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1、(10)申请公布号 CN 102818903 A (43)申请公布日 2012.12.12 CN 102818903 A *CN102818903A* (21)申请号 201210302800.X (22)申请日 2012.08.23 G01N 33/92(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/546(2006.01) (71)申请人 上海睿康生物科技有限公司 地址 201112 上海市闵行区联航路1588号1 幢软件孵化大楼 1# 楼 301 室、 302 室 (72)发明人 房君江 李伟奇 张秀文 林清玉 (54) 发明名称 一种双粒子复合的 Lp-a 。
2、检测试剂盒 (57) 摘要 一种双粒子复合的 Lp-a 检测试剂盒， 它涉 及医学免疫体外诊断领域， 它由 R1 试剂、 R2 试 剂及校准品三部分组成， R1 试剂的组成为 ： PH 7.0-7.6 的磷酸盐缓冲液 30-80mmol/l、 聚乙二 醇 6000-1000060-120mm/l 和乙二胺四乙酸二钠 10-20mmol/L ； R2 试剂的组成为 ： 羊抗人 Lp-a 多 克隆抗体、 聚苯乙烯胶乳包被、 PH7.0-7.6的磷 酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠等， 校准品的组 成为 ： 0-10mg/l 牛血清基质、 叠氮钠 0.2-2.2、 吐温 -201-10、 牛血清白蛋白 。
3、1-3。它操作简 便、 特异性好， 大大提高了抗体的纯度， 最大限度 避免了非特异反应， 使结果准确性有了较大提高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种双粒子复合的 Lp(a) 检测试剂盒， 其特征在于它由 R1 试剂、 R2 试剂及校准品三 部分组成， R1 试剂质量比的组成为 ： PH 7.0-7.6 的磷酸盐缓冲液 30-80mmol/l、 聚乙二醇 6000-1000060-120mm/l 和乙二胺四乙酸二钠 1。
4、0-20mmol/L ； R2 试剂的组成为 ： 羊抗人 Lp-a 多克隆抗体、 聚苯乙烯胶乳包被、 PH 7.0-7.6 的磷酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠等， 校 准品的组成为 ： 0-10mg/l 牛血清基质、 叠氮钠 0.2-2.2、 吐温 -20 1-10、 牛血清白蛋白 1-3， 上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。 2. 根据权利要求 1 所述的一种双粒子复合的 Lp(a) 检测试剂盒， 其特征在于所述的 R2 试剂中羊抗人 Lp-a 多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为 1/10-5/10。 3. 根据权利要求 1 所述的一种双粒子复合的 Lp(a) 检测试剂盒， 其特征在于。
5、所述的 R2 试剂中抗体包被过程中， 封闭液组分包括 0.5 -1.5脱脂奶粉、 10-60mm 的甘氨酸， 胶 乳稀释液组分包括 PH7.0-7.6 磷酸盐缓冲液 30-80mmol/l， 0.5 -1.5脱脂奶粉， 0.9 NaN3。 4. 根据权利要求 1 所述的一种双粒子复合的 Lp(a) 检测试剂盒， 其特征在于所述的 R2 试剂的制备过程为 ： 将 190nm 的聚苯乙烯胶乳粒子与 45nm 的聚苯乙烯胶乳粒子按照 1 4 的比例混合， 羊抗人 Lp-a 多克隆抗体和混合后的聚苯乙烯胶乳以 30 100 的质量比混合， 缓冲液采用0.02M的磷酸缓冲液， 将两者混匀后37吸附8小时。
6、， 之后透析除去未连接上的 抗体， 加入封闭液 0.1脱脂奶粉和 0.2mm 的甘氨酸， 封闭 2 小时， 离心去上清， 用 PH7.4 磷 酸盐缓冲液45mmol/l， 乙二胺四乙酸二钠10.2mmol/l， 0.05脱脂奶粉， 0.9NaN3稀释至 0.18。 5. 根据权利要求 1 所述的一种双粒子复合的 Lp(a) 检测试剂盒， 其特征在于所述的校 准品制备过程为 ： 将经过处理的牛血清， 加入 BAS 0.1， NaN3 0.9得到校准品稀释液。 权 利 要 求 书 CN 102818903 A 2 1/3 页 3 一种双粒子复合的 Lp-a 检测试剂盒 技术领域 ： 0001 本发。
7、明涉及医学免疫体外诊断领域， 具体涉及一种双粒子复合的 Lp-a 检测试剂 盒。 背景技术 ： 0002 1963年Berg在血浆脂蛋白电泳时发现-脂蛋白部分有一种新的抗原成分， 并与 LDL 结合， 将此抗原成分命名为脂蛋白 (a)。其后证实， Lp-a 核心部分由甘油三酯、 磷脂、 胆 固醇、 胆固醇脂等脂质和载脂蛋白B组成， 结构类似LDL， 但还含有一独特的Apo(a)， 后者在 其它任何脂蛋白中都不存在。研究表明， 肝脏是合成 Apo(a) 的主要场所。Lp-a 与 LDL 不一 样， 并不是由 VLDL 转化而来， 也不能转化为其它脂蛋白， 系一类独立的脂蛋白。人类 Lp-a 代谢。
8、的突出特征是， 个体间 Lp-a 水平可相差 100 倍， 但同一个体血浆 Lp-a 水平的变化则相 对较小。个体间 LDL 受体缺陷可影响 Lp-a 浓度， 可能与体内 Lp-a 合成增加有关。 0003 Lp-a 是冠心病的一个独立危险因素， 而与吸烟、 高血压、 LDL-C 和 HDL-C 以及 ApoA-1 与 ApoB 等均无关。与其它脂蛋白或载脂蛋白相比， Lp-a 与男性冠心病的关系尤为 密切。血浆 Lp-a 的危险性临界水平一般在 0.2 0.3g/L， 如超过 0.30g/L 则 AS 的危险 性上升 2 倍， 如同时伴有 LDL-C 上升， CHD 的相对危险性上升 5 倍。
9、。且 Lp-a 水平越高， 发生 CHD 则越早。Lp-a 具有多基因遗传特性， 有 CHD 家族史者， Lp-a 阳性率明显高于无家族史 者。 0004 胶乳颗粒增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、 准确的体液蛋白均相免疫比 浊检测方法。PETIA 法大体分为两种。一种是散射比浊检测法 ； 另一种是透射比浊检测法。 这两种方法的基本原理非常相似， 都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体， 当交联 有抗体的微球与抗原结合后， 在短时间内会迅速聚集在一起， 改变了反应液的散光性能或 透光性能。而且， 反应液散光性能或透光性能 ( 即吸光度 ) 的改变与被测抗原的浓度有较 强的相关性， 在一定。
10、范围内可以反映被测抗原的浓度。 PETIA检测方法是在均相反应体系中 进行抗原、 抗体反应及结果的测定。 抗原、 抗体反应后， 直接测定反应液的吸光度值， 省却了 ELISA 法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤， 几分钟就能获得结果， 省时省力。此外， 纳米免 疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、 环境等外界因素的干 扰， 稳定性和重复性都较好， 能较真实地反映被测物质的含量。 免疫比浊法的灵敏度虽然比 ELISA 法差一些， 但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值， 可完全满足临床检测 要求。 0005 由于血清 Lp-a 的含量低， 其测定方法需要较高的灵敏度和特。
11、异性。由最初免疫 电泳的定性检测， 到放射免疫、 荧光免疫和酶免疫的定量检测， 以及到免疫比浊的自动化检 测， 发展十分迅速。单向免疫扩散 (SRID)、 放射免疫测定法 (RIA)、 荧光免疫测定发 (FIA)、 时间分辨荧光免疫测定法 (TRFIA)、 酶联免疫测定法 (ELISA)、 胶乳颗粒法、 颗粒增强透射 免疫比浊法 (PETIA)、 颗粒增强散射免疫比浊法 (PENIA)。目前， 免疫比浊法是最为普遍通 用的方法， 但是免疫比浊法最高检测限只能达到 30mg/l， 线性只能达到 800mg/l， 在临床应 说 明 书 CN 102818903 A 3 2/3 页 4 用上存在着局。
12、限性。 发明内容 ： 0006 本发明的目的是提供一种双粒子复合的 LP-a 检测试剂盒， 它操作简便、 快速、 灵 敏度高、 特异性好， 大大提高了抗体的纯度， 最大限度避免了非特异反应， 使结果准确性有 了较大提高。 0007 为了解决背景技术所存在的问题， 本发明是采用以下技术方案 ： 它由 R1 试剂、 R2 试剂及校准品三部分组成， R1 试剂的质量比组成为 ： PH 7.0-7.6 的磷酸盐缓冲液 30-80mmol/l、 聚乙二醇6000-1000060-120mm/l和乙二胺四乙酸二钠10-20mmol/L ； R2试剂 的组成为 ： 羊抗人 Lp-a 多克隆抗体、 聚苯乙烯胶。
13、乳包被、 PH 7.0-7.6 的磷酸盐缓冲液和 乙二胺四乙酸二钠等， 校准品的组成为 ： 0-10mg/l 牛血清基质、 叠氮钠 0.2-2.2、 吐温 -20 1-10、 牛血清白蛋白 1-3， 上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。 0008 所述的 R2 试剂中羊抗人 Lp-a 多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为 1/10-5/10。 0009 所述的 R2 试剂中抗体包被过程中， 封闭液组分包括 0.5 -1.5脱脂奶 粉、 10-60mm 的甘氨酸， 胶乳稀释液组分包括 PH7.0-7.6 磷酸盐缓冲液 30-80mmol/l， 0.5 -1.5脱脂奶粉， 0.9 NaN3。 。
14、0010 所述的 R2 试剂的制备过程为 ： 将 190nm 的聚苯乙烯胶乳粒子与 45nm 的聚苯乙 烯胶乳粒子按照 1 4 的比例混合， 羊抗人 Lp-a 多克隆抗体和混合后的聚苯乙烯胶乳以 30 100 的质量比混合， 缓冲液采用 0.02M 的磷酸缓冲液， 将两者混匀后 37吸附 8 小时， 之后透析除去未连接上的抗体， 加入封闭液0.1脱脂奶粉和0.2mm的甘氨酸， 封闭2小时， 离心去上清， 用PH7.4磷酸盐缓冲液45mmol/l， 乙二胺四乙酸二钠10.2mmol/l， 0.05脱脂 奶粉， 0.9 NaN3 稀释至 0.18 ； 0011 所述的校准品制备过程为 ： 将经过处。
15、理的牛血清， 加入 BAS 0.1， NaN3 0.9得 到校准品稀释液 ； 0012 本发明具有以下有益效果 ： 它操作简便、 快速、 灵敏度高、 特异性好， 大大提高了抗 体的纯度， 最大限度避免了非特异反应， 使结果准确性有了较大提高。 附图说明 ： 0013 图 1 为本发明中实施例 1 的结构示意图。 具体实施方式 ： 0014 本具体实施方式采取以下技术方案 ： 它由 R1 试剂、 R2 试剂及校准品三部分组 成， R1 试剂的质量比组成为 ： PH 7.0-7.6 的磷酸盐缓冲液 30-80mmol/l、 聚乙二醇 6000-10000 60-120mm/l 和乙二胺四乙酸二钠 。
16、10-20mmol/L ； R2 试剂的组成为 ： 羊抗人 Lp-a 多克隆抗体、 聚苯乙烯胶乳包被、 PH 7.0-7.6 的磷酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠 等， 校准品的组成为 ： 0-10mg/l 牛血清基质、 叠氮钠 0.2-2.2、 吐温 -201-10、 牛血清白 蛋白 1-3， 上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。 0015 所述的 R2 试剂中羊抗人 Lp-a 多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为 说 明 书 CN 102818903 A 4 3/3 页 5 1/10-5/10。 0016 所述的 R2 试剂中抗体包被过程中， 封闭液组分包括 0.5 -1.5脱脂奶 粉、 。
17、10-60mm 的甘氨酸， 胶乳稀释液组分包括 PH7.0-7.6 磷酸盐缓冲液 30-80mmol/l， 0.5 -1.5脱脂奶粉， 0.9 NaN3。 0017 所述的 R2 试剂的制备过程为 ： 将 190nm 的聚苯乙烯胶乳粒子与 45nm 的聚苯乙 烯胶乳粒子按照 1 4 的比例混合， 羊抗人 Lp-a 多克隆抗体和混合后的聚苯乙烯胶乳以 30 100 的质量比混合， 缓冲液采用 0.02M 的磷酸缓冲液， 将两者混匀后 37吸附 8 小时， 之后透析除去未连接上的抗体， 加入封闭液0.1脱脂奶粉和0.2mm的甘氨酸， 封闭2小时， 离心去上清， 用PH7.4磷酸盐缓冲液45mmol。
18、/l， 乙二胺四乙酸二钠10.2mmol/l， 0.05脱脂 奶粉， 0.9 NaN3 稀释至 0.18 ； 0018 所述的校准品制备过程为 ： 将经过处理的牛血清， 加入 BAS 0.1， NaN3 0.9得 到校准品稀释液 ； 0019 本具体实施方式具有以下有益效果 ： 它操作简便、 快速、 灵敏度高、 特异性好， 大大 提高了抗体的纯度， 最大限度避免了非特异反应， 使结果准确性有了较大提高。 0020 实施例 1 ： 相关性试验， 使用本法发明试剂和对照试剂 A 公司的 Lp-a 胶乳增强型 试剂， 采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清按各自参数同时进行测定， 对测定值 进行相关性分析， 按照与上述” Lp-a 测定方法” 中的参数进行测定测定结果见图 1， X， Y 轴 均为测定值 (Lp-a 的含量 mg/L)。 0021 由 图 1 的 结 果 看 出， 两 种 试 剂 的 相 关 系 为 R2 0.985， 回 归 方 程 为 y 0.978x+5.896。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好， 具有很好的特异性 和准确性。 说 明 书 CN 102818903 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102818903 A 6 。