解脲支原体抗体唾液快速检测试纸条 【技术领域】
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种解脲支原体抗体唾液快速检测试纸条。
背景技术
解脲支原体(M.urealyticum)为脲原体属中唯一的一个种，因生长需要尿素而得名。菌落微小，直径仅有15～25um，须在低倍显微镜下观察，故旧称T株(tiny strain)。菌落表面有粗糙颗粒，在合适条件下可转成典型的荷包蛋样菌落。生长需要胆固醇和尿素，分解尿素为其代谢特征，产生氨氮，使培养基pH上升，患者小便往往带有腥臊味。
解脲支原体与女性生殖健康关系最为密切，解脲支原体可引起泌尿生殖道感染，并被认为是非淋球菌性尿道炎中仅次于衣原体(占50％)的重要病原体。由于80％孕妇的生殖道内带有解脲支原体，因此可通过胎盘感染胎儿而导致早产、死胎，或在分娩时感染新生儿，引起呼吸道感染。此外，解脲支原体还可引起不孕症。
解脲支原体感染主要通过性生活传播，多见于年轻性旺盛时期，尤多见于不洁性交后。当泌尿生殖道发生炎症，粘膜表面受损时解脲支原体易从破损口侵入，引起泌尿生殖道感染。解脲支原体感染后，患者大多无明显症状，因此，很难被患者觉察，也易造成医生漏诊。解脲支原体可侵犯脲道、宫颈及前庭大腺，引起脲道炎、宫颈炎与前庭大腺炎；上行感染时，可引起子宫内膜炎、盆腔炎、输卵管炎，尤其输卵管炎多见。解脲支原体感染造成的女性生殖器官病理性改变，是不孕不育的重要原因。
国内外资料提示，不孕症夫妇的宫颈粘液、精液中解脲支原体培养阳性率高达50％以上，由此可见，解脲支原体感染与不孕症的发生有相关关系。解脲支原体感染造成不良的另一个原因是流产，有人从流产的组织中检查出解脲支原体的阳性率高达40％以上。因此，对不明原因的流产，尤其是多次流产者，应考虑有解脲支原体感染的可能。解脲支原体感染造成的不完全梗阻的输卵管炎性粘连，可使管腔狭窄，通而不畅，还是发生宫外孕的重要原因。
目前，检测上述传染病最常用的方法是免疫检测，此方法以抗原-抗体的特异性识别为基础，包括传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)和近来兴起的胶体金法两种。胶体金法分为免疫层析和免疫渗滤两种方式，其中以免疫层析法最为方便、快捷。
免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，已得到较为广泛的应用，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试纸条的硝酸纤维素膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含有相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在硝酸纤维素膜上层析，再被包被的抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测线(T线)，通过检测线的有无实现对结果的判定。但现有的试纸条大多以血液为样品，不适合现场检测和自检，检测成本较高。
【发明内容】
本发明提供了一种解脲支原体抗体唾液快速检测试纸条，该试纸条可以用唾液作为样品，解决了现有试纸条不适合现场检测，检测成本较高的问题。
一种解脲支原体抗体唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的可与解脲支原体抗体特异性结合的鼠抗人IgG抗体，所述的硝酸纤维素膜上包被有由解脲支原体抗原构成的检测线以及由可与所述的鼠抗人IgG抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体构成的质控线。
所述的解脲支原体抗体是医学上检测人是否感染解脲衣原体的标记物，该标记物大量存在于人体血液中，在人唾液中也有少量存在。所述的解脲支原体抗原可与解脲支原体抗体特异性结合，为人重组抗原。所述的鼠抗人IgG抗体、解脲支原体抗原以及羊抗鼠二抗抗体可以通过市售或者现有方法制备得到。
所述的胶体金垫上附着有0.15～0.25μg/cm2所述的鼠抗人IgG抗体，能够满足试纸条灵敏度要求。
所述的胶体金垫制备方法如下：
取胶体直径为15～35nm的胶体金溶液，调节pH值至8.0～8.2，以每100ml胶体金溶液计，加入0.55～1.2mg所述的鼠抗人IgG抗体，搅拌后用牛血清蛋白封闭，离心去上清液，加入相同体积的胶体金溶液复溶，将每毫升溶液均匀铺在40cm2玻璃纤维膜上，干燥后制得胶体金垫。
所述的检测线中所述的解脲支原体抗原的含量为0.06～1.0μg/cm；所述的质控线中所述的羊抗鼠二抗抗体含量为0.06～1.0μg/cm，可以满足试纸条检测灵敏度的要求。
所述检测线包被方法如下：
将所述的解脲支原体抗原溶解在磷酸缓冲溶液中制得浓度为0.06～0.9mg/ml溶液，用该溶液以1～1.5μl/cm的用量在硝酸纤维素膜的一端划线，干燥后即得检测线；
所述的质控线包被方法如下：
将所述的羊抗鼠二抗抗体溶解在磷酸缓冲溶液中制得浓度为0.06～0.9mg/ml溶液，用该溶液以1～1.5μl/cm的用量在硝酸纤维素膜的另一端划线，干燥后即得质控线。
本发明还提供了上述解脲支原体抗体唾液快速检测试纸条的检测方法，包括以下步骤：
取人唾液，用磷酸缓冲溶液稀释，取50～100μl稀释后的唾液滴在样品垫上，根据检测线(T线)和质控线(C线)的显色状态，判断检测结果。
如C、T线均出现，判定样品为阳性；C线出现，T线不出现，判定样品为阴性；C、T线都不出现或者C线不出现T线出现，均判定试纸无效。
本发明试纸条采用胶体金标记技术，检测唾液中地解脲支原体抗体，从而判断是否感染解脲支原体，具有操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和自检、经济实用等优点。
【具体实施方式】
实施例1
胶体金垫的制备
以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径15nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金溶液于烧杯内，用0.1M K2CO3调至pH8.0，加入0.55mg可与解脲支原体抗体特异性结合的鼠抗人IgG抗体(上海领潮生物科技有限公司)，室温搅拌1小时，加入重量百分比为5％的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，12000rpm、4℃离心30分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至100ml，按1ml溶液铺40cm2的比例，将溶液均匀地铺在玻璃纤维膜上，37℃干燥30分钟，制成胶体金垫。
硝酸纤维素膜的包被
将可与解脲支原体抗体特异性结合的解脲支原体抗原(上海领潮生物科技有限公司)溶解在0.01M、pH8.0磷酸缓冲液(PBS)配制成0.06mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜一端以1.5μl/cm的参数进行划线。
将可与上述鼠抗人IgG抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体(上海领潮生物科技有限公司)溶解在0.01M、pH8.0磷酸缓冲液(PBS)配制成0.06mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜另一端以1μl/cm的参数进行划线。划线后在室温下干燥8小时，分别得到检测线和质控线。
检测试纸的组装
在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于30％，将样品垫(玻璃纤维膜)、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫(吸水试纸)粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，样品垫与胶体金垫的1/5搭接。最后切成宽度为2.5mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。
实施例2
胶体金垫的制备
以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径35nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金溶液于烧杯内，用0.1M K2CO3调至pH8.2，加入1.2mg可与解脲支原体抗体特异性结合的鼠抗人IgG抗体(上海领潮生物科技有限公司)，室温搅拌1小时，加入重量百分比为5％的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，12000rpm、4℃离心30分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至100ml，按1ml溶液铺40cm2的比例，将溶液均匀地铺在玻璃纤维膜上，37℃干燥30分钟，制成胶体金垫。
硝酸纤维素膜的包被
将可与解脲支原体抗体特异性结合的解脲支原体抗原(上海领潮生物科技有限公司)溶解在0.01M、pH8.0磷酸缓冲液(PBS)配制成0.9mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜一端以1.5μl/cm的参数进行划线。
将可与上述鼠抗人IgG抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体(上海领潮生物科技有限公司)溶解在0.01M、pH8.0磷酸缓冲液(PBS)配制成0.9mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜另一端以1.5μl/cm的参数进行划线。划线后在室温下干燥8小时，分别得到检测线和质控线。
检测试纸的组装
在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于30％，将样品垫(玻璃纤维膜)、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫(吸水试纸)粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，样品垫与胶体金垫的1/5搭接。最后切成宽度为2.5mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。
临床样品试验
待检人在采集唾液样品前30分钟禁食，取每位待检人唾液0.5ml于纸杯中，用吸管取两滴滴加到浓度0.02M、pH8.0的磷酸缓冲溶液中稀释，取稀释的唾液100μl加到样品垫中，肉眼观测30分钟，记录T线和C线的显色状态。同时将唾液样品用解脲支原体抗体ELISA试剂盒检测，若两者检测检测结果不一致，再以另外两种解脲支原体抗体ELISA试剂盒进行检测，若两种或以上的ELISA试剂为阳性，判定结果为阳性，两种或以上的ELISA试剂为阴性，判定结果为阴性。
收集唾液样品163份，其中ELISA试剂盒检测出阳性样品43份，本发明试纸条(实施例1)检测出阳性样品44份，具体结果如下表1所示：
表1 本发明试纸条对临床样品解脲支原体抗体的检测结果
灵敏度＝43/43＝100％；特异性＝119/120＝99.2％。