猕猴属灵长类动物电刺激精液采集方法
技术领域
本发明属于动物生殖方法，特别是采集猕猴属灵长类动物精子的方法。
背景技术
猕猴属灵长类动物，如猕猴、食蟹猴、熊猴、藏酋猴等是人类的近亲，其组织结构，生理生化、免疫和代谢等方面与人类高度相似，是建立病毒等传染性疾病模型、精神神经性疾病模型、心血管疾病模型、肿瘤模型和生殖生理等研究的最佳实验动物。但由于野外生存环境的持续恶化和破坏，野生灵长类动物繁殖能力及必要条件逐渐下降和丧失，猕猴属中各灵长类物种已成为珍稀濒危动物，并被列为国家一、二级保护动物。随着人口的增加和环境的恶化，一方面人类面临一些重大功能性疑难疾病的不断困扰，需要大量猕猴动物用于自然科学研究和解决人口与健康问题，另一方面，这些动物的饲养和繁殖以及相应的设施等却非常昂贵。因此，保护和保存实验动物资源被提升为国家战略性研究资源需求。运用生殖辅助技术，例如体外受精，人工授精等技术可以有效地提高雄猴的利用率和利用价值，并且可以缩短繁殖周期并有效地提高繁殖和生产动物的效率，减少疾病传播。
电刺激采集精液是灵长类动物人工授精，体外受精和精子生物学研究的基本手段。灵长类动物目前的精液采集常用的方法有直肠电刺激采精法和阴茎电刺激采精法。直肠刺激法在采精前需要冲洗排除动物直肠内粪便，采集时需要将电极准确放置于前列腺部位，该部位容易刺激膀胱等器官而造成精液被尿液污染，该方法步骤繁琐且不卫生健康。常规的灵长类动物阴茎电刺激法多用铝箔、铜网等直接缠绕动物的阴茎，金属电极与皮肤直接接触，由于该类动物阴茎结构不同，阴茎和电极之间的接触状况及阴茎表皮阻抗不同，藏酋猴和熊猴阴茎近龟头端和龟头后缘背侧分布有密集的刺状角质乳头，要使金属电极与阴茎表面均匀接触几乎不可能，容易产生局部电流过大使阴茎表皮烧伤甚至上皮损伤。因此，提高猕猴属灵长类动物精液采集的成功率并避免操作过程对动物造成损伤是本领域亟待解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术步骤繁琐且污染采集或易灼伤动物阴茎表皮等弊端，本发明的目的是提供一种可广泛应用于猕猴属各灵长类物种的阴茎电刺激精液采集方法，提高精液采集成功率和采集质量。
本发明目的通过以下步骤实现：
(1)将性成熟的灵长类动物用盐酸氯胺酮以3-4mg/kg体重肌肉注射轻度麻醉，动物保定仰式，清理、消毒阴茎区域；
(2)取两块经生理盐水充分浸润2cm宽、4-5cm长的脱脂棉，分别包裹两条3-5mm宽、6-7cm长的铝箔纸条制成两个阴茎刺激电极条；
(3)将电极条分别环绕在动物阴茎基部和近龟头端，电极条环绕连接点用导线与脉冲电源连接；
(4)接通脉冲电源，脉冲频率设置为甚低频；电压从0V开始，以5-10Vs速度递增，每递增一次持续刺激10-15s，直至60V；
(5)射精即停止刺激，收集精液于37℃孵育30分钟，分离出液体部分的精液。
所述的脉冲电压的递增速度为10V/s。
所述的脉冲电压为对称方波，其频率为17Hz，脉宽为17ms。
所述动物阴茎基部电极连脉冲电源正极，近龟头端电极连脉冲电源负极。
所述方法可以按步骤(4)进行6-7次刺激，每两次刺激之间间隔20-30s。
本发明具有的进步是：
本发明利用生理盐水浸润脱脂棉包裹铝箔制成与阴茎有良好接触的电极条，使得电极的导电性能不受影响，并避免了局部电流过大灼伤阴茎的现象，对于动物阴茎表皮具有良好的保护效果。
本发明还确定了猕猴属灵长类动物阴茎电刺激精液采集所需的电压范围，间隔时间、脉冲频率、脉宽、占空比等基本参数，能够提高精液采集的成功率和质量。
本发明与环境友好、保护动物、且取材容易，操作简便，节省材料。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步描述，实施例应被理解为对本发明的诠释而非对本发明保护范围的限制。
具体实施方式
实施例1
用盐酸氯胺酮以4mg/kg体重肌肉注射轻度麻醉熊猴，将动物保定为仰式。用生理盐水清理猴子阴茎区域，并用75％的医用酒精对阴茎表面消毒处理。准备两条5mm宽、7cm长的铝箔纸条，分别用脱脂棉包裹，并用生理盐水分别充分浸润制成两个电极条。将这两个电极条分别环绕在动物的阴茎基部和近龟头端，使电极条与猴子阴茎表面皮肤充分接触。将电极条通过导线分别连接脉冲输出电流的正极和负极。将脉冲电流的频率设置为17Hz，脉宽为17ms，占空比1，接通电源，电压从0V开始，以5V/s速度升高电压，每增加10V持续刺激15s，然后再以相同速度增加5V直至60V。如有必要可进行6-7次刺激，每两次刺激之间间隔30s的休息时间。猴子射精则立即停止刺激。
采集的熊猴精液，未发生熊猴阴茎表皮灼伤现象。精液体积为3.2mL，其中液体部分为1.2mL，精子浓度为11.5×108/mL，精子运动度为81％，形态正常的精子占74％。
实施例2
用盐酸氯胺酮以3mg/kg体重肌肉注射轻度麻醉猕猴，将动物保定为仰式。用生理盐水清理猴子阴茎区域，并用75％的医用酒精对阴茎表面消毒处理。准备两条3mm宽、5cm长的铝箔纸条，分别用脱脂棉包裹，并用生理盐水分别充分浸润制成两个电极条。将这两个电极条分别环绕在动物的阴茎基部和近龟头端，使电极条与猴子阴茎表面皮肤充分接触。将电极条通过导线与脉冲电流输出口相连接。阴茎基部电极连正极，近龟头端电极连负极。将输出方波的频率设置为15Hz，脉宽为17ms，占空比1，接通电源，电压从0V开始，以10V/s速度升高电压，每增加10V持续刺激10s，再以10V递增直至60V。重复6-7次刺激，每两次刺激之间间隔30s的休息时间。猴子射精时立即停止刺激。
采集的猕猴精液，未发生猕猴阴茎表皮灼伤现象。精液体积为2mL，其中液体部分为0.7mL，精子浓度为12.6×108/mL，精子运动度为85％，形态正常的精子占78％。
实施例3.
用盐酸氯胺酮以3mg/kg体重肌肉注射轻度麻醉食蟹猴，将动物保定为仰式。用生理盐水清理猴子阴茎区域，并用75％的医用酒精对阴茎表面消毒处理。准备两条3mm宽、5cm长的铝箔纸条，分别用脱脂棉包裹，并用生理盐水分别充分浸润制成两个电极条。将这两个电极条分别环绕在动物的阴茎基部和近龟头端，使电极条与猴子阴茎表面皮肤充分接触。将电极条通过导线与脉冲电流输出口相连接。阴茎基部电极连正极，近龟头端电极连负极。将脉冲输出方波的频率设置为18Hz，脉宽为17ms，占空比1，起始电压为0V，接通电源，以10V/s的速度升高电压，每增加10V持续刺激10s，然后再以相同速度增加10V直至60V。重复6-7次刺激，每两次刺激之间间隔30s的休息时间。猴子射精时立即停止刺激。
采集的猕猴精液，未发生食蟹猴阴茎表皮灼伤现象。精液体积为1.8mL，其中液体部分为0.5mL，精子浓度为10.5×108/mL，精子运动度为79％，形态正常的精子占74％。
实施例4：
用盐酸氯胺酮以3mg/kg体重肌肉注射轻度麻醉藏酋猴，将动物保定为仰式。用生理盐水清理猴子阴茎区域，并用75％的医用酒精对阴茎表面消毒处理。准备两条3mm宽、5cm长的铝箔纸条，分别用脱脂棉包裹，并用生理盐水分别充分浸润制成两个电极条。将这两个电极条分别环绕在动物的阴茎基部和近龟头端，使电极条与猴子阴茎表面皮肤充分接触。将电极条通过导线分别连接脉冲电流输出口正极和负极。将脉冲输出设置为方波、频率17Hz，脉宽为17ms，占空比1。接通电源，电压从0V开始，以10V/s的速度升高电压，每增加10V持续刺激10s，再以相同速度增加10V直至60V。重复6-7次刺激，每两次刺激之间间隔30s的休息时间。猴子射精时立即停止刺激。
采集的藏酋猴精液，未发生藏酋猴阴茎表皮灼伤现象。精液体积为6.3mL，其中液体部分为2.1mL，精子浓度为45.6×108/mL，精子运动度为82％，形态正常的精子占78％。