性活组织检查过程的需求，及其也可在治疗过程期间为应答评估应用/实施。由于我们鉴定了表现由DCE-MRI可视化的攻击性的缺氧表型的一列基因，结果在它们意味着在宫颈癌中可能的新分子靶方面具有治疗性重要性。在109名患者的独立数据组中确认结果，显示DCE-MRI预测的缺氧特征的稳健性和可用性。此外，我们显示，此特征可独立于既有的临床标志物而预测宫颈癌患者的存活。总之，结果展示，利用DCE-MRI的非-侵袭性成像可被用来可视化攻击性的缺氧肿瘤和由此鉴定需求另外的或替代性的治疗的宫颈癌患者。
因此，在一些实施方式中，本发明提供预测受试者中的至宫颈癌的倾向，诊断受试者中的宫颈癌，预测受试者中宫颈癌复发的似然性，提供患宫颈癌的受试者的预后，或就用特定治疗法治疗选择患宫颈癌的受试者的方法。在一些实施方式中，方法包括测定或构建来自患者 的组织或组织的分部的患者缺氧特征。在一些优选的实施方式中，将患者缺氧特征与参照缺氧特征进行比较。在一些实施方式中，相对于参照特征的患者的改变的特征提供选自下列的指示：受试者至宫颈癌的倾向的指示，受试者患宫颈癌的指示，受试者中宫颈癌复发的似然性的指示，受试者存活的指示，及宫颈癌的进攻性的指示，宫颈癌治疗的可能结果的指示和受试者是用特定治疗法治疗的候选体的指示。
本发明不限于产生缺氧特征的任何特定方法。在一些实施方式中，患者缺氧特征通过非-侵袭性方法诸如磁共振成像(MRI)，DCE-MRI或PET扫描来测定。在一些实施方式中，非-侵袭性过程利用ABrix参数的测量。在其他实施方式中，患者缺氧特征通过使来自患者的生物学样品与用于对生物学样品测定缺氧特征的试剂接触来测定。在一些实施方式中，方法还包括比较生物学样品的缺氧特征与参照特征，其中相对于参照特征的样品的改变的特征选自下列的指示：受试者至宫颈癌的倾向的指示，受试者患宫颈癌的指示，受试者中宫颈癌复发的似然性的指示，受试者存活的指示，及宫颈癌的进攻性的指示，宫颈癌治疗的可能结果的指示和受试者是用特定治疗法治疗的候选体的指示。在一些实施方式中，试剂特异于由以下基因中的一种或更多的表达产生的一种或更多基因产物(例如,RNA或蛋白)的检测：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。
尽管本发明例示几种特异于检测宫颈癌的标志物，与宫颈癌的存在或缺失相关的任何标志物可结合鉴定的标志物使用。标志物，如本文所用，包括，例如，产生或突变或产生缺乏是子宫颈肿瘤的特征的核酸。依赖于给定分析中采用的特定标志物组，统计学分析会改变。例如，当特定标志物组合高度特异于宫颈癌时，阳性结果的统计学意义会高。但是，其可为，该特异性在牺牲灵敏度的情况下达到(例如,阴性结果可甚至在宫颈癌存在下发生)。由相同的标志，不同组合可 非常敏感(例如,少假阴性,但具有更低特异性)。
可使用标志物的特定组合，其用不同人种群或性别，不同地理分布，不同疾病阶段，不同特异性程度或不同灵敏度程度显示最佳功能。也可开发特定组合，其特别敏感于治疗性方案对疾病进展的效应。受试者可在治疗和/或作用过程之后监测，以测定特定治疗和/或作用过程的有效性。
本发明的方法不限于子宫颈肿瘤的特定指示物。
如上所述，本发明的实施方式提供利用由以下基因中的一种或更多的表达得到的基因产物的检测的诊断及筛选方法：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。在以下描述例示，非限制性方法。
可根据本发明的实施方式的方法测试任何患者样品。由非限制性例的方式，样品可为组织样品(例如,子宫颈肿瘤活组织样品或骨盆淋巴结活组织)。
在一些实施方式中，使患者样品经历被设计为就基因产物或含有基因产物的细胞分离或富集样品的初步处理。本领域普通技术人员知道的各种技术可用于此目的，包括但不限于：离心；免疫捕获；细胞裂解；及，核酸靶捕获(见,例如,EP专利No.1409727,通过引用以其整体在本文合并)。
可使用标志物的特定组合，其用不同人种群或性别，不同地理分布，不同疾病阶段，不同特异性程度或不同灵敏度程度显示最佳功能。也可开发特定组合，其特别敏感于治疗性方案对疾病进展的效应。受试者可在治疗和/或作用过程之后监测，以测定特定治疗和/或作用过程的有效性。为包括在多重或组形式中，也涵盖其他癌，疾病，感染和代谢病情的标志物。
【I.DNA和RNA检测-缺氧特征信息指示的试剂】
本发明的基因产物通过使用本领域普通技术人员知道的各种核酸技术检测，包括但不限于：核酸测序；核酸杂交；及，核酸扩增。尤其是，基因产物用特异于以下基因中的一种或更多的基因产物的缺氧特征信息指示剂检测：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。由此缺氧特征信息指示剂可包含试剂，诸如通过测序，杂交，扩增，微阵列分析，及相关的方法检测基因产物的引物和探针。
【1.测序】
核酸测序技术的例证性非限制性例包括，但不限于，链终止子(Sanger)测序及染料终止子测序。本领域普通技术人员会认可，因为RNA在细胞中欠稳定，和更倾向于遭受核酸酶攻击，因此在实验上，RNA在测序之前通常被反转录成DNA。
链终止子测序利用使用修饰的核苷酸底物的DNA合成反应的序列-特异性终止。延伸通过使用短放射性，或其他标记的，在该区与模板互补的寡核苷酸引物，在模板DNA上的特定位点起始。寡核苷酸引物通过使用DNA聚合酶，标准4种脱氧核苷酸碱基，及低浓度的一种链终结核苷酸，最通常是二-脱氧核苷酸延伸。此反应在含轮流作为二-脱氧核苷酸的各碱基的4个分离的管中重复。由DNA聚合酶的链终结核苷酸的限制的并合产生仅在使用该特定二-脱氧核苷酸的位置终止的一系列相关的DNA片段。对各反应管，片段通过在板聚丙烯酰胺凝胶或填充粘聚合物的毛细管中电泳来尺寸-分离。序列通过随自凝胶顶部扫描到底部而读取哪个泳道自标记的引物产生可视化的标记来测定。
染料终止子测序替代性地标记终止子。完全测序可在单反应中，通过用在不同波长发萦光的分离的萦光染料标记各二-脱氧核苷酸链-终止子来实施。
为在本公开的方法中使用而涵盖各种核酸测序方法，包括，例如，链终止子(Sanger)测序，染料终止子测序，及高-通量测序方法。这些测序方法之许多为本领域所熟知。见，例如，Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467(1997)；Maxam et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:560-564(1977)；Drmanac,et al.,Nat.Biotechnol.16:54-58(1998)；Kato,Int.J.Clin.Exp.Med.2:193-202(2009)；Ronaghi et al.,Anal.Biochem.242:84-89(1996)；Margulies et al.,Nature 437:376-380(2005)；Ruparel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:5932-5937(2005),and Harris et al.,Science 320:106-109(2008)；Levene et al.,Science 299:682-686(2003)；Korlach et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:1176-1181(2008)；Branton et al.,Nat.Biotechnol.26(10):1146-53(2008)；Eid et al.,Science 323:133-138(2009)；各通过引用以其整体在本文合并。
许多DNA测序技术为本领域所知，包括基于萦光的测序方法(见,例如,Birre等人,Genome Analysis:Analyzing DNA,1,Cold Spring Harbor,N.Y.；通过引用以其整体在本文合并)。在一些实施方式中，利用本领域知道的自动化的测序技术。在一些实施方式中，利用分隔的扩增子的并行测序(Kevin McKerna等人的PCT公开WO2006084132，通过引用以其整体在本文合并)。在一些实施方式中，利用桥式扩增(见,例如,WO 2000/018957,美国7,972,820；7,790,418和Adess等人,Nucleic Acids Research(2000)：28(20)：E87；各通过引用在本文合并)。在一些实施方式中，利用由并行寡核苷酸延伸的DNA测序(见,例如,Macevic等人的美国专利No.5,750,341及Macevic等人的美国专利No.6,306,597，二者通过引用以其整体在本文合并)。测序技术的另外的例包括Church PCR集落技术(Mitr等人,2003,Analytical Biochemistry 320,55～65；Shendur等人,2005Science 309,1728-1732；美国专利No.6,432,360,美国专利No.6,485,944,美国专利No.6,511,803；通过引用以其整体在本文合并)，454微微滴定焦磷酸测序技术(Margulie等人,2005Nature 437,376～ 380；US 20050130173；通过引用以其整体在本文合并)，Solexa单碱基添加技术(Bennet等人,2005,Pharmacogenomics,6,373～382；美国专利No.6,787,308；美国专利No.6,833,246；通过引用以其整体在本文合并)，Lynx大规模并行标记测序技术(Brenne等人(2000).Nat.Biotechnol.18:630-634；美国专利No.5,695,934；美国专利No.5,714,330；通过引用以其整体在本文合并)，及Adessi PCR集落技术(Adess等人(2000).Nucleic Acid Res.28,E87；WO 00018957；通过引用以其整体在本文合并)。
下一代测序(NGS)方法以相比老测序方法降低成本的目标，共享大规模并行，高-通量策略的常见的特征(见,例如,Voelkerdin等人,Clinical Chem.,55：641～658,2009；MacLea等人,Nature Rev.Microbiol.,7：287～296；各通过引用以其整体在本文合并)。NGS方法可广泛地分为一般使用模板扩增的那些和不使用模板扩增的那些。需要扩增的方法包括由Roche作为454技术平台出售的焦磷酸测序(例如,GS 20和GS FLX)，由Illumina出售的Solexa平台，及平台由Applied Biosystems出售的支持的寡核苷酸连接和检测(SOLiD)。非-扩增方法，也被称为单-分子测序，以下列为例：由Helicos BioSciences出售的HeliScope平台，及分别由VisiGen，Oxford Nanopore Technologies Ltd.，Life Technologies/Ion Torrent，及Pacific Biosciences出售的新出现平台。
【2.杂交】
核酸杂交技术的例证性非限制性例包括，但不限于，原位杂交(ISH)，微阵列和DNA或RNA印迹。原位杂交(ISH)是使用标记的互补DNA或RNA链作为探针来定位一部分组织(原位)或(如果组织足够小)整个组织(全包埋ISH)中的特定DNA或RNA序列的一类杂交。DNA ISH可用于测定染色体结构。RNA ISH用于测量及定位组织切片或全包埋之中的mRNA和其他转录物(例如,基因产物)。通常处理样品细胞和组织，以将靶转录物固定到位，及增加探针的接近性。探针于提升的温度与靶序列杂交，然后将过量探针洗去。 将用放射性标记的，萦光标记的或抗原标记的碱基标记的探针分别使用放射自显影，萦光显微镜检或免疫组织化学，在组织中定位及定量。ISH也可使用2和或更多用放射性或其他非-放射性标记物标记的探针，以同时检测2种或更多转录物。
在一些实施方式中，基因产物检测通过使用萦光原位杂交(FISH)。在一些实施方式中，FISH测定利用细菌人工染色体(BAC)。这些已在人类基因组测序计划中广泛地使用(见Nature 409：953～958(2001))，和含有特定BAC的克隆可从发布者那里得到，其可通过许多源，例如，NCBI定位。已给来自人基因组的各BAC克隆明确地鉴定其的参考名称。这些名称可用于发现对应GenBank序列及自发布者定购克隆拷贝。特定流程为本领域所熟知和可容易适应于本发明。关于方法的引导可得自许多参考文献，包括：原位杂交：Medical Applications(eds.G.R.Coulton and J.de Belleroche)，Kluwer Academic Publishers，Boston(1992)；原位杂交：In Neurobiology；Advances in Methodology(eds.J.H.Eberwine,K.L.Valentino,and J.D.Barchas)，Oxford University Press Inc.，England(1994)；原位杂交：A Practical Approach(ed.D.G.Wilkinson)，Oxford University Press Inc.，England(1992))；Kuo等人，Am.J.Hum.Genet.49:112-119(1991)；Klinger等人，Am.J.Hum.Genet.51:55-65(1992)；及Ward等人，Am.J.Hum.Genet.52:854-865(1993))。也有可商购且提供用于实施FISH测定的流程的试剂盒(可获自例如,Oncor,Inc.,Gaithersburg,MD)。对方法提供引导的专利包括美国5,225,326；5,545,524；6,121,489和6,573,043。全部这些参照通过引用以它们的整体在此合并，和可根据本领域类似参考文献及在本文实施例部分提供的信息使用，以建立对特定实验室方便的程序步骤。
在一些实施方式中，本发明利用核酸酶保护测定。核酸酶保护测定对于甚至在低总浓度鉴定知道的序列的一种或更多RNA分子有用。提取的RNA首先与互补于目标序列的反义RNA或DNA探针混合，和杂交互补链而形成双-链化的RNA(或DNA-RNA杂交体)。然后 使混合物暴露于仅特异性切割单链RNA但针对双-链化的RNA无活性的核糖核酸酶。当反应运行完成时，灵敏的RNA区降解为非常短寡聚体或个体核苷酸；留存的RNA片段是互补于添加的反义链而由此含有的目标序列的那些。适合的核酸酶保护测定，包括，但不限于描述于US 5,770,370；EP 2290101A3；US 20080076121；US20110104693的那些；各通过引用以其整体并入本文。在一些实施方式中，本发明利用由HTG Molecular Diagnostics,Inc.提供的定量核酸酶保护测定(Tuscon,AZ)。
【3.微阵列】
不同种生物学测定被称为微阵列，包括，但不限于：DNA微阵列(例如,cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列)；蛋白微阵列；组织微阵列；转染或细胞微阵列；化合物微阵列；及，抗体微阵列。DNA微阵列，通常被称为基因芯片，DNA芯片，或生物芯片，是形成用于表达谱或同时监测数千基因的表达水平的阵列的附接于固体表面(例如,玻璃,塑料或硅芯片)的一批显微DNA斑点。附着的DNA段被称为探针，可在单DNA微阵列中使用数千种探针。微阵列可通过比较疾病和正常细胞中的基因表达来用于鉴定疾病基因或转录物(例如,基因产物)。微阵列可通过使用各种技术制造，包括但不限制：在玻璃载玻片上用精细-指针打印；使用预制的掩罩光刻；使用动态微镜装置光刻；喷墨打印；或，在微电极阵列上电化学。
DNA和RNA印迹分别用于检测特定DNA或RNA序列。将自样品提取的DNA或RNA片段化，在基质凝胶上电泳分离，及转移到膜滤器。使滤器结合的DNA或RNA经历与互补于目标序列的标记的探针杂交。检测结合到滤器的杂交的探针。该过程的变型是逆转RNA印迹，其中附于膜的基体核酸是一批分离的DNA片段，和探针是自组织提取的RNA及标记。
在一些实施方式中，本发明利用数字分子标条码技术，优选结合检测基因表达产物的nCounter分析系统(纳米串Technologies,Seattle,WA)。此技术利用基于基因表达的直接多重化的测量及提供高水平 的精确度和灵敏度(>1拷贝/细胞)的数字颜色-编码的条码技术。技术使用分子"条码"和单分子成像来检测及计数单反应中数百种独特转录物。将各颜色-编码的条码附接于对应于目标基因的单靶-特异性探针。与对照混合在一起，它们形成多重化的CodeSet。各颜色-编码的条码表示单靶分子。条码直接与靶分子杂交和可个别计数。在优选的实施方式中，杂交步骤每在溶液中杂交的mRNA采用2～50个碱基探针(捕获及报告子探针)。报告子探针携带条码信号；捕获探针允许复合物固定而用于数据收集。在杂交之后，去除过量探针及探针/靶复合物对齐及固定在nCounter盒中。将样品盒放入数据收集用数字分析仪。对盒表面上的色码计数及对各靶分子列表。见例如，美国专利公开20100015607，20100047924；及20100112710；各通过引用以其整体在本文合并。
【4.扩增】
核酸(例如,基因产物)可在检测之前或同时扩增。核酸扩增技术的例证性非限制性例包括，但不限于，聚合酶链反应(PCR)，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，转录-介导的扩增(TMA)，连接酶链反应(LCR)，链位移扩增(SDA)，及基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域普通技术人员会认可，特定扩增技术(例如,PCR)需要RNA在扩增之前逆转录成DNA(例如,RT-PCR)，然而其他扩增技术直接扩增RNA(例如,TMA和NASBA)。
聚合酶链反应(美国专利No.4,683,195,4,683,202,4,800,159和4,965,188,各通过引用以其整体在本文合并)，通常被称为PCR，使用变性，引物对与相反链退火，及引物延伸的多循环而指数地增加靶核酸序列的拷贝数。在被称为RT-PCR的变型中，反转录酶(RT)用于自mRNA制造互补DNA(cDNA)，及然后将cDNA由PCR扩增而产生多拷贝的DNA。对于PCR的其他各种置换见，例如，美国专利No.4,683,195，4,683,202和4,800,159；Mulli等人，Meth.Enzymol.155:335(1987)；及，Murakaw等人，DNA 7：287(1988)，各通过引用以其整体在本文合并。
转录介导的扩增(美国专利No.5,480,784和5,399,491,各通过引用以其整体在本文合并)，通常被称为TMA，在基本上恒定温度，离子强度和pH的条件下自催化地合成多拷贝的靶核酸序列，其中多RNA拷贝的靶序列自催化地产生另外的拷贝。见，例如，美国专利No.5,399,491和5,824,518，各通过引用以其整体在本文合并。在描述于美国公开No.20060046265(通过引用以其整体在本文合并)的变型中，TMA任选地合并使用阻断部分，终结部分和其他修饰部分来改善TMA过程灵敏度和精确度。
连接酶链反应(Weiss,R.,Science 254：1292(1991)，通过引用以其整体在本文合并)，通常被称为LCR，使用与靶核酸的相邻区杂交的2组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性，杂交和连接的重复的循环中由DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双-链化的连接的寡核苷酸产物。
链位移扩增(Walker,G等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396(1992)；美国专利No.5,270,184和5,455,166,各通过引用以其整体在本文合并)，通常被称为SDA，使用引物序列对与靶序列的相反链的退火，在dNTPαS的存在下引物延伸而产生双联体半硫代磷酸酯化的引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点的内切核酸酶-介导的切刻，及自切口的3’端聚合酶-介导的引物延伸而替换既有的链的循环，及产生用于下一轮引物退火，切口及链位移的链，导致产物的几何扩增。嗜热SDA(tSDA)在基本上相同的方法中，在更高温度使用嗜热内切核酸酶和聚合酶(EP专利No.0684315)。
其他扩增方法包括，例如：基于核酸序列的扩增(美国专利No.5,130,238,通过引用以其整体在本文合并)，通常被称为NASBA；使用RNA复制酶扩增探针分子本身的方法(Lizard等人,BioTechnol.6：1197(1988)，通过引用以其整体在本文合并)，通常被称为Qβ复制酶；基于转录的扩增方法(Kwo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173(1989))；及，自身-持续的序列复制(Guatell等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874(1990)，各通过引用以其整体在本文合并)。 对于已知道的扩增方法的进一步讨论，见Diagnostic Medical Microbiology:Principles and Applications(Persing et al.,Eds.),pp.51-87的Persing，David H，“In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques”(American Society for Microbiology,Washington,DC(1993))。
在一些实施方式中，本发明利用多重化的扩增和检测技术。见，例如，Won等人，Biotechniques(2005)39(1):1-11；及Bustin,J.Mol.Endocrinol.(2000)25：169～193；各通过引用以其整体在本文合并。适合的多重化的基于扩增的检测技术包括，但不限于，杂交探针4寡核苷酸方法，杂交探针3寡核苷酸方法，及利用水解探针(每靶分子2个引物及1个特异性探针)，分子信标(每靶分子2个引物及一个特异性探针)，蝎，日出引物(每靶分子2个PCR引物)，及LUX引物(每靶分子2个PCR引物)的方法。另一适合的多重化的，基于扩增的技术是来自PrimeraDX的ICEPlex/STAR技术系统(Mansfield,MA)。此技术利用用于扩增特异性靶分子的端-标记的PCR，之后由经毛细管电泳实时采样来检测。见例如，美国专利公开20100221725；20110300537；及20120100600；各通过引用以其整体在本文合并。
【5.检测方法】
非-扩增的或扩增的核酸可由任何常规手段检测。例如，基因产物可通过与可检测标记的探针杂交和测量得到的杂交体来检测。在以下描述检测方法的例证性非限制性例。
一种例证性检测方法，杂交保护测定(HPA)涉及化学发光寡核苷酸探针(例如,吖啶鎓酯-标记的(AE)探针)与靶序列的杂交，选择性地水解存在于未杂交的探针上的化学发光标记物，及测量自残留在光度计中的探针产生的化学发光。见，例如，美国专利No.5,283,174和Norman C.Nelso等人，Nonisotopic Probing,Blotting,and Sequencing,ch.17(Larry J.Kricka ed.,2d ed.1995,各通过引用以其整体在本文合并)。
另一例证性检测方法实时提供扩增过程的定量评估。“实时”扩增 过程的评估涉及在扩增反应期间，连续或周期性地测定在反应混合物中扩增子的量，及使用测定的值计算起初存在于样品中的靶序列的量。各种测定存在于样品中的初始靶序列量的方法基于的实时扩增为本领域所熟知。这些包括美国专利No.6,303,305和6,541,205中公开的方法，各通过引用以其整体在本文合并。测定起初存在于样品中的靶序列量，但不基于实时扩增的另一方法公开于美国专利No.5,710,029，通过引用以其整体在本文合并。
扩增产物可通过使用各种多数具有茎-环结构的自身-杂交探针实时检测。标记该自身-杂交探针，从而它们发射不同可检测的信号，依赖于是否通过与靶序列杂交而处于探针处于自身-杂交的状态或改变的状态。由非限制性例的方式，“分子火炬”是一类自身-杂交探针，其包括由接合区(例如,非-核苷酸接头)连接及在预定的杂交测定条件下彼此杂交的不同自身-互补性区(被称为“靶结合结构域”和“靶关闭结构域”)。在优选的实施方式中，分子火炬在靶结合结构域中含有1～约20个碱基长及为在链位移条件下与存在于扩增反应中的靶序列杂交可接近的单链碱基区。在链位移条件下，分子火炬的2个互补区(其可为完全或部分互补)的杂交是有利的，除非在靶序列的存在下，其会与存在于靶结合结构域的单链区结合，及替换全部或部分靶闭合结构域。分子火炬的靶结合结构域和靶闭合结构域包括可检测的标记物或一对相互作用标记物(例如,发光/猝灭剂)，其定位成相比当分子火炬与靶序列杂交，当分子火炬是自身-杂交的时产生不同信号，由此允许在未杂交的分子火炬的存在下检测测试样品中的探针:靶双联体。分子火炬及各种类型的相互作用标记物对公开于美国专利No.6,534,274，通过引用以其整体在本文合并。
检测具有自身-互补性的探针的另一例是“分子信标”。分子信标包括核酸分子，其具有靶互补序列，在存在于扩增反应中的靶序列的缺失下把持闭合的构象的探针的亲和性对(或核酸臂)，及当探针处于闭合的构象时相互作用的标记物对。靶序列和靶互补序列的杂交分离亲和性对的成员，由此探针转变为打开的构象。由于标记物对(其可 为，例如，萦光团和猝灭剂(例如,DABCYL和EDANS))的减少的相互作用，转变为打开的构象是可检测的。分子信标公开于美国专利No.5,925,517和6,150,097，通过引用以其整体在本文合并。
其他自身-杂交探针为本领域普通技术人员所熟知。由非限制性例的方式，具有相互作用标记物的探针结合对，诸如公开于美国专利No.5,928,862(通过引用以其整体在本文合并)的那些可适于在本发明中使用。也可在本发明中利用用来检测单核苷酸多态性(SNP)的探针系统。另外的检测系统包括“分子开关”，如公开于美国公开No.20050042638，通过引用以其整体在本文合并。其他探针，诸如包含嵌入染料和/或萦光色素的那些，也对于在本发明中检测扩增产物有用。见，例如，美国专利No.5,814,447(通过引用以其整体在本文合并)。
【II.蛋白检测-缺氧特征信息指示的试剂】
本发明的基因产物还可为蛋白，且通过使用本领域普通技术人员知道的各种蛋白检测技术检测，包括但不限于：测序，质量光谱法和免疫测定。尤其是，基因产物用特异于以下基因中的一种或更多的蛋白基因产物的缺氧特征信息指示剂检测：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。由此缺氧特征信息指示剂可包含试剂诸如抗体(例如,主要和第二抗体)和其他蛋白检测探针。
【1.测序】
蛋白测序技术的例证性非限制性例包括，但不限于，质量光谱法和Edman降解。
质量光谱法可，原理上，对任何尺寸蛋白测序，但随尺寸增加而计算变得更难。蛋白由内切蛋白酶消化，及得到的溶液经过高压液相层析柱。在此柱的末端，溶液喷射出负荷至高正电势的窄喷嘴而入质谱仪。滴上的电荷导致它们片段化，直到仅留下单离子。然后将肽片 段化，及测量片段的质量-电荷比。由计算机分析质谱和常常针对之前测序的蛋白的数据库进行比较，以便测定片段的序列。然后用不同消化酶重复该过程，及序列中的重叠用于构建蛋白序列。
在Edman降解反应中，待测序的肽吸附于固体表面(例如,用聚凝胺包被的玻璃纤维)。将Edman试剂，异硫氰酸苯酯(PTC)，与弱碱性的12％三甲基胺的缓冲溶液一起加入吸附的肽，及与N-端氨基酸的胺基反应。然后可通过添加无水酸选择性地分开末端氨基酸衍生物。衍生物异构化而产生取代的苯基硫代乙内酰脲，其可被洗涤出，及由层析鉴定，及可重复循环。各步骤的效率是约98％，其允许可靠地测定约50个氨基酸。
【2.免疫测定】
免疫测定的例证性非限制性例包括，但不限于：免疫沉淀；蛋白印迹；ELISA；免疫组织化学；免疫细胞化学；流式细胞术；及，免疫-PCR。通过使用本领域普通技术人员知道的各种技术(例如,比色,萦光,化学发光或放射性)可检测标记的多克隆或单克隆抗体适宜于在免疫测定中使用。
免疫沉淀是使用特异于抗原的抗体使抗原从溶液沉淀出的技术。过程可用于通过靶向被认为在复合物中的蛋白鉴定存在于细胞提取物中的蛋白复合物。复合物由起初自细菌分离的不溶性抗体-结合蛋白(诸如蛋白A和蛋白G)从溶液取出。抗体也可偶联于可容易从溶液分离出的琼脂糖珠。在洗涤之后，沉淀物可通过使用质量光谱法，蛋白印迹或鉴定复合物中的成分任意数的其他方法分析。
蛋白印迹，或免疫印迹是检测给定组织匀浆物或提取物样品中的蛋白的方法。其使用凝胶电泳由质量分离变性的蛋白。然后将蛋白转移出凝胶及转移到膜，一般聚二氟乙烯或硝酸纤维素，在那里它们通过使用特异于蛋白的目标抗体探查。结果，研究者可检查给定样品中蛋白的量及比较几组之间的水平。
ELISA，酶联免疫吸附测定的缩写，是检测样品中抗体或抗原的存在的生物化学技术。其利用最少2种抗体，其中之一特异于抗原和 另一种偶联于酶。第2抗体会导致发色或萦光源性底物而产生信号。ELISA的变型包括夹层ELISA，竞争性ELISA，及ELISPOT。因为可实施ELISA来评价样品中抗原的存在或抗体的存在，其是对于测定血清抗体浓度和也检测抗原存在而言有用的工具。
免疫组织化学和免疫细胞化学指称分别在组织切片或细胞中，经组织或细胞中的抗原结合它们的相应抗体的原理定位蛋白的过程。通过用产生颜色的或萦光标签标记抗体来实现可视化。颜色标签的典型例包括，但不限于，辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。萦光团标签的典型例包括，但不限于，异硫氰酸萦光素(FITC)或藻红蛋白(PE)。
流式细胞术是计数，检查及分选悬浮于流体流中的显微粒子的技术。其允许流过光学/电子检测设备的单细胞的物理和/或化学特征的同时多参数分析。单频度或颜色的光(例如,激光)束被导向水动力地聚焦的流体流上。许多检测器旨在流经过光束的点；一个与光束一致(前向散射或FSC)和几个与其垂直(侧向散射(SSC)及一个或更多萦光检测器)。经过束的各悬浮的粒子以一些方式散射光，及粒子中的萦光化学物质可以相比光源更低频度被激发为发射光。由检测器，及通过在各检测器每个就萦光发射峰分析亮度波动挑选散射的及萦光的组合，推导关于各个体粒子的物理和化学结构的各种事实是可能的。FSC与池体积关联和SSC与粒子的密度或内部复杂性关联(例如,核的形状,细胞质颗粒的量和类型或膜粗糙度)。
免疫-聚合酶链反应(IPCR)利用核酸扩增技术在基于抗体的免疫测定中增加信号产生。因为不存在PCR的蛋白等价型，即，蛋白不可以与在PCR期间核酸复制相同的方式复制，增加检测灵敏度的唯一方式是由信号扩增。靶蛋白结合到直接或间接缀合到寡核苷酸的抗体。将未结合的抗体洗去，及对余下结合的抗体扩增它们的寡核苷酸。蛋白检测经使用标准核酸检测方法(包括实时方法)检测扩增的寡核苷酸来实施。
在一些实施方式中，利用质量光谱法检测蛋白基因表达产物。优选的技术包括，但不限于，矩阵-辅助的激光解吸/电离飞行时间 (MALDI-TOF MS)和电喷射质量光谱法(ESMS)。见，例如，Man等人，Annu.Rev.Biochem(2001)70:437-73。
【III.数据分析】
在一些实施方式中，基于计算机的分析程序用于将通过检测测定产生的原始数据(例如,给定标志物的存在,缺失或量)翻译为临床医师的预测性值的数据。临床医师可使用任何适合的手段入手预测性数据。由此，在一些优选的实施方式中，本发明提供进一步益处，即不可能在遗传学或分子生物学上接受训练的临床医师无需明白原始数据。数据以其最有用的形式直接呈现给临床医师。然后临床医师能立即利用信息以便优化受试者的护理。
本发明涵盖任何能向进行测定的实验室及自进行测定的实验室接收，处理及传播信息的方法，信息提供，医疗个人，及受试者。例如，在本发明的一些实施方式中，样品(例如,活组织检查或血清或尿样品)从受试者得到，及交付于位于世界的任何部分(例如,在不同于受试者所在或最终使用信息的国家的国家)的表征服务(例如,在医疗设备的临床实验室,基因组表征业务,等)而产生原始数据。当样品包含组织或其他生物学样品时，受试者可访问医疗中心而具有获得的样品及发送给表征中心，或受试者可收集采样本身(例如,尿样品)和将其直接发送给表征中心。当样品包含之前测定的生物学信息时，信息可由受试者直接发送给表征服务(例如,可由计算机扫描含有信息的信息卡和数据使用电子通信系统传播给表征中心的计算机)。一旦由表征服务接收，将样品处理及产生特异于受试者期望的诊断或预后信息的特征(即,表达数据)。
特征数据然后以适合于由治疗临床医师解析的形式制备。例如，并非提供生表达数据，制备的形式可根据就特定治疗选项的建议表示受试者的诊断或风险评定(例如,假基因的存在或缺失)。数据可由任何适合的方法显示给临床医师。例如，在一些实施方式中，表征服务产生报道，其可打印给临床医师(例如,在护理点)或在计算机显示器上显示给临床医师。
在一些实施方式中，信息首先在护理点或在区域设备分析。原始数据然后发送给中心处理设备，用于进一步分析和/或将原始数据转变为对于临床医师或患者有用的信息。中心处理设备提供数据分析的私密性(全部数据用统一的安全协议存储于中心设备)，速度和统一性的优势。中心处理设备然后可控制受试者治疗后数据的命运。例如，使用电子通信系统，中心设备可给临床医师，受试者，或研究者提供数据。
在一些实施方式中，受试者能使用电子通信系统直接入手数据。受试者可选择基于结果进一步干预或咨询。在一些实施方式中，数据用于研究使用。例如，数据可用于进一步优化作为特定病情或疾病阶段的有用的指示物或作为测定治疗作用过程的伴侣诊断的标志物的包括或消除。
【IV.体内成像】
基因产物也可通过使用体内成像技术检测，包括但不限于：放射性核素成像；正电子发射层析成像(PET)；计算机化的轴层析成像，X-射线或磁共振成像方法，萦光检测和化学发光检测。在一些实施方式中，体内成像技术用于可视化动物(例如,人或非-人哺乳动物)中癌标志物的存在或表达。例如，在一些实施方式中，癌标志物mRNA或蛋白通过使用特异于癌标志物的标记的抗体标记。特异性地结合的及标记的抗体可在个体中使用体内成像方法检测，包括但不限于放射性核素成像，正电子发射层析成像，计算机化的轴层析成像，X-射线或磁共振成像方法，萦光检测和化学发光检测。在以下描述产生本发明的癌标志物的抗体的方法。
本发明的实施方式的体内成像方法在表达基因产物的癌(例如,宫颈癌)的鉴定中有用。体内成像用于可视化ncRNA的存在或表达水平。该技术允许无需使用令人厌恶的活组织检查而诊断。本发明的实施方式的体内成像方法可还用于检测身体的其他部分的转移性癌。
在一些实施方式中，将特异于癌标志物的本发明的试剂(例如,抗体)萦光标记。将标记的抗体导入受试者(例如,经口或肠胃外)。萦 光标记的抗体通过使用任何适合的方法(例如,使用描述于美国专利No.6,198,107的设备,通过引用在本文合并)检测。
在其他实施方式中，将抗体放射性标记。将抗体用于体内诊断为本领域所熟知。Sumerdon等人(Nucl.Med.Biol 17:247-254[1990])描述了用于使用铟-111作为标记物的肿瘤的放射免疫闪烁显象成像的优化的抗体-螯合剂。Griffi等人(J Clin Onc 9:631-640[1991])描述了在检测怀疑具有复发的结直肠癌的患者中的肿瘤中使用此剂。使用具有顺磁性离子的类似剂作为用于磁共振成像的标记物为本领域所知(Lauffer,Magnetic Resonance in Medicine 22:339-342[1991])。使用的标记物会依赖于选择的成像模式。放射性标记物(诸如铟-111，锝-99m或碘-131)可用于平面扫描或单光子发射计算的层析成像(SPECT)。正电子发射标记物诸如氟-19也可用于正电子发射层析成像(PET)。对于MRI，可使用顺磁性离子诸如钆(III)或锰(II)。
具有1小时～3.5天的半衰期的放射性金属可利用缀合于抗体的，诸如钪-47(3.5天)镓-67(2.8天)，镓-68(68分钟)，锝-99m(6小时)，及铟-111(3.2天)，其中镓-67，锝-99m和铟-111对于γ照相机成像是可优选的，镓-68对于正电子发射层析成像是可优选的。
用该射电金属标记抗体的有用的方法是利用双功能螯合剂，诸如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，如描述于，例如，Kha等人(Science209:295[1980])(对于In-111和Tc-99m)，及Scheinber等人(Science215:1511[1982])。也可使用其他螯合剂，但1-(p-羧基甲氧基苄基)EDTA和DTPA的羧基碳酸酐是有利的，因为它们的使用允许基本上不影响抗体的免疫反应性地缀合。
将DPTA偶联于蛋白的另一方法是通过使用DTPA的环状酐，如描述于Hnatowic等人(Int.J.Appl.Radiat.Isot.33:327[1982])(对于用In-111标记白蛋白)，但其可适于抗体的标记。不使用与DPTA鳌合的用Tc-99m标记抗体的适合的方法是Crockfor等人的PRETINNING方法(美国专利No.4,323,546,通过引用在本文合并)。
用Tc-99m标记免疫球蛋白的方法描述于Won等人(Int.J.Appl. Radiat.Isot.,29:251[1978])(对于血浆蛋白)，及最近由Won等人成功地应用(J.Nucl.Med.,23:229[1981])于标记抗体。
在缀合于特异性抗体的射电金属的情况中，同样期望不毁坏其免疫特异性而将尽可能高的一部分放射性标记物导入抗体分子。进一步改善可通过在ncRNA的存在下实现放射性标记来达到，以确保会保护抗体上的抗原结合位点。抗原在标记之后分离。
在仍进一步实施方式中，体内生物光子成像(Xenogen,Almeda,CA)用于体内成像。此实时体内成像利用萤光素酶。将萤光素酶基因合入细胞，微生物和动物(例如,作为与本发明的癌标志物的融合蛋白)。当有活性时，其导致发射光的反应。CCD照相机和软件用于捕获像及对其进行分析。
【V.组合物和试剂盒】
在本文所述的诊断方法中使用的组合物包括，但不限于，试剂盒，其包含一种或更多上述缺氧特征信息指示剂。在一些实施方式中，试剂盒包含一种或更多检测来自患有或怀疑患有患宫颈癌的受试者的样品中改变的基因表达的缺氧特征信息指示剂，其中试剂特异性检测来自以下基因的一种或更多基因产物：ALDOA，AK2，AK3L1，B3GNT4，SCARB1，CLK3，C20ORF20，ECE2，ERO1L，GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和TRAPPC1。
在一些实施方式中，除了检测试剂和缓冲剂之外，试剂盒含有特异于癌基因标志物的缺氧特征信息指示剂。在优选的实施方式中，缺氧特征信息指示剂是与一种或更多基因的相应基因产物特异性杂交的探针，扩增一种或更多基因的相应基因产物的引物组，与一种或更多基因的相应基因产物结合的抗原结合蛋白，或与一种或更多基因的相应基因产物杂交及允许一种或更多基因的相应基因产物的测序的测序引物。本发明的探针和抗体组合物也可以阵列形式提供。在优选的实施方式中，试剂盒含有全部对于实施检测测定必需的组分，包括全部 对照，实施测定的指导，及分析和呈现结果的任何必需软件。
在一些实施方式中，试剂盒包括使用用于来自受试者的样品中癌的检测和表征的试剂盒中含有的试剂的使用说明。在一些实施方式中，使用说明还包含在标记体外诊断产物中由美国Food and Drug Administration(FDA)需要的旨在用途的声明。FDA将体外诊断学分类为医疗装置及要求它们通过510(k)过程被批准。根据510(k)应用需要的信息包括：(1)体外诊断产物名称，包括商品或专利名称，常用或通常名称，及装置的分类名称；(2)旨在的产物用途；(3)如果可应用，交付510(k)交付的所有者或操作者的建立登记数；体外诊断产物所在FD&C Act的513节下的类，如果知道的，其适当的组，或，如果所有者或操作者确定装置未分类在该节下，体外诊断产物未如此分类的该确定的声明和确定的基础；(4)建议的标记物，足以描述体外诊断产物，其旨在的用途的标记及广告，及使用指导。当可应用时，应供给拍摄或工程图；(5)指示装置在美国的商业分布中类似于和/或不同于相当的类型的其他体外诊断产物的声明，伴随支持该声明的数据；(6)安全性和有效性数据的510(k)总结，实质性等价确定基于此；或支持FDA实质性等价发现的510(k)安全性和有效性信息会是任何人在书面请求30天之内可利用的声明；(7)交付者基于它们的知识相信，上市前通知中交付的全部数据和信息是真实和精确的及未忽略实质事实的声明；(8)对于FDA进行实质性相当确定必要的关于要求的体外诊断产物的任何附加信息。附加信息是在美国FDA的互联网网页可利用的。
【VI.使用方法】
如在本文公开，本发明提供测定受试者中的宫颈癌的预后，诊断受试者中的宫颈癌，预测受试者中的至宫颈癌的倾向，预测受试者中宫颈癌复发的似然性，评定受试者中宫颈癌的进攻性，或就用特定治疗法治疗选择患疾病受试者的缺氧信息指示剂和方法。在一些优选的实施方式中，本发明的实施方式提供给被诊断患宫颈癌的患者提供预后的组合物和方法。例如，在一些实施方式中，相对于对照样品(例 如,非-癌性子宫颈组织或参照子宫颈肿瘤样品)，一种或更多缺氧特征基因(例如,ALDOA,AK2,AK3L1,B3GNT4,SCARB1,CLK3,C20ORF20,ECE2,ERO1L,GAPDH，HMOX1，ISG15，PFKFB4，P4HA2，PYGL，RPL36A，UPK1A，DDIT3，KCTD11，PVR，RHOC，STC2，C14ORF2，C19ORF53，C4ORF3，FGF11，SH3GL3，SNTA1，SPAG7，S100A2和/或TRAPPC1)的改变的基因表达与差的预后相关。在一些实施方式中，改变的表达是一种或更多以上鉴定的缺氧特征基因的表达增加。在一些实施方式中，参照水平来自宫颈癌肿瘤。在一些实施方式中，参照水平是无癌子宫颈组织。在一些实施方式中，相比参照水平的表达水平指示差预后。在一些实施方式中，差预后是降低的存活机会。在一些实施方式中，差预后是增加的复发机会或宫颈癌转移。在一些实施方式中，预后是5年无复发存活的似然性。
在一些实施方式中，测定一种或更多缺氧特征基因的表达水平及用来产生缺氧分值。在一些实施方式中，缺氧分值通过对一种或更多缺氧特征基因(例如,1种或更多,5种或更多,10种或更多,20种或更种,25和或更多,或整个31种基因)的中位数居中的基因表达水平(优选转变为对数尺度)取平均来测定。正缺氧分值(即,缺氧特征基因的增加的表达)与差的预后相关。在一些实施方式中，正缺氧分值(或缺氧特征基因的增加的表达)指示化学放射疗法抗性。在一些实施方式中，样品的正缺氧分值(或缺氧特征基因的增加的表达)指示受试者减小的无进展存活的概率。
在一些实施方式中，本发明的测定和检测方法用于将患者分为亚组。在一些实施方式中，受试者是淋巴结阳性或淋巴结阴性。在淋巴结阴性患者中，正缺氧分值(即,缺氧特征基因的增加的表达)与差的预后相关。在一些实施方式中，淋巴结阴性受试者中的正缺氧分值(或缺氧特征基因的增加的表达)指示化学放射疗法抗性。在一些实施方式中，来自淋巴结阴性受试者的样品的正缺氧分值(或缺氧特征基因的增加的表达)指示受试者减小的无进展存活的概率。
在一些实施方式中，预后信息用于确定受试者的治疗作用过程。 例如，在一些实施方式中，被发现具有差预后的受试者可给予除了化学放射疗法之外的治疗。在进一步实施方式中，本发明的测定在宫颈癌的治疗剂临床期间测试利用。涵盖的是，上述基因产物的测定会限定用治疗剂治疗的特定患者群，其相比全体患者群更或欠有效。由此，在本发明的一些实施方式中，当受试者通过使用本发明的测定筛选，和就用特定治疗剂或治疗性方案治疗选择具有上述基因表达的特定特征的患者时，提供方法。
【VII.药物筛选应用】
在一些实施方式中，本发明提供药物筛选测定(例如,就抗癌药物筛选)。本发明的筛选方法利用上述基因产物。例如，在一些实施方式中，本发明提供就改变(例如,减小)基因产物的表达或活性的化合物筛选的方法。化合物或剂可通过，例如，与启动子区相互作用干扰转录。化合物或剂可干扰mRNA(例如,由RNA干涉,反义技术,等)。化合物或剂可干扰作为基因产物的生物学活性的上游或下游的通路。在一些实施方式中，候选体化合物是针对基因产物的反义或干扰RNA剂(例如,寡核苷酸)。在其他实施方式中，候选体化合物是与基因产物调节物或表达产物特异性结合的抗体或小分子，与基因产物调节物或表达产物特异性结合的抗体或小分子抑制其生物学功能。
【实施例】
提供下列实施例，以便展示及进一步例证本发明的特定优选的实施方式和方面，且不被解释为限制其范围。
【实施例1】
【材料和方法】
【患者和肿瘤样本】
包括在挪威Radium医院预期地募集到我们的化学放射疗法流程的总共190名患宫颈癌的患者(补充表1)，全部用与辅助的顺铂组合的外部辐射和近距离放射疗法治疗，并追踪，如之前描述(22)。自实施DCE-MRI的81名患者排除3名患者，因为药代动力学模型可 不成功地拟合肿瘤的对比摄取曲线，导致在当前研究中总共78名患者。在诊断时由磁共振成像或，在少数情况中，计算的层析成像检测骨盆中的病理学淋巴结。无论短轴等于或超过10mm的何时，将淋巴结根据实体瘤(RECIST)1.1版中的应答评估标准分类为病理学性的(23)。记录诊断和第1次复发事件或癌相关的死亡之间的时间。复发(进行性疾病)分类为局部区域性的(在照射的域内消退)，远处的或二者。13名患者由于不与癌相关的原因死亡及检查。
在治疗起始之前取肿瘤样本，在4％缓冲的福尔马林中固定，石蜡包埋及用于免疫组织化学。将各肿瘤的分离活组织速冻，于-80℃存储，及用于蛋白印迹和基因表达分析。研究由南挪威医疗研究伦理学区域委员会批准，及从全部患者得到书面知情同意。
补充表1
DCE-MRI，动态对比度增强的磁共振成像；
FIGO，Federation International de Gynecologie et d’Obstetrique
a自预处理磁共振像测定和基于3个正交直径(a,b,c)计算为(π/6)abc
基于无远处或局部区域复发的患者
【宫颈癌患者的DCE-MRI】
对78名患者，在1.5T Signa Horizon LX层析成像(GE Medical Systems,Milwaukee,Wisconsin)上实施MRI测量。在治疗之前，全部患者除了T2加权成像之外，还经历DCE-MRI。为描绘肿瘤，轴T2加权快速自旋回波成像系列包括在成像流程中。为了记录DCE-MRI系列，利用轴T1-加权的快速扰相梯度回波(FSPGR)序列，包括视场中的整个肿瘤体积。使用利用一0.1mmol/kg体重的剂量的Gd-DTPA(Schering,柏林,德国)的快推注。DCE-MRI的序列在5分钟时期期间包括14个成像系列，在推注之前和13个之后其中记录一个系列。时间分辨率在15s(早期时间点)和1min(晚期时间点)之间不同。
【成像分析/药代动力学分析】
对各肿瘤体素及时间点计算各患者的相对信号增加(RSI)：
(1)其中S(t)是在时间t的信号强度。将在t＝0获得的强化前像用作基线，从而RSI描述在示踪物注射之后相对浓度的时间依赖性。使用Levenberg-Marquardt最小二乘极小化(24)，将Brix模型(25)在各肿瘤体素中，使用以下关系拟合到RSI：
(2)其中ABrix是幅度，kep是示踪物自组织到血浆的转移速率，及kel是示踪物自血浆的清除速度。全部3个参数被允许在拟合中自由地改变，除了约束ABrix，kep，kel≥0.5之外。
【细胞系和缺氧处理】
将HeLa，SiHa和CaSki宫颈癌细胞系用作缺氧的体外模型。将细胞在含有10％胎牛血清(FCS)和青霉素链霉素的含GlutaMAX的Dulbecco氏改良的Eagle培养基中在5％CO2气氛下于37℃温育，及 一周两次继代培养。将50～80％汇合细胞在此培养基中，于37℃，在缺氧(0.2％O2,5％CO2)或常氧(95％空气,5％CO2)条件下维持24h。在Invivo2200室(Ruskinn Technology Ltd,Bridgend,UK)中，伴随精确的O2和CO2控制实施缺氧处理。用0.2％O2的24h处理条件选择来反映具有延长的缺氧的条件及确保由HIF-1α和可能由未改变的蛋白应答(UPR)的应答(26,27)。
实施流式细胞术，以研究是否缺氧处理导致细胞周期分布的变化或在细胞系中诱导凋亡。(补充图)。通过用10mM含有2％SDS，及Na3VO4的Tris HCl pH7.5裂解缓冲剂裂解细胞来实施蛋白印迹，由8％Tris-HEPES-SDS聚丙烯酰胺凝胶(Pierce Biotechnology,Rockford,IL)分离蛋白，还将它们在它们所在的PVDF膜上印迹，并用针对HIF-1α的抗体和第二抗体染色。使用LumiGLO化学发光底物系统(KPL,Gaithersburg,MD)进行检测。
【基因表达分析】
如所述，使用Illumina珠阵列人WG6v3(Illumina Inc.,San Diego,CA)，用48803个转录物实施描述122名患者以及3种细胞系的基因表达(28)。简言之，从冷冻的样本，通过使用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)(29)及从细胞系，使用RNeasy MiniKit(Quiagen)，根据生产商的使用说明分离总RNA。RNA样品的质量通过使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)确认。使用TotalPrep RNA扩增试剂盒(Ambion Inc.,Austin,TX)，使用500ng的总RNA作为输入物质来扩增RNA。过夜合成cRNA，标记及与阵列于58℃过夜杂交。将杂交的阵列用链霉亲和素-Cy3(PA43001,Amersham TM,Buckinghamshire,UK)染色，及用Illumina珠阵列读取器扫描。使用Bead Studio 3.1.3.0(Illumina Inc.)进行信号提取，质量控制和分位数标准化。
【微阵列数据的计算分析6】
将得到的数据组对数转化，和实施用GO分析软件EGON的未监督的分析(30)。而且，为监督的基因组分析，对包含缺氧，增殖， 创伤治愈及辐射抗性的11种选择的基因组合利用基因组合分析工具SAM-GS(对基因组合的微阵列的显著性分析)，基于SAM t-样统计学的方法(31)。
【统计学】
Spearman关联分析用于对于46名DCE-MRI患者发现与基于Illumina数据的A-参数关联的基因。Cox回归分析鉴定在验证组中在109名患者之中无进展存活的最重要的基因。通过使用时间等级检验比较Kaplan-Meier曲线。<0.05的P-值被认为是显著的。
【结果】
【预后DCE-MRI参数的鉴定】
之前显示，DCE-MRI参数ABrix是宫颈癌中的预后因素，其中低水平的ABrix的患者相比具有高水平的ABrix的那些显著地更差。对各参数的百分率实施存活分析，以显示参数的稳健性，及以展示哪个百分率是更预后性的。
为了探索ABrix的生物学背景，我们选择关于存活最显著(p＝0.004)的百分率区之一，即20～30百分率(图1b～c)。在这些百分率之中，ABrix在患者之中不同的，0.59～3.21。鉴定与ABrix关联的基因表达。发现，对应于3490个独特基因的3714Unigene探针与ABrix相关(p<0.05)(图2a)。由此，在肿瘤的转录程序中反映DCE-MR像中的差异。
【DCE-MRI关联基因的GO分析】
使表达相关于ABrix的基因经历未监督的GO分析，以发现在具有低值ABrix的肿瘤中过表现的生物学过程。一种或更多生物学过程标注到阵列中1657个关联基因及13650个全部基因。鉴定3种主要显著过程；代谢，细胞周期，及细胞组分组织和生物合成，其中代谢类别含有亚组，诸如“1-碳化合物代谢”，“生物聚合体代谢”，及“核碱基,核苷,核苷酸和核酸代谢过程”(表1)。此提示，ABrix反映代谢的去调节和可能增加细胞生长和增殖。
由于GO分析完全依赖于基因注释，我们想要实施未涉及注释的 分析，以进一步洞察与ABrix关联(负面地或正面地)的基因的生物学功能。由此，实施监督的基因组富集分析，比较具有分别中位值以上及以下的ABrix值的肿瘤的2组。分析包括来自反映表型缺氧，增殖，创伤治愈，及抗放射性的文献，基于来自EGON分析的知识的基因组合。仅缺氧基因组合被发现在关联基因列表中显著地富集(p＝0.024和p＝0.031；数据未显示)，提示缺氧是关联基因中反映的最显著表型。
为了进一步改善分析，我们自在缺氧条件(0.2％O2,24h)下生长的宫颈癌细胞系产生了子宫颈特定缺氧基因列表。在缺氧治疗期间全部3种细胞系中诱导HIF1α蛋白(数据未显示)。在缺氧处理之后细胞的细胞周期分布未改变(补充图1B)，暗示观察到的基因表达变化不是细胞周期扰动的反映，而是真缺氧应答的结果。产生了4种不同基因列表；在全部3种细胞系中上调的基因，在细胞系之一上调及由文献确认的基因，及相应地对于下调的基因(图2b)。宫颈癌特异性缺氧基因列表被发现在随后基因组富集分析中最显著(表2)，指示DCE-MRI可用于检测患者中的缺氧。
表1：与自GO分析测定的ABrix关联的基因中富集的生物学过程
GO登录号No.GO术语总尺寸尺寸p-值
0008150生物学过程136501657
0008152代谢过程780910100.001
0006139核碱基++代谢3541489<0.001
0006464蛋白修饰过程13421940.007
00067301-碳化合物代谢84170.015
0043284生物聚合体代谢过程4783661<0.001
0007049细胞周期7961170.025
0016043细胞组分组织和生物发生22383040.023
0006996细胞器组织和生物发生11481660.014
0051276染色体组织和生物发生373660.002
0006974响应DNA损伤刺激319530.019
表2：由基因组富集分析测定的关联基因列表中富集的基因组合
基因组合尺寸？p-值Adj p-值
缺氧子宫颈上×3790.0080.085
缺氧子宫颈上&文献2860.0200.085
缺氧上(体外)(49)950.0240.085
缺氧上(体内)(50)910.0310.085
缺氧子宫颈下&文献1830.0720.158
创伤治愈(51)4130.0990.182
增殖(52)*1360.1310.206
增殖(51)1040.1720.226
缺氧子宫颈下×3100.1850.226
辐射抗性(53)250.2640.291
辐射抗性(54)*170.5910.591
*自分子标记数据库(MSigDB)v3.0；http://www.broadinstiture.org/gsea/msigdb/index.jsp
注意：从在我们的实验室中细胞系研究创建红色的基因组合，而余下基因组合从关联文献或从MSigDB获取。
【与预后DCE-MRI参数关联的基因标记】
基于显著缺氧基因组，我们选择了显示基因表达和ABrix之间的反相关的全部基因；即在具有低ABrix的肿瘤中上调的那些，表示“DCE-MRI缺氧标记”。此标记由31个基因组成，就与ABrix的关系，随相关系数和p-值一起列于表3。参与生物学过程的标记中的许多基因知道被缺氧，诸如能量代谢，细胞周期和增殖影响(表3)。
为了确保标记在DCE-MRI患者中具有预后影响，我们基于31个基因的基因表达水平实施了患者的未监督的聚集。聚集显示具有不同结果的2组(图2c)。我们还通过对这31个基因的中位数居中的基因表达水平取平均(转变为对数尺度)来定义了各肿瘤的DCE-MRI-缺氧分值，如由Chi等人描述(32)。在对46名DCE-MRI患者的Kaplan Meier存活分析中，此DCE-MRI-缺氧分值与存活显著地关联(PFS；p＝0.011)(图2d)。
表3：DCE-MRI缺氧基因标记
【独立同群中验证】
为了确证DCE-MRI-缺氧特征的预后影响，对109名宫颈癌患者的独立组实施类似存活分析。在验证组中，聚集导致2个不同簇，及 由于谱中基因高表达聚集在一起的患者相比其余患者显著地更差(p＝0.002)(图3a)。
当评定此独立同群中的DCE-MRI-缺氧分值时，具有高分值的患者相比具有低分值的患者显著地更差(p＝0.006)(图3b)，确认DCE-MRI-缺氧分值的预后值。
采用多变量Cox分析来发现是否任何个体基因相关于临床结果。仅一种基因自此分析新出现，即具有0.010(Bckwd)的p-值的斯钙素2(STC2)(具有1.9的危害比)。STC2与A强烈负关联(p＝0.007)及响应缺氧在全部3种子宫颈细胞系(HeLa：2.5x,SiHa：4.4x,CaSki：2.8x)中上调。STC2的Kaplan Meier分析显示，具有非常高STC2表达的患者相比具有低STC2表达的患者显著地更差(p＝0.006)。STC2与A强烈负关联(p＝0.007；表3)及在转录水平(HeLa：2.5x,SiHa：4.4x,CaSki：2.8x)和蛋白水平响应缺氧在全部3种子宫颈细胞系中上调。
采用多变量Cox分析来研究关于宫颈癌患者中其他临床参数的DCE-MRI缺氧分值的预后值，及其在109名患者的验证同群中独立于淋巴结状态，FIGO阶段和肿瘤体积而作为唯一的预后因素新出现(表4)。
表4：109个验证患者中DCE-MRI缺氧分值的多变量分析
FIGO，妇科学和产科学国际联盟
*自预处理磁共振像测定和基于3个正交直径(a,b,c)计算为(π/6)abc。
【实施例2】
31-基因缺氧标记的检查揭示，多至8个基因是HIF1α(其是细胞中缺氧应答的主要调节物)的已知道的靶基因。基于此观察，决定检查与基因标记关联的攻击性的表型的HIF1α的作用。由此，实施免疫组织化学实验，以在我们的研究中，在全部子宫颈肿瘤中，在表达水平检查HIF1α蛋白。发现，相比具有负分值的患者，HIF1α蛋白的水平在具有正缺氧分值的患者中显著地更高，如自我们的缺氧基因标记计算(p<0.001)(图4)。此外，HIF1α和在标记中31个基因中的几个的表达水平之间有个别关联，包括8个知道的HIF1α靶基因中的5个(表5)。
表5.缺氧标记基因和与HIF1α的关联
基因*Corr，coeff.**p-值**
AK3L1(AK4)0.397<0.001
C20orf200.2190.010
ECE20.2710.001
ERO1L0.2150.011
FGF110.2380.005
GAPDH0.322<0.001
KCTD110.1960.020
LOC401152(C3orf4)0.1970.020
P4HA20.2570.002
PFKFB40.369<0.001
PVR0.2720.001
RPL36A0.1630.056
STC20.1560.067
TRAPPC10.2140.011
*以粗体显示的基因是HIF1α蛋白的知道的靶
**相关系数和p-值自Spearman氏排序关联。
这些发现指示，HIF1α在我们的标记中具有高基因表达的肿瘤中活化，及支持我们的基因标记和缺氧表型之间的关联。
【实施例3】
下列实施例提供数据，其显示淋巴结阴性患者中基因标记的更优预后值。
【淋巴结阴性和阳性患者之间的比较】
以上数据显示在局部进展的宫颈癌中31-基因缺氧标记的优良的预后值。我们还研究了是否标记对不同患者亚组具有不同预后值的问题。在实施Kaplan Meier存活分析之前，对于患者基于淋巴结转移的存在分级。此分析显示，标记与无向淋巴结转移的患者的差结果强烈关联(p<0.001)(图5)。在此患者组中，对于具有正缺氧分值的患者，无进展存活的概率自93.3％降低至51％。在淋巴结阳性患者中，有向缺氧分值和结果之间的关联的趋势(图5)，但患者数对于获得统计学意义而言很可能太低。
【基因标记和HIF1α蛋白表达之间的比较】
由于其在细胞缺氧应答中的作用，HIF1α蛋白表达已被建议作为缺氧标志物。我们因此比较了我们的基因标记的预后影响与我们的宫颈癌同群中HIF1α蛋白表达的影响。发现，HIF1α蛋白表达未与存活关联。但是，根据缺氧分值的发现；在具有无淋巴结转移的患者中，高水平的HIF1α呈现为差结果的显著预后指示物(p＝0.026)(图6)。
自Kaplan-Meier分析，HIF1α蛋白表达似乎相比缺氧分值具有更弱的预后影响。为了评价缺氧分值和HIF1α蛋白表达对患者存活的相对重要性，在具有无淋巴结转移的患者组中实施这些因素与临床参数一起的多变量Cox分析(n＝86)。自此分析得知，仅缺氧分值和FIGO阶段被发现与患者存活独立地相关(表6)。
表6.86名淋巴结阴性患者中缺氧分值，HIF1α和临床变量和无进展存活的Cox回归分析
因素单变量分析 多变量分析
P相对风险95％CIP相对风险95％CI
肿瘤体积a0.0183.511.24-9.99N.S--
FIGO-阶段b0.0282.791.12-6.950.0422.831.03-7.70
缺氧-分值c0.0027.212.10-24.770.0039.502.15-41.90
HIF1αd0.0592.390.97-5.91N.S--
缩写：
FIGO，Federation International de Gynecologie et d’Obstetrique；
P，P-值；
CI，置信区间。
a 肿瘤尺寸基于43.8cm3的中位体积分为2组；
b FIGO阶段分为2组：1b～2b和3a～4a；
c 缺氧分值分为2组，基于的值<0和>0；
d HIF1α免疫组织化学分值分为2组：0～3，4～5。
【结论】
以上提供的数据指示，HIF1α(其在特定癌类型中用作缺氧标志物)是与我们的缺氧基因标记关联的攻击性的表型的重要介质。此支持31-基因缺氧标记和缺氧表型之间的关联。多变量分析显示，缺氧标记是相比HIF1α显著地更佳的预后因素。而且，基因标记似乎特别在无向淋巴结转移的患者中相关于进攻性。此患者组一般构成经历治疗剂化学放射疗法的宫颈癌患者的主要亚组。在具有高复发风险的此亚组中鉴定患者的手段少，及令人感兴趣地，缺氧已显示是其中对于这些患者最强预后因素(55)。此数据显示，缺氧基因标记是在此患者组中鉴定具有缺氧-相关的抗化学放射性的患者所需要的生物标志物。
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以上说明书中提及的全部出版物和专利通过引用在本文合并。描述的本发明的方法和系统的各种修饰和变异而不离开本发明的范围和精神会对于本领域技术人员是显而易见的。尽管本发明已关联特定优选的实施方式描述，应明白，要求保护的发明不应过度地限制到该特定实施方式。的确，医疗科学领域技术人员明晰的用于实施本发明的描述的模式的各种修饰旨在包括在以下权利要求的范围之内。