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1、(10)申请公布号 CN 102559930 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102559930 A *CN102559930A* (21)申请号 201210014396.6 (22)申请日 2012.01.16 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 中山大学达安基因股份有限公司 地址 510665 广东省广州市高新技术产业开 发区香山路 19 号 (72)发明人 李明 丁渭 陈华云 (54) 发明名称 一种荧光定量 RT-PCR 检测丙型肝炎病毒的 试剂盒 (57) 摘要 本发。
2、明涉及一种荧光定量 RT-PCR 检测丙型 肝炎病毒的试剂盒， 特别是涉及以一步法实时荧 光逆转录 - 聚合酶链反应 (RT-PCR) 技术快速、 定 量检测丙型肝炎病毒感染的试剂盒。本试剂盒具 有很高的灵敏度和特异性， 通过本发明的试剂盒 实现对血清或血浆样本中丙型肝炎病毒核酸 RNA 进行定量检测， 适用于丙型肝炎病毒感染的辅助 诊断和丙型肝炎病毒感染者药物治疗的疗效监 测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 2 页 附图 3 页 。
3、1/1 页 2 1.一种荧光定量RT-PCR检测丙型肝炎病毒的试剂盒， 试剂盒包括 ： (1)核酸提取试剂、 HCV 反应液 A、 HCV 反应液 B、 HCV 反应液 C、 HCV 内标溶液、 阴性质控品、 HCV 强阳性质控品、 HCV临界阳性质控品、 HCV阳性定量参考品1-4， 和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包 装盒， 其中 PCR 反应体系包括 HCV 反应液 A、 HCV 反应液 B 和 HCV 反应液 C， 其特征在于 HCV 反应液 A( 引物探针混合液 ) 中正向和反向引物分别是 ： 5 -CATGGCGTTAGTAYGAGTGTCG-3 (SEQ ID NO ： 1。
4、) 5 -TCCYGGCAATTCCGGTGTAC-3 (SEQ ID NO ： 2) ； HCV 反应液 A 寡核苷酸探针是 5 -X-TCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCG-Y-3 (SEQ ID NO ： 3)， 其中 X/Y 表示荧光标记基团， 包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧 光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针 ； HCV反应液A中寡核苷酸探针是5 -X-TCCACGGCAACTCTAGTCGCCCTGC-Y-3 (SEQ ID NO ： 4)， 其中 X/Y 表示荧光标记基团， 包括能够与内标多核苷酸结合并且两末端分别结合的有 荧光发生基团和荧光淬灭。
5、基团的寡核苷酸探针。 2. 根据权利要求 1 的试剂盒， 其特征还在于正、 反向引物的浓度均为 10pmol/ 人份， 目 的寡核苷酸探针、 内标寡核苷酸探针的浓度均为 5pmol/ 人份。 3. 根据权利要求 1 的试剂盒， HCV 反应液 B 由逆转录酶 (c-MMLV 酶 )、 热启动 Taq 酶、 RNasin、 dNTPs、 酶稀释液组成， 其中 c-MMLV 酶用量为 1.5 3.5U/ 人份、 热启动 Taq 酶用量 为 3 7U/ 人份、 RNasin 用量为 15 25U/ 人份、 dNTPs 浓度为 0.20mmol/L， 酶稀释液为一 般市售的酶系稀释液。 4. 根据权利。
6、要求 1 的试剂盒， HCV 反应液 C 包括一步法 RT-PCR 反应缓冲液和 DEPC 水， 其中一步法 RT-PCR 反应缓冲液包含 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、 50mmol/L KCl、 3.0mmol/ LMgCl2。 5. 根据权利要求 1 的试剂盒， 其特征还在于 PCR 扩增的最佳反应温度和时间为 ： 50 逆转录15min， 1个循环 ； 95 15min， 1个循环 ； 最后94 15s， 55 45s， 45个循环收集荧 光信号。 6. 根根据权利要求 1 的试剂盒， 其特征还在于阴性质控品为阴性血浆， HCV 强阳性质 控品和 HCV 临界阳性质。
7、控品均为含有 HCV 目的片段的病毒样颗粒， 且浓度分别为 5.0106 和 5.0103IU/ml ； HCV 阳性定量参考品 1-4 均为含有 HCV 目的片段的重组质粒， 浓度为 1.0104-1.0107IU/ml ； 质粒和病毒样颗粒均由上下游引物扩增的 PCR 产物通过市售的 载体克隆构建而成， 所使用的上下游引物序列 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2。 7. 根根据权利要求 1 的试剂盒， 其特征还在于试剂盒的待检样品是血清或血浆等样 品。 权 利 要 求 书 CN 102559930 A 2 1/9 页 3 一种荧光定量 RT-PCR 检测丙型肝炎病毒。
8、的试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种荧光定量 RT-PCR 检测丙型肝炎病毒的试剂盒， 特别是涉及以一 步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、 定量检测丙型肝炎病毒感染的试 剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性， 通过本发明的试剂盒实现对血清或血浆样本 中丙型肝炎病毒核酸 RNA 进行定量检测， 适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断和丙型肝炎 病毒感染者药物治疗的疗效监测。 背景技术 0002 丙型肝炎 (Hepatitis C virus， HCV) 是一种隐匿性、 传染性、 持续性、 进展性疾 病， 主要经血液传播的由丙型肝炎病毒感染引起的疾病， 丙型肝炎慢性化率。
9、可高达 50 80， 可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化， 部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌 (HCC)， 对患者的健康和生命危害极大， 已成为严重的社会和公共卫生问题。丙型肝炎的感染呈世 界性分布， 是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。据世界卫生组织统计， 全球 HCV 的感染率约为 3， 每年新发丙型肝炎病例约 3.5 万例。中国 CDC 报告丙型肝炎病例在最 近 5 年内翻了 5 倍， 总感染人数达 4000 万， 且不能排除存在漏报的可能。我国血清流行病 学调查资料显示， 我国一般人群抗 -HCV 阳性率为 3.2。各地抗 -HCV 阳性率有一定差异， 以长江为界， 北方 (3.6。
10、 ) 高于南方 (2.9 )， 西南、 华东、 华北、 西北、 中南和东北分别为 2.5、 2.7、 3.2、 3.3、 3.8和4.6。 抗-HCV阳性率随年龄增长而逐渐上升， 由1岁 组的 2.0至 50 59 岁组的 3.9。男女间无明显差异。 0003 HCV 属于黄病毒科 (flaviviridae)， 其基因组为单股正链 RNA， 易变异， 目前可分 为 6 个基因型及不同亚型， 按照国际通行的方法， 以阿拉伯数字表示 HCV 基因型， 以小写的 英文字母表示基因亚型 ( 如 1a、 2b、 3c 等 )。HCV 基因 1、 2、 3 型呈全世界流行， 并且是美洲、 欧洲和日本的主。
11、要基因型， 其中基因1型还是流行最广泛的基因型， 占所有HCV感染的70 以上。中国的主要流行型是基因 1b 型和 2a 型， 南方基本上都为 1b 型， 从南向北 2a 型逐渐 增多， 至北方部分地区， 1b 和 2a 比例基本接近。1a 型散发于中原地区， 2b 型仅散见报道。 0004 HCV 的传播途径包括经血液传播、 性传播和母婴传播。(1) 血液传播 ： 是主要的传 播方式， 主要有 ： 经输血和血制品传播。由于抗 -HCV 存在窗口期、 抗 -HCV 检测试剂的质量 不稳定及少数感染者不产生抗 -HCV， 因此， 无法完全筛出 HCV 阳性者， 大量输血和血液透析 可能感染 HC。
12、V ； 经破损的皮肤和黏膜传播 ： 这是目前最主要的传播方式， 在某些地区， 因静 脉注射毒品导致 HCV 传播占 60 90。使用非一次性注射器和针头、 未经严格消毒的牙 科器械、 内镜、 侵袭性操作和针刺等也是经皮传播的重要途径。 一些可能导致皮肤破损和血 液暴露的传统医疗方法也与 HCV 传播有关 ； 共用剃须刀、 牙刷、 纹身和穿耳环孔等也是 HCV 潜在的经血传播方式。(2) 性传播 ： 与 HCV 感染者性交及有性乱行为者感染 HCV 的危险性 较高。同时伴有其他性传播疾病者， 特别是感染人免疫缺陷病毒 (HIV) 者， 感染 HCV 的危险 性更高。(3) 母婴传播 ： 近几年来。
13、， HCV 母婴传播越来越受到人们的关注。抗 -HCV 阳性母亲 将 HCV 传播给新生儿的危险性为 2， 若母亲在分娩时 HCV RNA 阳性， 则传播的危险性可高 说 明 书 CN 102559930 A 3 2/9 页 4 达 4 7 ； 合并 HIV 感染时， 传播的危险性增至 20。HCV 病毒高载量可能增加传播的 危险性。此外， 还有部分 HCV 感染者的传播途径不明。 0005 HCV感染的常用的实验室检测包括血清生化学检测、 抗-HCV检测、 HCV RNA检测及 基因型芯片检测等。 0006 1 血清生化学检测 0007 ALT、 天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 水平变化可反。
14、映肝细胞损害程度， 但 ALT、 AST 水 平与 HCV 感染引起的肝组织炎症分度和病情的严重程度不一定平行 ； 急性丙型肝炎患者的 ALT 和 AST 水平一般较低， 但也有较高者。急性丙型肝炎患者的血清白蛋白、 凝血酶原活动 度和胆碱酯酶活性降低较少， 但在病程较长的慢性肝炎、 肝硬化或重型肝炎时可明显降低， 其降低程度与疾病的严重程度成正比。 0008 慢性丙型肝炎患者中， 约 30 ALT 水平正常， 约 40 ALT 水平低于 2 倍正常值上 限。 虽然大多数此类患者只有轻度肝损伤， 但有部分患者可发展为肝硬化。 ALT水平下降是 抗病毒治疗中出现应答的重要指标之一。 凝血酶原时间。
15、可作为慢性丙型肝炎患者病情进展 的监测指标， 但迄今尚无一个或一组血清学标志可对肝纤维化进行准确分期。 0009 2 抗 -HCV 检测方法 0010 抗-HCV就是丙型肝炎病毒抗体。 EIA(enzyme immunoassay)是指用酶标记抗体或 抗抗体进行的抗原抗体反应。基本原理是先将已知的抗原或抗体结合在某种固相载体上， 并保持其免疫活性。测定时， 将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸 附的抗原或抗体发生反应， 用洗涤方法分离抗原抗体复合物和游离成分， 然后加入酶的作 用底物催化显色， 进行定性或定量测定。测定抗 -HCV 的常用方法是间接法 ： 将已知抗原吸 附于固相。
16、载体， 加入待检标本 ( 含相应抗体 ) 与之结合， 洗涤后， 加入酶标抗抗体和底物进 行测定。 0011 抗 -HCV 酶免疫法 (EIA) 适用于高危人群筛查， 也可用于 HCV 感染者的初筛。 抗 -HCV 检测阳性提示感染丙肝病毒。但抗 -HCV 阴转与否不能作为抗病毒疗效的指标。对 抗 -HCV 阳性结果的解释和评估要结合检测时所采用的方法、 必要的补充实验、 临床特点等 综合进行分析。 0012 3HCV RNA 的检测方法 0013 在 HCV 急性感染期， 在血浆或血清中的病毒基因组水平可达到 105 107 拷 贝 /ml。在 HCV 慢性感染者中， HCV RNA 水平在不。
17、同个体之间存在很大差异， 变化范围在 5104 5106 拷贝 /ml 之间， 但同一名患者的血液中 HCVRNA 水平相对稳定。 0014 HCV RNA 定性检测 ： 对抗 -HCV 阳性的 HCV 持续感染者， 需要通过 HCV RNA 定性试 验确证。HCV RNA 定性检测的特异度在 98以上， 只要一次病毒定性检测为阳性， 即可确证 HCV 感染， 但一次检测阴性并不能完全排除 HCV 感染， 应重复检查。 0015 HCV RNA定量检测 ： 定量聚合酶链反应(qPCR)、 分枝DNA(bDNA)、 实时荧光定量PCR 法均可检测 HCV RNA 病毒载量。国外 HCV RNA 。
18、定量检测试剂盒有 PCR 扩增的 Cobas V2.0、 SuperQuant、 LCx HCV RNA 定量分析法等， 但 bDNA 的 Versant HCVRNA 2.0 和 3.0 定量分析 法应用较为广泛。国内的实时荧光定量 PCR 法已获得国家食品药品监督管理局 (SFDA) 的 正式批准。不同 HCV RNA 定量检测法可用拷贝 /ml 和 IU/ml 两种表示方法， 两者之间进行 换算时， 应采用不同检测方法的换算公式， 如罗氏公司 Cobas V2.0 的 IU/ml 与美国国立遗 说 明 书 CN 102559930 A 4 3/9 页 5 传学研究所的 SuperQuan。
19、t 的拷贝数 /ml 换算公式是 ： IU/ml 0.854 拷贝数 /ml+0.538。 0016 HCV 病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性， 但可作为 抗病毒疗效评估的观察指标。在 HCV RNA 检测中， 应注意可能存在假阳性和假阴性结果。 0017 4 基因型芯片检测技术 0018 基因芯片是微电子学和分子生物学结合的高新技术 HCV 基因分型的检测型芯片 已逐步应用于临床。 其基本原理是 ： 用生物信息学方法设计HCV 5UTR型特异性探针。 按 设计模式， 以自动化微阵列点样于 APTES-PDC 修饰的玻璃表面。用商品 PCR 试剂盒掺入荧 光分子对患者血。
20、样本进行扩增， 用激光共聚焦荧光扫描仪检测并分析结果。 0019 目前全世界范围内对 HCV 已克隆到的分离株可分为 6 个基因型 (genotype)， 约 50 个亚型 (subtype)。HCV 基因型的检测对于研究 HCV 的流行病学、 变异趋势、 传播途径， 尤其 是对丙型肝炎患者判断病情、 指导治疗、 预测疗效及预后具有重要意义。 0020 综上所述， 随着免疫学和分子生物学的发展， HCV 诊断方法不但敏感性、 特异性、 重 复性不断提高， 而且操作日趋简便、 正朝着自动化、 标准化的方向发展。 多种方法相互渗透、 扬长补短、 结合应用， 是发展的另一趋势。 0021 实时荧光 。
21、PCR 技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术， 使用一种带有核 电偶联装置 (CCD) 的 PCR 扩增仪， 通过检测荧光信号的动态变化实时反映 PCR 的每个 循环的扩增水平。CCD 能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光， 收集检测 荧光信号， 并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法实时荧光 RT-PCR 技术 是实时荧光 PCR 的一种 (Yuqi Z， Min Y， Johann WM， et al.2002.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1Proviral DNA by Using TaqMa。
22、n Technology.J Cli Microbiol.40(2) ： 675-678 ； Drosten C， Seifried E， Roth WK， et al.2001， TaqMan 5_-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening.J Clin Microbiol， 39 ： 4302-4308 ； Schuurman R， Desca。
23、mps D， Weverling GJ， et al.1996， Multicenter comparison of three commercial methods for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma.J Clin Microbiol， 34 ： 3016-3022 ； Christopherson C， Kidane Y， Conway B et al.2000.PCR-based assay to quantify human immunodeficiency virus type。
24、 1 DNA in peripheral blood mononuclear cells.J Clin Microbiol， 38 ： 630-634.)， 它是一种直接快速检测 RNA 的方法， 与检测 DNA 的实时荧光 PCR 相比， 不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶， 同时多了一个逆转录反应步骤 ； 相 同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针， 探 针结构完整时， 荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团， 呈现淬灭效应。 如果扩增过 程中有靶序列的存在， 扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断， 荧光报告基团与淬灭基团 相互解离， 阻断了二者。
25、间荧光共振能量转移效应， 荧光报告基团发出荧光信号。 随着扩增的 进行， 荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。 0022 实时荧光定量法首先对 HCV 靶核酸 RNA 逆转录 (RT)， 然后对其产物 cDNA 进行 PCR 扩增。在 PCR 反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号实时监测整个 PCR 进程， 最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了 PCR 从半定量到定量的飞跃， 而且与常规 PCR 相比， 它具有特异性强、 自动化程度高、 有效解决了 PCR 污染问题等特点。 说 明 书 CN 102559930 A 5 4/9 页 6 0023 本试剂盒采用。
26、TaqMan荧光探针技术， 选取HCV基因组编码区的相对保守区为靶区 域， 设计特异性引物及荧光探针， 其中目的荧光探针 5 端标记荧光发射基团 FAM， 3 端标记 非荧光淬灭基团 BHQ1， 利用荧光 PCR 检测仪可在 FAM 通道检测荧光信号。同时设置了内标 质控系统， 用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。内标靶区域选取与 HCV 目标区域一 致， 并在探针位置人工合成了一段寡核苷酸， 设计特异性荧光探针， 与任何物种均无交叉反 应， 其中荧光探针 5 端标记荧光发射基团 HEX， 并与内标质粒共同组成内标质控体系， 可在 VIC 通道检测荧光。对于待检物而言， 若检测结果显示典型的。
27、 S 型荧光增长曲线， 则为阳性 标本， 反之则为阴性。通过简单易操作的核酸提取系统， 结合实时荧光 PCR 检测系统运行一 步法 RT-PCR 扩增程序， 本试剂盒实现了检测的高效率、 高灵敏和高特异。 发明内容 0024 本发明涉及一种荧光定量 RT-PCR 检测丙型肝炎病毒的试剂盒， 特别是涉及以一 步法实时荧光逆转录 - 聚合酶链反应 (RT-PCR) 技术快速、 定量检测丙型肝炎病毒感染的 试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性， 通过本发明的试剂盒实现对血清或血浆样 本中丙型肝炎病毒核酸 RNA 进行定量检测， 适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断和丙型肝 炎病毒感染者药物治疗的疗效。
28、监测。其基本原理是利用荧光 PCR 技术， 以 HCV 基因中相对 保守区为靶区域， 设计特异性引物及荧光探针， 在样本核酸纯化之后， 通过含有逆转录酶 (c-MMLV 酶 )、 热启动 Taq 酶、 RNA 酶抑制剂 (RNasin) 的一步法 RT-PCR 对 HCV RNA 进行快 速定量检测。同时， 试剂盒还带有内标物质， 用于对核酸提取的整个过程进行监控， 减少假 阴性结果的出现。 并检测荧光信号， 仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线， 根据阈循环值 (CT 值 ) 实现对未知样本的定量检测。 0025 为了实现本发明， 我们采用了以下技术方案 ： 0026 1) 使用适当的核酸分析。
29、软件分别对已知的 HCV 基因的核苷酸序列进行同源性比 较， 在找出同源区段的基础上， 进一步使用适当的引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物 和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于 HCV 基因的序列， 而且与其他病原体的核 苷酸序列没有同源性， 也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点， 所以避免了丙型肝炎 病毒检测的假阴性和假阳性， 提高了检测的可靠性和准确度。 同时设置了内标质控系统， 用 于整个反应体系的质量控制。内标靶区域选取与 HCV 目标区域一致， 并在探针位置人工合 成了一段寡核苷酸， 设计特异性荧光探针， 与任何物种均无交叉反应。 0027 2) 使用 DNA 合成装置合成所。
30、需的寡核苷酸引物和探针， 用分子筛和快速蛋白质液 相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。 同样合成所需的探针序列， 氨解处理后分别在其5 端标记作为荧光发生基团 ( 报告基团 ) 的 6-FAM amidite 和 HEX， 并在其 3 端标记借助活 性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的 BHQ1。以 FPLC 层析法纯化荧光标记的探针。 然后， 使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶 (20 ) 电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的 引物和探针。 0028 3)适宜于一步法RT-PCR扩增的反应体系。 反应体系包括逆转录酶、 热启动Taq酶、 2 - 脱氧核苷三磷酸、 RNA 酶抑制剂 (RNas。
31、in)、 能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的 正向引物、 能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、 能够与靶多聚核苷酸结 合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、 能够与内标核苷 说 明 书 CN 102559930 A 6 5/9 页 7 酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的检测内标的寡核苷酸探针、 含有镁离子的缓冲液。同时设置了内标质控系统， 用于整个核酸提取和反应体系的质量控 制。 0029 4) 从待测样本中提取核酸 RNA， 分别加入前述的反应体系中， 直接经一步法 RT-PCR 扩增， 从荧光扩增曲线对未知样本的核酸 RNA 进。
32、行定量检测。 0030 基于以上技术方案发明的试剂盒包括 ： (1) 核酸提取试剂、 HCV 反应液 A、 HCV 反应 液 B、 HCV 反应液 C、 HCV 内标溶液、 阴性质控品、 HCV 强阳性质控品、 HCV 临界阳性质控品、 HCV 阳性定量参考品 1-4， 和 (2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。 0031 根据本发明的一个优选实施方案， 其中 PCR 反应体系包括 HCV 反应液 A、 HCV 反应 液 B 和 HCV 反应液 C。 0032 根据本发明的另一个优选实施方案， 其中 HCV 反应液 A( 引物探针混合液 ) 由正 向引物、 反向引物、 目的寡核苷酸探针。
33、、 内标寡核苷酸探针组成， 其特征在于用于靶多核 苷酸扩增的正向和反向引物分别是 5 -CATGGCGTTAGTAYGAGTGTCG-3 (SEQ ID NO ： 1) 和 5 -TCCYGGCAATTCCGGTGTAC-3 (SEQ ID NO ： 2)。 0033 根据本发明的另一个优选实施方案， 其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的寡核苷 酸探针是 5 -X-TCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCG-Y-3 (SEQ ID NO ： 3)， 其中 X/Y 表示荧光标 记基团， 包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基 团的寡核苷酸探针。 0034 根据。
34、本发明的另一个优选实施方案， 其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的引物探 针浓度均为 5 15pmol/ 人份， 优选引物浓度为 10pmol/ 人份、 探针浓度为 5pmol/ 人份。 0035 根据本发明的另一个优选实施方案， 引物探针混合液中用于内标多核苷酸扩增的 寡核苷酸探针是 5 -X-TCCACGGCAACTCTAGTCGCCCTGC-Y-3 (SEQ ID NO ： 4)， 其中 X/Y 表示 荧光标记基团， 包括能够与内标多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧 光淬灭基团的寡核苷酸探针。 0036 根据本发明的另一个优选实施方案， 其特征还在于引物探针混合液中用于内标多。
35、 核苷酸扩增的探针浓度为 3 10pmol/ 人份， 优选探针浓度为 5pmol/ 人份。 0037 根据本发明的另一个优选实施方案， HCV 反应液 B 由逆转录酶 (c-MMLV 酶 )、 热启 动 Taq 酶、 RNasin、 dNTPs、 酶稀释液组成。 0038 根据本发明的另一个优选实施方案， 其特征还在于 c-MMLV 酶用量为 1.5 3.5U/ 人份、 热启动 Taq 酶用量为 3 7U/ 人份、 RNasin 用量为 15 25U/ 人份、 dNTPs 浓度为 0.20mmol/L， 酶稀释液为一般市售的酶稀释液。 0039 根据本发明的另一个优选实施方案， HCV 反应液。
36、 C 包括一步法 RT-PCR 反应缓冲 液和 DEPC 水， 其中一步法 RT-PCR 反应缓冲液包含 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、 50mmol/L KCl、 3.0mmol/LMgCl2。 0040 根据本发明的一个优选实施方案， 阴性质控品为阴性血浆， HCV 强阳性质控品 和 HCV 临界阳性质控品均为含有 HCV 目的片段的病毒样颗粒， 且浓度分别为 5.0106 和 5.0103IU/ml ； HCV 阳性定量参考品 1-4 均为含有 HCV 目的片段的重组质粒， 浓度为 1.0104-1.0107IU/ml ； 质粒和病毒样颗粒均由上下游引物扩增的 PCR。
37、 产物通过市售的 载体克隆构建而成， 所使用的上下游引物序列 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2。 说 明 书 CN 102559930 A 7 6/9 页 8 0041 根据本发明的另一个优选实施方案， 其中用于 PCR 扩增的最佳反应温度和时间 为 ： 50逆转录 15min， 1 个循环 ； 95 15min， 1 个循环 ； 最后 94 15s， 55 45s， 45 个循 环收集荧光信号。 0042 根据本发明的一个优选实施方案， 其中试剂盒的待检样品是血清或血浆等样品。 0043 本发明提供的一步法实时荧光 RT-PCR 试剂盒可以检测出丙型肝炎病毒的最低浓。
38、 度为 250IU/ml， 说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。 0044 本发明针对丙型肝炎病毒基因设计特异性引物和探针， 检测的线性范围为 1.0103IU/ml 1.0107IU/ml， 与感染部位相同或感染症状相似的其他病毒 ( 乙型肝 炎病毒、 人类免疫缺陷病毒、 EB 病毒、 人类疱疹病毒等 ) 无交叉反应。试剂盒的灵敏度为 99.47， 特异性为 98.89。 0045 本发明与现有技术相比， 具有以下优点 ： 0046 (1) 使用一步法 RT-PCR 对 HCV RNA 进行快速定量检测， 灵敏度， 特异性大大提高。 0047 (2)全封闭反应， 提取病毒核酸RNA以后， 直接用。
39、于RT-PCR检测， 避免了污染发生。 0048 (3) 试剂盒带有内标物质， 可以用于对核酸提取和 PCR 扩增的整个过程进行监控， 从而减少假阴性结果的出现。 附图说明 0049 图 1 显示 HCV 强阳性质控品、 HCV 临界阳性质控品、 阴性质控品和 HCV 阳性定量参 考品 1-4 的检测结果。HCV 强阳性质控品、 HCV 临界阳性质控品扩增曲线有 FAM 检测通路扩 增曲线有明显对数增长期， 呈典型 S 型扩增曲线， 且强阳性和临界阳性质控品的定值分别 在 1.0106-2.0107IU/ml 和 1.0103-5.0104IU/ml 范围内。 ； 可明确判定为阳性。阴 性质控。
40、品 FAM 检测通路扩增曲线无对数增长期， VIC 检测通路扩增曲线为对数增长期 ； 可明 确判定为阴性。HCV 阳性定量参考品 1-4FAM 检测通路扩增曲线有明显对数增长期， 呈典型 S 型曲线， CT 值 40， 且 R2 0.97， 均符合质量控制判断标准。 0050 图2显示HCV RNA特异性参考品的检测结果。 10份特异性参考品的扩增曲线平直 或斜向下且与基线无交叉， 没有 Ct 值， 可明确判定为阴性。10 选取正常人血清 (N) 和其他 血源性病原微生物， 包括乙型肝炎病毒 (HBV)， 人类免疫缺陷病毒 -1(HIV-1)， 丁型肝炎病 毒 (HDV)， 戊型肝炎病毒 (H。
41、EV)， EB 病毒 (EBV)， 人巨细胞病毒 (HCMV)， 梅毒螺旋体 (TP)， 单 纯疱疹病毒 1 型 (HSV-1)， 单纯疱疹病毒 2 型 (HSV-2)。 0051 图 3 显示灵敏度的检测结果。以企业参考品中的定量参考品 L4(1103IU/ml) 为基准， 用正常人血清或血浆进行递减稀释， 稀释的终浓度分别为 1000IU/ml、 500IU/ml、 250IU/ml、 100IU/ml、 50IU/ml。检测结果显示检出的 HCV 样本的最低浓度为 250IU/ml。 具体实施方式 0052 下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。 0053 实施例 1 ： 丙型肝炎病毒。
42、试剂盒的检测方法 0054 (1) 标本采集、 运送和保存 0055 标本采集 ： 0056 血清-用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升， 注入无菌的干燥玻璃管， 室 说 明 书 CN 102559930 A 8 7/9 页 9 温(2225)放置3060分钟， 血标本可自发完全凝集析出血清， 或直接使用水平离心 机， 1500rpm 离心 5 分钟 ； 吸取上层血清， 转移至 1.5ml 灭菌离心管。 0057 血浆 - 用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血 2 毫升， 注入含 EDTA-2Na( 乙二胺 四乙酸二钠 ) 或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管， 立即轻轻颠倒玻璃管混合 5 10 次， 。
43、使抗凝剂 与静脉血充分混匀， 5 10 分钟后即可分离出血浆， 转移至 1.5ml 灭菌离心管。 0058 标本保存和运送 ： 所采集的标本可立即用于测试， -20保存期为 3 个月 ； -70以 下长期保存， 应避免反复冻融。标本运送采用 0冰壶。 0059 (2) 核酸提取 0060 将待测样本与阴性质控品、 HCV 强阳性质控品、 HCV 临界阳性质控品进行同步处 理。 0061 a). 在 1.5ml 的无菌离心管内加入 50l 的蛋白酶 K ； 0062 b). 取样本 200l 加入离心管中 ； 0063 c). 再加入 200l 的裂解工作液 ( 即已含 Carrier RNA 。
44、的病毒裂解液 )， 盖紧管 盖， 漩涡振荡 15 秒以充分混匀， 高速离心 10 秒 ( 防止温育时产生气泡 )， 72 10 分钟。同 时可将洗脱液置于 72预热 ； 0064 d). 再加入 250l 无水乙醇， 盖紧管盖， 振荡 15 秒 ； 0065 e). 将混合液全部吸至离心柱， 室温下 12,000rpm 离心 1 分钟， 将离心柱装至新的 收集管 ； 0066 f).将500l的抑制物去除液加入离心柱， 室温下12,000rpm离心1分钟， 将离心 柱装至新的收集管 ； 0067 g).将500l的去离子液加入离心柱， 室温下12,000rpm离心1分钟， 将离心柱装 至新的收。
45、集管 ； 0068 h).再次将500l的去离子液加入离心柱， 室温下12,000rpm离心1分钟， 将离心 柱装至新的收集管 ； 0069 i). 将离心柱 - 收集管于室温下 14,000rpm 离心 3 分钟以除去残余的乙醇 ； 0070 j). 将离心柱取出， 放置于新的 1.5ml 离心管。打开离心柱盖子， 72放置 2 分钟 ( 使用干式恒温器， 不能使用水浴锅 ) ； 0071 k). 在离心柱的膜的正上方小心加入 72预热的洗脱液 50l， 盖紧离心柱管盖， 室温静置1分钟后， 14,000rpm离心1分钟。 离心管内即为病毒核酸溶液， 建议立即使用， 如 需保存， 置于 -2。
46、0。 0072 (3)PCR 检测 0073 a) 配制体系 0074 将 2l HCV 反应液 A， 3l HCV 反应液 B， 25l HCV 反应液 C 充分混合， 然后分 装 30l 至每个 PCR 反应管。 0075 b) 加样 0076 往上述 HCV 反应管中分别加入提取后的待测样本核酸、 阴性质控品、 HCV 强阳性质 控品、 HCV 临界阳性质控品和直接加入 HCV 阳性定量参考品 20l。盖紧管盖， 8,000rpm 离 心数秒后转移至 PCR 扩增仪。 0077 扩增程序设置 说 明 书 CN 102559930 A 9 8/9 页 10 0078 ABI7300/750。
47、0 荧光 PCR 扩增仪的参数设置如下 ： 0079 Reporter Dye1 ： FAM 0080 Quencher Dye ： none 0081 Reporter Dye2 ： VIC 0082 Quencher Dye ： none 0083 Passive Reference ： none 0084 LightCycler480 荧光 PCR 扩增仪的参数设置如下 ： 0085 “Customizes” 模块中选择 FAM(483-533) 和 VIC(523-568) 滤片组合， 0086 扩增温度参数统一设置如下 ： 0087 50 15 分钟 ； 0088 95 15 分钟 。
48、； 0089 45 个循环 (94 15 秒 55 45 秒 )， 荧光检测选择在 55 45 秒这一环节 ； 0090 保存文件， 运行。 0091 (4) 结果分析 0092 反应结束后自动保存结果， 根据分析后图像调节Baseline的Start值、 End值以及 Threshold 值 ( 用户可根据实际情况自行调整， Start 值可以在 3 15、 End 值可设在 5 20， 在 Log 图谱窗口设置 Threshold 的 Value 值， 使基线位于扩增曲线指数期， 调整阴性质 控品的扩增曲线平直或低于阈值线 )， 点击 Analysis 自动获得分析结果， 在 Report 界面察 看结果， 记录未知样本数值 (C)。 0093 (5) 结果判定 0094 如果 FAM 检测通道无对数增长期， 且在 VIC 检测通道有对数增长期， 则判样品的 HCV RNA 浓度小于检测灵敏度。 0095 如果 FAM 荧光信号增幅明显， 扩增曲线有明显对数增长期， 呈典型 S 型曲线， 且 Ct 值 45， 则按以下方法判断 ： 0096 若样品的 C 1.00E+003， 则该样品的 HCV RNA 浓度 1103IU/ml ； 0097 若样品的 1.00E+003 C 1.0。