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1、(10)申请公布号 CN 102411024 A (43)申请公布日 2012.04.11 CN 102411024 A *CN102411024A* (21)申请号 201110160549.3 (22)申请日 2011.06.15 G01N 27/447(2006.01) G01N 27/453(2006.01) G01N 21/64(2006.01) G01N 21/65(2006.01) (71)申请人 公安部第一研究所 地址 100048 北京市海淀区首都体育馆南路 1 号 （46 号分箱） 申请人 北京中盾安民分析技术有限公司 (72)发明人 李彬 张涛 贾二惠 陈学亮 赵怡鹤 (。
2、74)专利代理机构 北京中海智圣知识产权代理 有限公司 11282 代理人 曾永珠 (54) 发明名称 一种基于空间校正及光谱校正的毛细管阵列 电泳检测方法 (57) 摘要 本发明提供一种基于空间校正及光谱校正的 毛细管阵列电泳检测方法， 所述方法包括步骤 ： (1) 利用拉曼光谱定位毛细管阵列中各毛细管在 电荷耦合元件上的成像位置， (2) 通过光谱校正 对每根毛细管中的多色荧光染料进行解谱， (3) 对毛细管阵列电泳的 DNA 片断进行分析。本发明 采用激光激发毛细管石英或管中溶剂水的拉曼光 谱实现光谱成像， 实现了毛细管在 CCD 上的位置 定位和平行度调整 ； 采用荧光染料组合矩阵实现。
3、 单个毛细管中多色荧光染料的同时检测， 采用象 素组合的方式提高分布矩阵的稳定性， 减少计算 量， 提高检测的稳定性 ； 方法实现装置结构简单， 易操作。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 CN 102411032 A1/1 页 2 1. 一种基于空间校正及光谱校正的毛细管阵列电泳检测方法， 其特征在于， 所述方法 包括步骤 ： (1) 利用拉曼光谱定位毛细管阵列中各毛细管在电荷耦合元件上的成像位置， (2) 通过光谱校正对每根毛细管中的多色荧光染料进行解谱， (3) 对毛细管阵列电泳的 DNA。
4、 片断进行分析。 2. 按照权利要求 1 所述的基于空间校正及光谱校正的毛细管阵列电泳检测方法， 其特 征在于， 所述方法步骤(1)包括 ： A.用激光束照射毛细管束发出拉曼光， B.通过拉曼成像仪 成像在电荷耦合元件 CCD 上， C. 分析电荷耦合元件 CCD 上的光谱图对毛细管束中各毛细管 进行定位。 3. 按照权利要求 2 所述的基于空间校正及光谱校正的毛细管阵列电泳检测方法， 其特 征在于， 所述激光束照射毛细管束内的溶剂水散射发出拉曼光， 所用激光束为双激光束， 所 述双激光束的波长分别为 488nm 和 514.5nm。 4. 按照权利要求 2 所述的基于空间校正及光谱校正的毛细。
5、管阵列电泳检测方法， 其特 征在于， 所述方法步骤 C. 中以像素数为横轴， 光谱强度为纵轴得到空间校正谱图， 通过峰 识别得到每根毛细管中心位置和每根毛细管之间的有效宽度。 5. 按照权利要求 1 所述的基于空间校正及光谱校正的毛细管阵列电泳检测方法， 其特 征在于， 所述方法步骤 (2)， 用激光束照射毛细管， 毛细管中荧光染料被激发产生荧光光谱， 所述荧光光谱经过成像装置成像在电荷耦合元件面阵 CCD 上， 将所用 n 种荧光标记物分别 在所述面阵 CCD 上成像， 得到 n 种荧光在所述 CCD 上的光谱分布， 将每种荧光落在象素为 mp 面阵 CCD 每个象素上的荧光强记录下来， 得。
6、到 mn 的矩阵 P， 对矩阵 P 进行归一得到 矩阵 Q (Qij)mn， 通过 Q 矩阵对所用荧光在 CCD 上的成像组合进行光谱解谱， 其中 ： n、 m、 p 均为自然数。 6. 按照权利要求 1 所述的基于空间校正及光谱校正的毛细管阵列电泳检测方法， 其特 征在于， 所述荧光光谱经过成像装置成像在线阵 CCD 上。 7. 按照权利要求 1 所述的基于空间校正及光谱校正的毛细管阵列电泳检测方法， 其特 征在于， 所述方法步骤(3)对所述电荷耦合元件CCD上获得的每一帧光谱数据， 通过空间校 正， 区分出每根毛细管对应的光谱数据， 对每一根毛细管中的光谱数据， 通过光谱校正矩阵 解谱得到。
7、每种染料的光谱数据及每种荧光独立的位置分布， 对连续多帧光谱数据进行处理 获得 DNA 片断信息。 权 利 要 求 书 CN 102411024 A CN 102411032 A1/5 页 3 一种基于空间校正及光谱校正的毛细管阵列电泳检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种毛细管阵列电泳检测方法， 属于高通量微量分析技术领域。 背景技术 0002 DNA 测序是现代分子生物研究中的重要技术， 而电泳技术是 DNA 测序中必不可少 的技术手段。由于毛细管具有良好的散热效能， 允许在毛细管两端加上高至 30kV 的电压， 分离毛细管的纵向电场强度可达到 400V/cm 以上， 因而分离操作可。
8、以在很短的时间内完 成， 达到非常高的分离效率 ( 理论塔板数达到 400000/m 以上， 最高达 107/m 数量级 )。因 为毛细管的内径很小 ( 一般 100m)， 对内径 50m， 长度为 50cm 的毛细管， 其容积不足 1L， 进样体积在nL级， 样品浓度可低于104mol/L。 毛细管电泳技术达到了仪器分析所 要求的高效， 快速， 样品用量少等最基本和最优异的特点。此外， 毛细管电泳技术还有容易 自动化， 操作简便， 容剂消耗少， 环境污染小等优点。毛细管电泳技术应用首先集中在氨基 酸， 糖类， 核酸和蛋白质等生物分子的分离分析上， 随着此项技术的不断发展和完善， 其应 用已逐。
9、渐的向医药卫生， 食品化工， 环境等领域渗透。毛细管电泳技术还应用于 DNA 的高速 测序， 蛋白质的高效分离， 糖类分析， 细胞分析， 手性拆分， 物理化学常数的测定， 生产工程 控制等。 0003 为了提高毛细管检测的通量， 毛细管阵列作为高通量电泳分析手段被广泛应用于 生物化学分析中。在医疗、 化学化工、 生物制药、 法医分析等领域广泛应用毛细管阵列进行 微量试剂的定性和定量分析。毛细管阵列可以同时实现批量试剂的分析。但由于毛细管 之间的位置关系存在不确定性， 使得毛细管阵列进行微量试剂的定性和定量分析时存在误 差。 另外对于单个毛细管中多色荧光染料的同时检测， 由于荧光标记物的荧光谱带。
10、比较宽， 造成不同荧光光谱之间的很大重叠， 通过普通的分光很难将它们很好的区分开， 这也造成 了毛细管电泳分析的很大误差。目前尚没有消除这些误差的成熟技术。 发明内容 0004 有鉴于此， 为了克服现有技术的不足， 本发明提供一种能够准确矫正每个毛细管 在毛细管阵列中位置并能准确识别各荧光标记物特异性的毛细管阵列电泳检测方法， 极大 提高毛细管检测的精确度。 0005 本发明提供一种基于空间校正及光谱校正的毛细管阵列电泳检测方法， 所述方法 包括步骤 ： (1) 利用拉曼光谱定位毛细管阵列中各毛细管在电荷耦合元件上的成像位置， (2) 通过光谱校正对每根毛细管中的多色荧光染料进行解谱， (3)。
11、 对毛细管阵列电泳的 DNA 片断进行分析。 0006 进一步， 所述方法步骤(1)包括 ： A.用激光束照射毛细管束发出拉曼光， B.通过拉 曼成像仪成像在电荷耦合元件 CCD 上， C. 分析电荷耦合元件 CCD 上的光谱图对毛细管束中 各毛细管进行定位。 0007 进一步， 所述激光束照射毛细管束内的溶剂水散射发出拉曼光， 所用激光束为双 说 明 书 CN 102411024 A CN 102411032 A2/5 页 4 激光束， 所述双激光束的波长分别为 488nm 和 514.5nm。 0008 进一步， 所述方法步骤 C. 中以像素数为横轴， 光谱强度为纵轴得到空间校正谱 图， 。
12、通过峰识别得到每根毛细管中心位置和每根毛细管之间的有效宽度。 0009 进一步， 所述方法步骤 (2)， 用激光束照射毛细管， 毛细管中荧光染料被激发产生 荧光光谱， 所述荧光光谱经过成像装置成像在电荷耦合元件面阵CCD上， 将所用n种荧光标 记物分别在所述面阵 CCD 上成像， 得到 n 种荧光在所述 CCD 上的光谱分布， 将每种荧光落在 象素为 mp 面阵 CCD 每个象素上的荧光强记录下来， 得到 mn 的矩阵 P， 对矩阵 P 进行归 一得到矩阵 Q (Qij)mn， 通过 Q 矩阵对所用荧光在 CCD 上的成像组合进行光谱解谱， 其中 ： n、 m、 p 均为自然数。 0010 进。
13、一步， 所述荧光光谱经过成像装置成像在线阵 CCD 上。 0011 进一步， 所述方法步骤(3)对所述电荷耦合元件CCD上获得的每一帧光谱数据， 通 过空间校正， 区分出每根毛细管对应的光谱数据， 对每一根毛细管中的光谱数据， 通过光谱 校正矩阵解谱得到每种染料的光谱数据及每种荧光独立的位置分布， 对连续多帧光谱数据 进行处理获得 DNA 片断信息。 0012 本发明方法的实现分三步。第一步通过空间校正实现毛细管阵列的位置识别 ； 第 二步通过光谱校正实现对一根毛细管中的多色荧光染料进行解谱 ； 第三步进行 DNA 片断分 析。 0013 1. 空间校正 0014 空间校正的目的是为了给出每根。
14、毛细管在 CCD 上的成像位置。采用凝胶中水散射 激光发生拉曼散射， 测量散射光在 CCD 上的成像来确定每根毛细管的位置。用激光照在毛 细管上， 激光被毛细管凝胶中的水散射， 发出拉曼光， 通过取光狭缝， 光栅分光， 透镜聚焦后 成像在 CCD 上， 分析 CCD 上的光谱图确定毛细管位置分布。 0015 空间校正采用双激光束， 分别为 488nm 和 514.5nm。水的特征拉曼峰位于 3400cm-1 处。对于 488nm(20491.8cm-1)， 水散射的拉曼特征峰位于 17091.8cm-1， 对应的波长为 585nm。对于 514.5nm(19436.3cm-1)， 水散射的拉曼。
15、特征峰位于 16036.3cm-1， 对应的波长为 623.6nm。其谱主要分布在 2800cm-1到 3800cm-1波数之间。 0016 488nm 和 514.5nm 激光被水散射的特征拉曼峰投影到数据采集 CCD 上可以得到 图 3。蓝光 ( 左侧 ) 是采集 488nm 激光被水散射的拉曼光强度， 红光 ( 右侧 ) 对应的是采 集 514.5nm 激光被水散射的拉曼荧光强度， 每一个峰对应一根毛细管， 采用相邻毛细管间 隔采集不同波长激光被散射的拉曼光的特点， 即单数毛细管采集 488nm 激光器激发的拉曼 光， 双数毛细管采集 514.5nm 激光器激发的拉曼光， 反之亦可。从图。
16、中我们可以看到， 488nm 和 514.5nm 激光被水散射的拉曼峰恰好能够分开， 且正好分布在 CCD 检测范围之内 ： 500 660nm。这恰好符合了空间校正中采集两组数据进行校正的需求。图 4 给出了空间校正 CCD 上的一帧光谱图， 从图 4 上可以明显看到每根毛细管上对应两个亮点 ( 拉曼峰值 )。 0017 对图 4 进行横轴数据求和作为光谱强度， 以纵轴象素为横坐标作图给出空间校正 谱图如图 5 所示。通过简单的峰识别可以给出每根毛细管中心位置 ( 如图 6 所示 ) 和有效 宽度 ( 一般左右各取一个或两个象素 )。 0018 2、 光谱校正 0019 为实现对检测信号的特。
17、异性分析， 必需进行校正处理， 最通用的技术方法是建立 说 明 书 CN 102411024 A CN 102411032 A3/5 页 5 颜料组合荧光信号矩阵， 用于数据分析时信号强度的校正。对荧光的光强信息没有太苛刻 的要求， 只要得到荧光准确的位置和时间信号就可以获得所期望的实验结果。但是一般荧 光标记物的荧光谱带比较宽， 这造成不同荧光光谱之间的重叠成分很大， 通过普通的分光 很难将它们很好的区分开。如果采用把光谱展得很宽以获得较高的分辨能力的方法， 会使 荧光强度严重下降， 探测灵敏度和信噪比就成为了难题。 针对这类探测方法的特殊性， 我们 在进行荧光探测前要对所使用的已知荧光染料。
18、进行光谱校正， 即要得到激光激发的每种所 用标记荧光光谱在 CCD 上单独成像， 根据成像得到荧光光谱的分布矩阵， 对矩阵归一后就 可以用归一矩阵对探测的荧光谱进行解谱以得到所要的荧光谱图。 0020 荧光光谱带较宽且强度很弱， 用面阵 CCD 很难让荧光成像很好的区分开， 如果把 光谱展得很宽以获得较高分辨能力， 荧光的强度会严重减弱， 信号的灵敏度和信噪比会下 降。如果光谱展开的比较窄， 荧光比较强， 则荧光光谱重叠就会加剧， 甚至无法判读光谱峰 位， 解谱成为难题。为了兼顾以上两个方面， 一般仪器都采用了光电倍增管来代替 CCD。这 就要同时采用多个光电倍增管， 使得分光系统变得很复杂。。
19、针对荧光信号灵敏度和光谱解 谱两个相互制约的难题， 本发明采用激光激发荧光光谱， 并对荧光光谱进行光谱校正的方 法进行 CCD 信号处理。采用该方法无需太多关注光谱的展宽程度， 只要所用荧光光谱形状 不完全重合， 强度分布不同， 就可以通过光谱校正得到各种荧光的相对强度， 同时把 CCD 上 所有的感光信号都有效利用起来， 从而增加 CCD 的灵敏度， 提高荧光信号的信噪比。 0021 用光谱校正对面阵 CCD 上荧光信号进行解谱的步骤如下。 0022 首先我们要知道所用荧光标记物有几种， 设定为 n 种。我们让 n 种标记荧光分别 在面阵 CCD 上成像， 得到这 n 种荧光在 CCD 上的。
20、光谱分布。面阵 CCD 象素为 mp。把每种 荧光落在 CCD 每个象素上的荧光强记录下来， 得到一个 mn 的矩阵 P。由于每种标记物被 激发的荧光强度差别很大， 为了后期进行信号处理的方便， 对矩阵P进行归一得到矩阵Q (Qij)mn。 0023 通过 Q 矩阵我们就可以对所用荧光在 CCD 上的成像组合进行光谱解谱了。如某时 刻从 CCD 各个象素上采的荧光光强分布为一 m1 矩阵 B， 每种荧光的相对强度是一个 n1 矩阵 X， 则 ： QX B。进行矩阵变换得到 X (QTQ)-1(QTB)。从上式可以得知， 当我们得到了 光谱校正矩阵 Q 后， 只要得到任意时刻荧光落在面阵 CCD。
21、 上各个象素的强度分布矩阵 B， 就 可以通过光谱校正得到各种荧光的相对强度分布， 从而得到所用荧光的光谱信息。在下面 的实验中可以看出， 即使 CCD 上的荧光光谱重叠非常严重， 甚至无法判读出峰位， 也可以通 过这种方法得到很好的荧光谱图。 0024 3、 DNA 片段分析 0025 进行 DNA 片断分析时， 对获得 CCD 上的每一帧光谱数据， 首先通过空间校正， 区分 出每根毛细管对应的光谱数据。对每一根毛细管中的光谱数据， 通过光谱校正矩阵解谱得 到每种染料的光谱数据。原来分布杂散的光谱分光后得到每种荧光独立的位置分布， 分布 位置对应光谱波长。对连续多帧光谱数据进行处理获得 DN。
22、A 片断信息。 0026 本发明的有益效果 0027 (1) 采用激光激发石英或水的拉曼光谱实现光谱成像 ； 0028 (2) 可采用单一或多激光器激发 ； 0029 (3) 实现毛细管在 CCD 上的位置定位和平行度调整 ； 说 明 书 CN 102411024 A CN 102411032 A4/5 页 6 0030 (4) 采用荧光染料组合矩阵实现单个毛细管中多色荧光染料的同时检测 ； 0031 (5) 可以回收荧光染料分散在线阵 CCD 上所有象素上的有效光， 光谱利用率高 ； 0032 (6) 可以采用象素组合的方式提高分布矩阵的稳定性， 减少计算量， 提高检测的稳 定性 ； 003。
23、3 (7) 可以应用与线阵 CCD 检测实现单根毛细管的荧光检测， 也可以应用于 面 CCD 上实现毛细管阵列的荧光分光处理 ； 0034 (8) 方法实现装置结构简单， 易操作。 附图说明 0035 图 1 是空间校正方法实现示意图 ； 0036 图 2 为水的拉曼光谱图 ： 是水散射的特征拉曼峰 ； 0037 图 3 为水的拉曼光谱图 ： 488nm 和 514.5nm 激光被水散射的特征拉曼峰投影到数 据采集 CCD 上 ； 0038 图 4 为毛细管阵列拉曼光在 CCD 上的成像图 ； 0039 图 5 为空间位置定位分析示意图 ： 横轴为象素数， 纵轴为光谱强度作图 ； 0040 图。
24、 6 空间定位分析数据 ； 0041 图 7 是光谱校正方法实现示意图 ； 0042 其中 ： 1-激光束， 2-毛细管阵列， 3-单根毛细管， 4-拉曼光， 5-拉曼光谱成像CCD， 6- 荧光染料。 具体实施方式 0043 现结合附图及实施例对本发明方法作进一步详细说明。 0044 本发明方法的实现分三步 ： 第一步通过空间校正实现毛细管阵列的位置识别 ； 第 二步通过光谱校正实现对一根毛细管中的多色荧光染料进行解谱 ； 第三步进行 DNA 片断分 析。 0045 参考图 1， 用激光束 1 照在毛细管束 2 的检测窗口处， 激光被单根毛细管 3 的石英 或管内溶液中的水散射， 发出拉曼光。
25、 4， 通过取光狭缝， 光栅分光， 透镜聚焦后成像在 CCD 5 上， 分析 CCD 5 上的光谱图对毛细管束进行位置定位。 0046 参考图 7， 当荧光染料 6 通过毛细管 3 的检测窗口时被激光束 1 激发， 荧光光谱经 过成像装置成像在线阵 CCD5 上。 0047 1、 空间校正 0048 空间校正的目的是为了给出每根毛细管在 CCD 上的成像位置。采用凝胶中水散射 激光发生拉曼散射， 测量散射光在 CCD 上的成像来确定每根毛细管的位 置。用激光照在毛 细管上， 激光被毛细管凝胶中的水散射， 发出拉曼光， 通过取光狭缝， 光栅分光， 透镜聚焦后 成像在 CCD 上， 分析 CCD 。
26、上的光谱图确定毛细管位置分布。 0049 2、 光谱校正 0050 用光谱校正对面阵 CCD 上荧光信号进行解谱的步骤如下。 0051 首先我们要知道所用荧光标记物有几种， 设定为 n 种。我们让 n 种标记荧光分别 在面阵 CCD 上成像， 得到这 n 种荧光在 CCD 上的光谱分布。为了数据处理方便， 我们把整个 说 明 书 CN 102411024 A CN 102411032 A5/5 页 7 面阵 CCD 分成若干个小块 ( 如每 14 象素 3 象素为一块 )， 标记为 bin， 假定总共用到 m 个 bin， 一般 m 4n。这里解释一下为什么要把 CCD 上的象素做 bin 处。
27、理 ： 如果用光谱校正对 面阵 CCD 上荧光信号进行解谱的步骤如下。 0052 首先我们要知道所用荧光标记物有几种， 设定为 n 种。我们让 n 种标记荧光分别 在面阵 CCD 上成像， 得到这 n 种荧光在 CCD 上的光谱分布。为了数据处理方便， 我们把整个 面阵 CCD 分成若干个小块 ( 如每 14 象素 3 象素为一块 )， 标记为 bin， 假定总共用到 m 个 bin， 一般 m 4n。这里解释一下为什么要把 CCD 上的象素做 bin 处理 ： 如果 0053 以 CCD 上的象素为测量单位， 建立起来的矩阵会稳定性很差， 抗干扰能力弱， 微小 的扰动就可能带来不可预知的结果。
28、 ； 当然如果 bin 选择的太大， 矩阵的稳定性会很好， 但是 分光效果会比较差。故一般选择在 20bin 左右， 并通过转换矩阵的条件数来衡量矩阵的抗 干扰能力。把每种荧光落在 CCD 每个 bin 上的荧光强记录下来， 得到一个 mn 的矩阵 P。 由于每种标记物被激发的荧光强度差别很大， 为了后期进行信号处理的方便， 对矩阵 P 进 行归一得到矩阵 Q (Qij)mn。 0054 通过 Q 矩阵我们就可以对所用荧光在 CCD 上的成像组合进行光谱解谱了。如某时 刻从 CCD 各个 bin 上采的荧光光强分布为一 m1 矩阵 B， 每种荧光的相对强度是一个 n1 矩阵 X， 则 ： QX。
29、 B。进行矩阵变换得到 X (QTQ)-1(QTB)。从上式可以得知， 当我们得到了 光谱校正矩阵Q后， 只要得到任意时刻荧光落在 面阵CCD上各个bin的强度分布矩阵B， 就 可以通过光谱校正得到各种荧光的相对强度分布， 从而得到所用荧光的光谱信息。在下面 的实验中可以看出， 即使 CCD 上的荧光光谱重叠非常严重， 甚至无法判读出峰位， 也可以通 过这种方法得到很好的荧光谱图。 0055 3、 DNA 片段分析 0056 进行 DNA 片断分析时， 对获得 CCD 上的每一帧光谱数据， 首先通过空间校正， 区分 出每根毛细管对应的光谱数据。对每一根毛细管中的光谱数据， 通过光谱校正矩阵解谱。
30、得 到每种染料的光谱数据。原来分布杂散的光谱分光后得到每种荧光独立的位置分布， 分布 位置对应光谱波长。对连续多帧光谱数据进行处理获得 DNA 片断信息。 0057 尽管通过参照发明的某些优选实施例， 已经对发明进行了描述， 但本领域的普通 技术人员应当理解， 可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利 要求书所限定的本发明的精神和范围。 说 明 书 CN 102411024 A CN 102411032 A1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102411024 A CN 102411032 A2/2 页 9 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102411024 A 。