酶固定化的疏水性载体的制备及天门冬氨酸酶的固定化.pdf

本发明属于生物工程中酶固定化载体的开发及应用技术。
    固定化酶的研究从六十年代后期急速地发展起来，到目前为止，已有很多报导，酶的固定化方法（其中包括吸附法、共价偶联法及包埋法等）及固定化载体也非常多。就吸附法来说，主要是采用离子交换吸附，而疏水性吸附法是近十年来发展起来的，进展一直较慢。众所周知，在水溶液（极性溶液）中，非共价的极性键（即通过离子的，静电吸引，偶极相互作用及氢键等，是相当弱的，因为较强的电荷剂化作用和水的氢键能力，因此人们认为非极性力（疏水力）可能是最重要的提供水溶液介质中生物大分子内相互作用的主要力的唯一因素，对于一个分子量较大的蛋白质核酸等生物大分子来说，疏水效应是保持这些生物大分子的空间结构和生物功能的重要作用力之一。例如：在酶和底物的相互作用上，对于催化含疏水性基团的底物酶，其活性中心往往含有一个疏水性口袋，以与底物形成疏水作用，增加底物的亲和力，在抗原抗体相互作用上，疏水相互作用是稳定抗原抗体复合物的重要力，代谢物和药物等与受体的结合也常常涉及到疏水性相互作用，疏水力对于生物膜结构及蛋白质与核酸复合物的形成更是重要的。有许多蛋白质并不是游离于细胞内，而是以疏水力吸附于细胞膜上，因此，这些蛋白质在细胞破碎后，稳定性较差，而且在分离纯化过程中活性易于损失，基于以上原因，人们建立了疏水层析用于生物大分子的分离和纯化，成为一种新型地分离技术，在此基础上，人们发展了一类新的吸附剂-疏水性吸附剂用于酶的固化，但由于需要在固相载体上连接手臂和配基（疏水性基团）技术，此方法与其它方法相比在应用上相当有限，人们采用了几种方法制成了疏水性固相载体，1973年B.H.Hotstee等人开始将各种烷基连接到多糖载体上，并用于吸附酶，1975年Visser，I、等人用琼脂糖N-烷基衍生物吸附了黄嘌呤氧化酶等，1975年L.G.Bnttes等人把苯氧基乙酰基等脂肪族及芳香族化合物通过脂酰键连接到纤维素上，通过疏水性吸附实现了酶分子及亚细胞的固定化，1981年Tosa，T.等人把蛋白质沉淀剂丹宁连接到固相载体上，用于酶的固定化，1982年Peter，Cashien等人将三苯甲基连接到琼脂糖上固定化了碱性磷酸化酶等，1986年Yamanak，H.等人用β-萘基疏水布固定化天门冬氨酸酶，半衰期可达40周。近年来人们越来越重视蛋白质与疏水基团相互作用问题，正在进行疏水性相互作用的物理化学性质的研究，我们相信在不久将来，疏水吸附法随着疏水相互作用机制的研究其在酶固定化上的应用将具有极高的价值。

    从以上用于酶固定化的疏水性载体的制备上看，许多方法都很复杂，而且有时连接键不稳定，因此在应用上很受限制，而本发明的目的在于开发一种廉价的，高效的、方法简便的酶固定化载体。

    我们在制备疏水性固定化酶载体所用原料是琼脂、均三嗪及各种胺类化合物，用双相成珠法合成琼脂珠，珠的大小可以控制，它比用机械搅拌器破碎得到的琼脂珠强度好，均匀，表面光滑，通透性好，用均三嗪将琼脂活化，在1～2分钟内即可完成，用丙酮洗去未反应的均三嗪后，加入胺类，室温搅拌4小时，即N-芳香基（烷基）琼脂，本法合成的疏水性载体方法简单，可以连接很多种疏水配基，可以选择配基的链长短及疏水性，用于各种酶的固定化。反应如下：

    R：芳香基或烷基

    合成方法实例如下：

    1、琼脂珠的合成：

    将7g琼脂在加热下溶于100ml水中，冷却至55℃，同时将200ml豆油加热至55℃，然后将7%的琼脂溶液倒入豆油内，控制搅拌速度使琼脂溶液成细珠分布在豆油内，珠的大小可控制在40～60目之间，用冰水浴冷却，继续搅拌，至琼脂固化成珠，静止，倾去上层豆油，加入水后，琼脂珠进入水相，倾去上层豆油，水洗，筛分，收集40～60目琼脂珠。

    2、三聚氯氰活化琼脂：

    将100g琼脂珠用0.2NNaOH洗涤两次，然后加120ml丙酮，用磁力搅拌器搅拌，再将4g均三嗪用40ml丙酮，20ml二氧六环溶液，倒入琼脂中，一分钟后pH由碱性下降至中性，加入25%乙酸终止反应，吸滤，用丙酮洗去未反应的均三嗪。

    3、疏水性琼脂珠载体的制备。

    将100g活化的琼脂，加80ml丙酮，20ml苯胺，搅拌4小时，用丙酮洗3～5次，用水洗3～5次，即得疏水性载体。

    4、天门冬氨酸酶的固定化

    称取2g载体，加入含20mg左右蛋白的酶液，及pH7.0，0.1M磷酸缓冲液（含0.1MKCl），整个体系4ml，在0～4℃下振荡4小时，吸滤，得固定化天门冬氨酸酶。

    我们选用苯胺型载体用于固定化天门冬氨酸酶，每克湿载体可吸附10～18mg酶蛋白，酶活力保持80～90%左右，操作反应两个月活力保持70%多。

    用于糖化酶的固定化，每克湿载体可吸附17mg酶蛋白，酶活力保持40～50%左右。

    我们发现对于不同的酶可以选用各种不同的疏水基团，从而达到最佳使用效果。