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1、(10)申请公布号 CN 102539554 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102539554 A *CN102539554A* (21)申请号 201110426282.8 (22)申请日 2011.12.19 G01N 30/02(2006.01) (71)申请人 四川省中医药科学院 地址 610041 四川省成都市人民南路四段 51 号 (72)发明人 徐学民 杨红 吴燕 王笳 袁崇均 黄卫平 陈帅 罗森 (74)专利代理机构 成都虹桥专利事务所 51124 代理人 柯海军 武森涛 (54) 发明名称 胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法 (57) 摘要 本发明涉及胡芦巴。
2、皂苷 B 的纯度检测方法， 属于分析化学领域。本发明所解决的技术问题是 提供了一种胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法。本发 明胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法为 ： 采用高效液 相色谱法进行检测， 检测波长为 197 205nm， 所 用流动相为乙腈与磷酸溶液的混合溶液， 其中， 混 合溶液中的乙腈体积含量为7477， 磷酸溶液 中的磷酸浓度为 1.8 2.2wt。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法。
3、， 其特征在于 ： 采用高效液相色谱法进行检测， 检测波 长为 197 205nm， 所用流动相为乙腈与磷酸溶液的混合溶液， 其中， 混合溶液中的乙腈体 积含量为 74 77， 磷酸溶液中的磷酸浓度为 1.8 2.2wt。 2. 根据权利要求 1 所述的胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法， 其特征在于 ： 混合溶液中的 乙腈体积含量为 75.5。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法， 其特征在于 ： 磷酸溶液 中的磷酸浓度为 2wt。 4. 根据权利要求 1 3 任一项所述的胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法， 其特征在于 ： 检 测波长为 203nm。 5. 根据权。
4、利要求 1 4 任一项所述的胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法， 其特征在于 ： 高 效液相色谱法进行检测时所用的色谱柱的固定相为氨基键合相。 6. 根据权利要求 5 所述的胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法， 其特征在于 ： 检测时柱温为 28 32， 流动相流速为 0.5 1.5ml/min。 7. 根据权利要求 5 所述的胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法， 其特征在于 ： 检测时柱温为 30， 流动相流速为 1ml/min。 8. 根据权利要求 1 7 任一项所述的胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法， 其特征在于 ： 采 用流动相溶解样品， 进样浓度为 0.5 1.5mg/ml。 9. 根据权利要求 。
5、8 所述的胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法， 其特征在于 ： 进样浓度为 0.7 0.9mg/ml。 10. 根据权利要求 1 9 任一项所述的胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法， 其特征在于 ： 不用对照品溶液， 而直接采用面积归一化法计算胡芦巴皂苷 B 的含量 ； 或以用流动相稀释 50 200 倍样品溶液的溶液为对照品溶液， 根据样品溶液和对照品溶液的胡芦巴皂苷 B 的 峰面积， 计算胡芦巴皂苷 B 的含量。 权 利 要 求 书 CN 102539554 A 2 1/5 页 3 胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法 技术领域 0001 本发明涉及胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法， 属于分析化学领域。 。
6、背景技术 0002 胡芦巴为豆科植物胡芦巴 Trigonella foenum-graecum L. 的种子， 为中国药典 2000 年版收载品种。中医主要用于治疗肾虚腰酸、 阳痿、 寒疝偏坠、 胃寒痛以及寒湿脚气肿 痛乏力等。近年来国内外均有报道用原生药粉治疗糖尿病收到较好疗效。如中国医学论坛 报道 ： 每日服25g胡芦巴， 共服21天， 可明显降低病人的尿糖及血糖含量。 且正常人服100g 葡萄糖后， 再服 100g 胡芦巴， 可有效地防止血糖升高。国外文献报道 ： 将 10 例非胰岛素依 赖型糖尿病患者随机分为两组， 治疗组每天在食物中混入25克胡芦巴粉。 15天后两组进行 交叉互换。在。
7、每次研究过程结束时 ( 即第十五天 )， 进行静脉葡萄糖耐量试验。结果表明 ： 食物中有胡芦巴粉者能提高代谢清除率， 从而显著降低血糖水平， 并缩短其半衰期， 提高红 细胞胰岛素受体数。由此可见， 胡芦巴在临床上的疗效是肯定的。 0003 专利申请号为 03144071.1 的 “胡芦巴总皂苷提取物生产工艺” ， 该专利申请公开 了 “一种从植物胡芦巴中提取的胡芦巴提取物及其生产方法和在制备治疗糖尿病中对血糖 和血脂有调节作用药品中的应用” ， 所获的总皂苷提取物皂苷部份为已知的甲基原薯蓣皂 苷、 甲基原翠雀皂苷等共五个皂苷的混合物， 但是该申请中对于提取物的总皂苷的重量百 分比是如何定义的，。
8、 未作说明。如果没有用对照品， 此重量百分比是没有任何意义。因此， 制备对照品对于胡芦巴总皂苷提取物的生产工艺控制具有重要意义。胡芦巴皂苷 B 为总皂 苷中的主要成分 ( 含量为 8以上 ) 之一， 结构式如 (I) 所示， 如果能够分离纯化得到高纯 度的胡芦巴皂苷 B， 则可以作为胡芦巴总皂苷的对照品。因此， 有效检测胡芦巴皂苷 B 的纯 度， 也成为能否制得高纯度的胡芦巴皂苷 B 的关键因素之一。 0004 0005 (I) 发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是提供一种胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法。 说 明 书 CN 102539554 A 3 2/5 页 4 0007 本发明。
9、胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法为 ： 采用高效液相色谱法进行检测， 检测波 长为 197 205nm， 所用流动相为乙腈与磷酸溶液的混合溶液， 其中， 混合溶液中的乙腈体 积含量为 74 77， 磷酸溶液中的磷酸浓度为 1.8 2.2wt。 0008 其中， 为了使本发明方法的检测结果更准确， 上述方法的混合溶液中的乙腈体积 含量优选为 75.5。 0009 其中， 为了使本发明方法的检测结果更准确， 上述方法中所述的磷酸溶液中的磷 酸浓度优选为 2wt。 0010 其中， 为了使本发明方法的检测结果更准确， 上述方法中的检测波长优选为 203nm。 0011 其中， 本发明胡芦巴皂苷 B 的。
10、纯度检测方法， 其高效液相色谱法进行检测时所用 的色谱柱的固定相优选为氨基键合相。常规的氨基键合相色谱柱均适合， 如 ： Kromasil NH2 柱 (4.6mm250mm， 5m， 瑞典 )， Luna NH2柱 (4.6mm150mm， 5m， 美国 )。 0012 其中， 为了使本发明方法的检测结果更准确， 采用 Kromasil NH2柱进行检测的柱 温优选为 28 32， 流动相流速优选为 0.5 1.5ml/min。进一步的， 检测时柱温最优选 为 30， 流动相流速最优选为 1ml/min。 0013 其中， 本发明方法可以直接采用流动相溶解样品， 然后进样， 进样浓度以保证在。
11、设 备检测限范围内即可， 一般情况下， 进样浓度为 0.5 1.5mg/ml 即可。进样浓度优选为 0.7 0.9mg/ml。 0014 其中， 本发明方法检测时， 可以不用对照品溶液， 而直接采用面积归一化法计算胡 芦巴皂苷 B 的含量 ； 或以用流动相稀释 50 200 倍样品溶液的溶液为对照品溶液， 根据样 品溶液和对照品溶液的胡芦巴皂苷 B 的峰面积， 计算胡芦巴皂苷 B 的含量。 0015 其中， 本发明可以采用常规的高效液相色谱仪进行检测， 如 ： 安捷伦、 岛津等高效 液相色谱仪。 0016 本发明方法可以检测胡芦巴皂苷 B 的纯度， 检测速度较快， 结果准确， 方法步骤简 单，。
12、 便于操作。本发明为胡芦巴皂苷 B 的纯度检测提供了一种新的方法， 具有广阔的应用前 景。 附图说明 0017 图 1 是胡芦巴皂苷 B 的 UV 扫描图 ； 0018 图 2 是空白溶液的高效液相色谱图 ； 0019 图 3 是胡芦巴皂苷 B 粗品的高效液相色谱图 ； 0020 图 4 是纯化后的胡芦巴皂苷 B 的高效液相色谱图。 具体实施方式 0021 本发明胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法为 ： 采用高效液相色谱法进行检测， 检测波 长为 197 205nm， 所用流动相为乙腈与磷酸溶液的混合溶液， 其中， 混合溶液中的乙腈体 积含量为 74 77， 磷酸溶液中的磷酸浓度为 1.8 2.2。
13、wt。 0022 其中， 为了使本发明方法的检测结果更准确， 上述方法的混合溶液中的乙腈体积 含量优选为 75.5。 说 明 书 CN 102539554 A 4 3/5 页 5 0023 其中， 为了使本发明方法的检测结果更准确， 上述方法中所述的磷酸溶液中的磷 酸浓度优选为 2wt。 0024 其中， 为了使本发明方法的检测结果更准确， 上述方法中的检测波长优选为 203nm。 0025 其中， 本发明胡芦巴皂苷 B 的纯度检测方法， 其高效液相色谱法进行检测时所用 的色谱柱的固定相优选为氨基键合相。常规的氨基键合相色谱柱均适合， 如 ： Kromasil NH2 柱 (4.6mm250m。
14、m， 5m， 瑞典 )， Luna NH2柱 (4.6mm150mm， 5m， 美国 )。 0026 其中， 为了使本发明方法的检测结果更准确， 采用 Kromasil NH2柱进行检测的柱 温优选为 28 32， 流动相流速优选为 0.5 1.5ml/min。进一步的， 检测时柱温最优选 为 30， 流动相流速最优选为 1ml/min。 0027 其中， 本发明方法可以直接采用流动相溶解样品， 然后进样， 进样浓度以保证在设 备检测限范围内即可， 一般情况下， 进样浓度为 0.5 1.5mg/ml 即可。进样浓度优选为 0.7 0.9mg/ml。 0028 其中， 本发明方法检测时， 可以不。
15、用对照品溶液， 而直接采用面积归一化法计算胡 芦巴皂苷 B 的含量 ； 或以用流动相稀释 50 200 倍样品溶液的溶液为对照品溶液， 根据样 品溶液和对照品溶液的胡芦巴皂苷 B 的峰面积， 计算胡芦巴皂苷 B 的含量。 0029 其中， 本发明可以采用常规的高效液相色谱仪进行检测， 如 ： 安捷伦、 岛津等高效 液相色谱仪。 0030 其中， 胡芦巴皂苷 B 可以采用下述方法制备得到 ： 0031 1、 分离与纯化 ： 取胡芦巴总皂苷提取物浸膏 90g( 采用申请号为 200510020636.3 的方法制备得到)， 用1000ml温水(约40)溶解。 另取碱性氧化铝(100200目)， 用。
16、适 量蒸馏水调匀后上柱 (1206cm)， 平衡 6 小时后， 将前述皂苷水溶液上于柱顶， 通过此柱， 并继续用水洗涤， 直至洗脱液振摇无泡沫或取 1ml 加入 1ml 高氯酸不显红色为止。收集合 并洗脱液， 将其通过聚酰胺柱 (606cm)， 收集流出液， 将其通过已预处理好的 D101型大孔 树脂柱(606cm， 装600g树脂， 树脂用前分别用7NaOH乙醇液和10Hcl乙醇液浸泡过 夜， 尔后用清水洗涤至中性 )， 柱床用清水洗涤后用 80乙醇洗脱， 收集洗脱醇液至洗脱液 挥干后遇高氯酸不显色为止。 合并洗脱液， 回收溶剂， 得浸膏， 经60减压干燥， 得黄白色纯 总皂苷粉末约 12g。
17、。 0032 将此粉末用80mL蒸馏水溶解， 置于分液漏斗中， 用正丁醇振摇提取5次， 每次用正 丁醇100mL， 振摇5分钟， 收集正丁醇提取液， 减压回收正丁醇至干。 转至60烘箱中减压干 燥， 得黄白色皂苷粉末约10g。 将此粉末用适量甲醇溶解， 加入丙酮沉淀三次， 滤过， 干燥， 得 白色纯皂苷粉末约 8.5g。取此粉末， 用 15ml 甲醇加热溶解， 用 18g 硅胶 H 吸附， 挥去溶剂后 研细备用。另取硅胶 H 800g， 用氯仿 - 甲醇 - 水 (25 6 0.7) 湿法装柱 (1205.5cm)， 平衡 12 小时后将前述吸样硅胶 H 上于柱顶， 用不同比例的氯仿 - 甲醇。
18、 - 水梯度洗脱， 用薄 层层析监控洗脱物 ( 展开剂， 显色剂 )， 收集氯仿 - 甲醇 - 水 (25 12 2) 部分， 得到 皂苷 B 粗品约 3.3g。 0033 取此皂苷 B 粗品， 用 C18反相硅胶 ( 甲醇水 1 1 等度洗脱 ) 纯化， 溶液经 3 号 砂芯漏斗滤过， 收集滤液， 60减压干燥， 即得到纯白色胡芦巴皂苷 B 2.5g。 0034 下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述， 并不因此将本发明限 说 明 书 CN 102539554 A 5 4/5 页 6 制在所述的实施例范围之中。 0035 实施例 1 采用本发明方法测定胡芦巴皂苷 B 的含量 00。
19、36 1、 仪器及试剂 0037 高效液相色谱仪 ： 美国Agilent 1100系列， 四元泵， Agilent微量进样器， DAD检测 器， Agilent1100系列HPLC 3D Chemstation software工作站， CQX25-06超声波清洗器(上 海必能信超声有限公司 )， Sartorius 电子天平 BP 211D 型 ( 美国， 十万分之一 )， Kromasil NH2柱 (4.6mm250mm， 5m， 瑞典 )。胡芦巴皂苷 B 对照品 ( 四川省中医药科学院制备， )， 乙腈 ( 色谱纯， 美国 TEDIA)， 磷酸 (AR， 成都化学试剂厂 )， 重蒸馏水。
20、 ( 四川省中医药科学院 制备 )。 0038 2、 检测波长的确定 0039 取适量胡芦巴皂苷 B 对照品溶于水中， 在 DAD 检测器上进行扫描 (200nm-400nm)， 胡芦巴皂苷 B 对照品呈现末端 (197 205nm) 吸收， 由于皂苷的测定大都采用波长 202nm， 203nm 进行， 所以本法选取 203nm 作检测波长， 胡芦巴皂苷 B 的 UV 扫描图谱如图 1 所示。由 图 1 可知， 在波长 203nm 处， 胡芦巴皂苷 B 有较强的吸收。 0040 2、 杂质峰、 溶剂峰及主峰保留时间的确定 0041 色谱条件采用乙腈 ： 2磷酸-水系统(75.524.5)， 检。
21、测波长203nm， 柱温30， 流速 1ml /min。 0042 分别注入胡芦巴皂苷 B 溶液 ( 粗品， 采用本发明具体实施部分的方法制备 )、 空 白溶液 ( 流动相 )， 胡芦巴皂苷 B 的保留时间约为 9.6min 左右， 保留时间约为 5.7min 有 一杂质峰 ( 如图 3 所示 )， 空白溶液 ( 流动相 ) 在保留时间约为 2.5min 有溶剂峰 ( 如图 2 所示 )。胡芦巴皂苷 B 的峰对称因子为 0.99， 理论塔板数为 9808， 保留因子为 4.76， 根据 Agilent1100 系列 HPLC 3D Chemstation software 工作站峰纯度检查为一。
22、纯峰。 0043 按上述方法和同样的色谱条件， 取纯化后的胡芦巴皂苷 B( 采用本发明具体实施 部分的方法纯化 )， 结果如图 4 所示。从图 4 可知， 纯化后的胡芦巴皂苷 B 保留时间约为 9.6min 左右， 对比纯化前 5.7min 杂质峰已经基本消失 ( 见图 4)， 在保留时间约为 2.7， 3.0min 有两溶剂峰 ( 见图 4)。胡芦巴皂苷 B 的峰对称因子为 1.18， 理论塔板数为 10360， 根据 Agilent1100 系列 HPLC 3D Chemstation software 工作站峰纯度检查为一纯峰。 0044 3、 面积归一化法检测含量 0045 根据面积归。
23、一化法规定， 取胡芦巴皂苷 B( 采用本发明具体实施部分的方法纯化 所得 ) 约 4mg， 精密称定， 置于 5ml 容量瓶中， 用流动相溶液溶解。如不溶， 可放入超声波发 声器中超声振荡 5min， 再加入流动相溶液至刻度， 摇匀备用。分别吸取上述溶液各 10l， 注入液相色谱仪进行分析， 按面积归一化法计算含量， 结果为 98.59wt。 0046 试验例 1 胡芦巴皂苷 B 的 13CNMR 谱测定 0047 取胡芦巴皂苷 B( 采用本发明具体实施部分的方法纯化所得 ) 适量， 以氘代吡 啶作溶剂， TMS 为内标作 13CNM R 谱， 皂苷元 c 值 (ppm) ： 37.2(C 1。
24、)、 31.5(C2)、 78.5(C3)、 41.1(C4)、 140.6(C5)、 121.6(C6)、 32.1(C7)、 31.4(C8)、 50.1(C9)、 36.8(C10)、 20.5(C11)、 39.5(C12)、 40.2(C13)、 55.8(C14)、 32.0(C15)、 81.1(C16)、 62.5(C17)、 16.9(C18)、 19.2(C19)、 41.1(C20)、 13.4(C21)、 112.5(C22)、 31.4(C23)、 29.9(C24)、 30.3(C25)、 63.9(C26)、 16.9(C27) ； 0048 糖部份 c 值 (p。
25、pm) ： 说 明 书 CN 102539554 A 6 5/5 页 7 0049 第一糖 99.9(C1)、 73.4(C2)、 76.6(C3)、 74.9(C4)、 78.1(C5)、 61.5(C6)、 0050 第二糖 104.7(C1)、 72.2(C2)、 77.9(C3)、 74.8(C4)、 78.3(C5)、 61.1(C6)、 0051 第三糖 101.8(C1)、 72.5(C2)、 77.6(C3)、 73.5(C4)、 70.2(C5)、 18.2(C6)、 0052 末端糖 102.6(C1)、 72.4(C2)、 71.4(C3)、 73.7(C4)、 69.2(C5)、 18.4(C6)。 0053 从 51 个碳原子的 c 值 (ppm) 可以看出， 胡芦巴皂苷 B 的纯度较高， 本发明实施 例 1 的方法测定的结果较为准确。 说 明 书 CN 102539554 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102539554 A 8 2/2 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 102539554 A 9 。