一种饲料益生素的培养制备方法.pdf

本发明公开了一种饲料益生素的培养制备方法，包括1)选取微生物菌种，所选取的微生物菌种为枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌；2)将选取的微生物菌种进行培养，(1)茄子瓶斜面培养基培养，(2)一级种子罐培养，(3)二级种子罐培养；(4)发酵培养。将上述产品粉未化处理的方法，包括：在发酵液中加入絮凝剂0.1-3%的磷酸氢二钠，0.1-3%的氯化钙，加入助滤剂碳酸钙，60℃搅拌20-30分钟，进行板框过滤，收集固体，后进入旋风分离器进行干燥处理，得到粉末固体产品。本发明制备方法得出的菌量在≥500亿cfu/g，活力高，应用广泛，价格合理，完全符合了各养殖户的需求。

1.  一种饲料益生素的培养制备方法，其特征在于：
1)选取微生物菌种，所选取的微生物菌种为枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌；
2)将选取的微生物菌种进行培养，包括：
(1)茄子瓶斜面培养基培养，胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，琼脂粉1.5%，121℃，灭菌30分钟；制成斜面，冷却后进行涂布接种，于38℃培养18-24h；
(2)一级种子罐培养，豆粕1-6%，玉米粉1-5%，葡萄糖0.01-0.1%，玉米浆0.5-2.5%，硫酸盐0.001-0.04%，蛋白胨0.001-0.06%，氢氧化钠0.001-0.15%，消泡剂0.001-0.4%；121℃灭菌30min，降温至38℃，将备好的菌种无菌接到种子罐中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速160转/min，风量160m³/h，培养10h；
(3)二级种子罐培养，豆粕1-6%，玉米粉1-5%，葡萄糖0.01-0.1%，玉米浆0.5-2.5%，硫酸盐0.001-0.04%，蛋白胨0.001-0.06%，氢氧化钠0.001-0.15%，消泡剂0.001-0.4%，氯化钠0.01-0.4%，磷酸氢二钾0.001-0.4%；121℃灭菌30min，降温至38℃，将培养好的一级种子罐培养基无菌打压至二级种子罐中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速150转/min，风量200m³/h，培养9h；
(4)发酵培养，豆粕1-6%，玉米粉1-5%，葡萄糖0.01-0.1%，玉米浆0.5-2.5%，硫酸盐0.001-0.04%，蛋白胨0.001-0.06%，氢氧化钠0.001-0.15%，消泡剂0.001-0.4%，氯化钠0.01-0.4%，121℃灭菌30min，降温至38℃，将培养好的二级种子罐培养基无菌打压至发酵罐培养基中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速180转/min，风量260m³/h，培养32h，镜检观察产生的芽孢率≥95%。

2.  一种将权利要求１所述的饲料益生素的培养制备方法所生产的产品粉未化处理的方法，其特征在于：在发酵液中加入絮凝剂0.1-3%的磷酸氢二钠，0.1-3%的氯化钙，加入助滤剂碳酸钙，60℃搅拌20-30分钟，进行板框过滤，收集固体，后进入旋风分离器进行干燥处理，得到粉末固体产品。

一种饲料益生素的培养制备方法
技术领域
本发明涉及一种饲料益生菌的制备方法，具体说是一种选择菌株后经种子培养、发酵，净化处理得到的一种益生素的方法。    
背景技术
益生素(Probiotic)，又称促生素、生菌剂、活菌制剂、微生态调节剂，其中文名称尚无统一规定，对其定义的解释也不尽一致。首先Lilley和Still well于1965年使用益生素一词(Probiotic)，与抗生素(antibiotic)相对，两者的作用矛盾。抗生素是直接杀灭或抑制有害菌生长。1974年美国RE Parker认为'益生素是维持肠道菌群平衡的微生物或物质'。1989年Fuller重新定义为'一种可通过改变肠道微生物平衡而对动物施加有利影响的活的微生物饲料添加剂'。1990年H.Sossard给益生素的定义是'摄入动物体内参与肠内微生物群落的阻碍作用，或者通过增强非特异性免疫功能来预防疾病而间接地起促进作用和提高饲料效率的活的微生物培养物'。1991年我国学者又提出了一个较通俗的概念—“饲用微生物添加剂”。 
益生素是一类微生物制剂，它作为一种新型饲料添加剂，具有无毒、无副作用，以及促进动物生长，提高饲料转化率，增强动物机体的免疫功能等特点，目前 已被广泛应用于畜禽养殖业。 
可用作益生素的微生物种类很多，美国FDA(1989)规定允许饲喂的微生物有42种。我国1999年经农业部批准使用的微生物品种有12种，包括蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、粪链球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸链球菌等。生产上使用的益生素有两种： 一种为单一菌属组成的单一型菌制剂，另一种为多种不同菌属组成的复合型菌制剂。 
目前由单一菌株经发酵，净化处理得到的产品菌量都＜100亿cfu/g，而且杂菌较多，投入畜禽养殖业添加量较多，造成成本较高，给养殖户造成一定的经济负担。本发明制备方法得出的菌量在≥500亿cfu/g，活力高，应用广泛，价格合理，完全符合了各养殖户的需求。 
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种培养后杂菌含量较少，投入畜禽养殖添加量较少，且成本低的一种饲料益生素的培养制备方法。为解决上述技术问题，本发明的一种饲料益生素的培养制备方法包括以下步骤： 
一种饲料益生素的培养制备方法，选取微生物菌种，所选取的微生物菌种为枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌；将选取的微生物菌种进行培养，包括。
(1)茄子瓶斜面培养基培养，胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，琼脂粉1.5%，121℃，灭菌30分钟；制成斜面，冷却后进行涂布接种，于38℃培养18-24h。 
(2)一级种子罐培养，豆粕1-6%，玉米粉1-5%，葡萄糖0.01-0.1%，玉米浆0.5-2.5%，硫酸盐0.001-0.04%，蛋白胨0.001-0.06%，氢氧化钠0.001-0.15%，消泡剂0.001-0.4%；121℃灭菌30min，降温至38℃，将备好的菌种无菌接到种子罐中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速160转/min，风量160m³/h，培养10h。 
(3)二级种子罐培养，豆粕1-6%，玉米粉1-5%，葡萄糖0.01-0.1%，玉米浆0.5-2.5%，硫酸盐0.001-0.04%，蛋白胨0.001-0.06%，氢氧化钠0.001-0.15%，消泡剂0.001-0.4%，氯化钠0.01-0.4%，磷酸氢二钾0.001-0.4%；121℃灭菌30min，降温至38℃，将培养好的一级种子罐培养基无菌打压至二级种子罐中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速150转/min，风量200m³/h，培养9h。 
(4)发酵培养，豆粕1-6%，玉米粉1-5%，葡萄糖0.01-0.1%，玉米浆0.5-2.5%，硫酸盐0.001-0.04%，蛋白胨0.001-0.06%，氢氧化钠0.001-0.15%，消泡剂0.001-0.4%，氯化钠0.01-0.4%，121℃灭菌30min，降温至38℃，将培养好的二级种子罐培养基无菌打压至发酵罐培养基中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速180转/min，风量260m³/h，培养32h，镜检观察产生的芽孢率≥95%。 
将上述饲料益生素的培养制备方法所生产的产品粉未化处理的方法，包括以下步骤：在发酵液中加入絮凝剂0.1-3%的磷酸氢二钠，0.1-3%的氯化钙，加入助滤剂碳酸钙，60℃搅拌20-30分钟，进行板框过滤，收集固体，后进入旋风分离器进行干燥处理，得到粉末固体产品。 
培养后杂菌含量较少，菌量高，菌量≥500亿cfu/g，投入畜禽养殖添加量较少，且成本低，更能促进畜禽生长及提高饲料利用率。 
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。 
具体实施方式
本发明的一种饲料益生素的培养制备方法，包括以下步骤： 
选取微生物菌种，所选取的微生物菌种为枯草芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌。
将选取的微生物菌种进行培养，包括： 
(1)茄子瓶斜面培养基培养，胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，琼脂粉1.5%，121℃，灭菌30分钟；制成斜面，冷却后进行涂布接种，于38℃培养18h。
(2)一级种子罐培养，豆粕1%，玉米粉1%，葡萄糖0.01%，玉米浆0.5%，硫酸盐0.001%，蛋白胨0.001%，氢氧化钠0.001%，消泡剂0.001%；121℃灭菌30min，降温至38℃，将备好的菌种无菌接到种子罐中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速160转/min，风量160m³/h，培养10h。 
(3)二级种子罐培养，豆粕1%，玉米粉1%，葡萄糖0.01%，玉米浆0.5%，硫酸盐0.001%，蛋白胨0.0016%，氢氧化钠0.001%，消泡剂0.001%，氯化钠0.01%，磷酸氢二钾0.001%；121℃灭菌30min，降温至38℃，将培养好的一级种子罐培养基无菌打压至二级种子罐中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速150转/min，风量200m³/h，培养9h。 
(4)发酵培养，豆粕1%，玉米粉1%，葡萄糖0.01%，玉米浆0.5%，硫酸盐0.001%，蛋白胨0.001%，氢氧化钠0.001%，消泡剂0.001%，氯化钠0.01%，121℃灭菌30min，降温至38℃，将培养好的二级种子罐培养基无菌打压至发酵罐培养基中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速180转/min，风量260m³/h，培养32h，镜检观察产生的芽孢率≥95%。 
将上述饲料益生素的培养制备方法所生产的产品粉未化处理的方法，包括以下步骤：在发酵液中加入絮凝剂0.1%的磷酸氢二钠，0.1%的氯化钙，加入助滤剂碳酸钙，60℃搅拌20-30分钟，进行板框过滤，收集固体，后进入旋风分离器进行干燥处理，得到粉末固体产品。 
实施例1 
枯草芽孢杆菌饲料益生素的培养制备方法
1.菌株培养
250ml是茄子瓶斜面培养基加入胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，琼脂粉1.5%，121℃，灭菌30分钟，制成斜面，冷却后进行涂布接种，与38℃培养18-24h。
2.种子培养 
将茄子瓶培养的菌种，以无菌处理方式转接与500ml三角瓶中，以备接种种子罐。400L的一级种子罐培养基加入豆粕4%，玉米粉2%，蛋白酶0.03%，与45℃酶解40min，后加入葡萄糖0.6%，玉米浆1.2%，硫酸锰0.025%，氢氧化钠0.075%，消泡剂0.16%，121℃灭菌30min，降温至38℃，将备好的菌种无菌接到种子罐中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速150转/min，风量200m3/h，培养10h。
5000L的二级种子罐培养基加入豆粕4.6%，玉米粉2%，蛋白酶0.0173%，与45℃酶解40min，后加入葡萄糖0.23%，玉米浆0.46%，硫酸锰0.0116%，氢氧化钠0.023%，消泡剂0.0693%，氯化钠0.23%，磷酸氢二钾0.023%，121℃灭菌30min，降温至38℃，将培养好的一级种子罐培养基无菌打压至二级种子罐中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速150转/min，风量200m3/h，培养9h。 
3.发酵培养 
20T的发酵罐培养基加入豆粕5%，玉米粉2.6%，蛋白酶0.02%，与45℃酶解40min，后加入葡萄糖0.25%，玉米浆0.5%，硫酸锰0.23%，氢氧化钠0.23%，消泡剂0.1%，氯化钠0.23%，将培养好的二级种子罐培养基无菌打压至发酵罐培养基中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速160转/min，风量260 m³/h，培养32h，镜检观察产生的芽孢率≥95%。
4.后序粉末处理 
发酵液达到要求，加入絮凝剂2%的磷酸氢二钠、2.5%的氯化钙，加入助滤剂6%的碳酸钙，60℃搅拌30分钟，进行板框过滤，收集固体，后进入旋风分离器进行干燥处理，得到粉末固体产品。或者发酵液达到要求，直接进入喷雾干燥塔进行喷雾处理得到粉末固体产品。
实施例2 
枯草芽孢杆菌，地衣芽胞杆菌（10702）
1.菌株培养
250ml是茄子瓶斜面培养基加入胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，琼脂粉1.5%，121℃，灭菌30分钟，制成斜面，冷却后进行涂布接种，与38℃培养18-24h。
2.种子培养 
将茄子瓶培养的菌种，以无菌处理方式转接与500ml三角瓶中，以备接种种子罐。400L的一级种子罐培养基加入豆粕4%，玉米粉2.5%，蛋白酶0.03%，与45℃酶解40min，后加入葡萄糖0.6%，硫酸锰0.025%，氢氧化钠0.03%，消泡剂0.16%，121℃灭菌30min，降温至38℃，将备好的菌种无菌接到种子罐中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速160转/min，风量160m3/h，培养10h。
5000L的二级种子罐培养基加入豆粕4%，玉米粉2.65%，蛋白酶0.0173%，与45℃酶解40min，后加入葡萄糖0.23%，玉米浆0.46%，硫酸锰0.023%，氢氧化钠0.026%，消泡剂0.093%，氯化钠0.23%，121℃灭菌30min，降温至38℃，将培养好的一级种子罐培养基无菌打压至二级种子罐中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速180转/min，风量200m3/h，培养9h。 
3.发酵培养 
20T的发酵罐培养基加入豆粕5%，玉米粉2.65%，蛋白酶0.02%，与45℃酶解40min，后加入葡萄糖0.25%，玉米浆0.465%，硫酸锰0.23%，氢氧化钠0.23%，消泡剂0.1%，氯化钠0.235%，将培养好的二级种子罐培养基无菌打压至发酵罐培养基中，温度38℃，罐压0.05Mpa，转速180转/min，风量260 m³/h，培养32h，镜检观察产生的芽孢率≥95%。
后序粉末处理 
发酵液达到要求，加入絮凝剂2%的磷酸氢二钠、2.5%的氯化钙，加入助滤剂6%的碳酸钙，60℃搅拌30分钟，进行板框过滤，收集固体，后进入旋风分离器进行干燥处理，得到粉末固体产品。或者发酵液达到要求，直接进入喷雾干燥塔进行喷雾处理得到粉末固体产品。
地衣芽孢杆菌对断奶仔猪生产性能的影响
1材料与方法
1.1试验动物与试验日粮
试验选取25日龄断奶体重相近的健康断奶仔猪104头，平均体重7.37±0.02kg，由山东六和新泰养殖基地提供。
1组为空白对照组，饲喂基础日粮，采用300瘦肉型乳猪配合饲料，由山东六和有限公司提供。基础日粮主要营养水平：粗蛋白质≥21.0％、粗纤维≤4.0％、粗灰分≤7.0％、钙0.05％～1.2％、总磷0.4％～1.2％、食盐0.3％～0.8％、赖氨酸≥1.25％。 
2组为试验组，饲喂试验日粮，在基础日粮上按200g/t地衣芽孢杆菌量添加，其中地衣芽孢杆菌的活菌数≥500亿CFU／g，由山东高龙生物科技有限公司提供。 
试验分组与饲养管理
试验仔猪随机分为2个组，每组2个重复，每重复26头（公母各半）。试验前预试5天，30日龄称重，开始正式试验，试验周期2l天。试验期间自由采食，自由饮水，其它饲养管理按照断奶仔猪饲养管理程序进行。试验在山东六和新泰养殖基地完成。
试验数据记录
试验全程记录各组饲料消耗量、采食情况、腹泻及生长情况；观察粪便、毛色及精神情况。在试验第1天（即30日龄）和试验第21天早晨空腹称重，称量剩余饲料量，计算各组平均日增重、料肉比（F/G）、死淘率和腹泻率。
试验结果统计与分析
   采用统计学软件SPSS13.0软件对数据进行单因子方差分析和相关性分析。
试验结果与分析
2.1地衣芽孢杆菌对断奶仔猪增重的影响
由试验结果可以看出，在试验初期空白组与地衣芽孢杆菌组(简称芽孢组)平均初重无明显差异(P>0.05)；在试验末期(第21日龄)，芽孢组体重明显高于空白对照组，平均总增重、平均日增重分别提高了l2.33％、l3.89％，差异显著(P<0.05)。由表l可见，与空白对照组相比，0.02％的地衣芽孢杆菌组显著提高了仔猪的试验末重、总增重及平均日增重。
表1  0.02%地衣芽孢杆菌对断奶仔猪增重的影响（单位：kg/头） 
  
注：进行列比较，肩注*表示与差异显著（P<0.05）；肩注**表示差异极显著（P<0.01）。（下同）
2.2地衣芽孢杆菌对断奶仔猪料肉比的影响
由表2可看出，地衣芽孢杆菌组的耗料量高于对照组，但差异不显著(P>0.05)，而地衣芽孢组的平均增重高于对照组，料肉比明显低于对照组，芽孢组降低料肉比15.49％，差异极显著(P<0.01)。
表2  0.02%地衣芽孢杆菌对断奶仔猪采食量及料肉比的影响 
 
2.3地衣芽孢杆菌对断奶仔猪腹泻情况的影响
试验结果显示，地衣芽孢杆菌组可以明显降低仔猪腹泻的发生，空白组共有l2头腹泻，腹泻率为23.08％；地衣芽孢杆菌组共有3头腹泻，腹泻率为5.77％，与空白组相比芽孢组腹泻率降低了l7.3l％，差异极显著(P<0.01)。
表3 0.02%地衣芽孢杆菌对断奶仔猪腹泻的影响（%） 
 
3 结论
本实验证明，地衣芽孢杆菌可以促进营养物质的消化和吸收，具有明显的促生长作用，可以降低料肉比。仔猪阶段肠道有益菌群没有建立。免疫系统功能不够完善，容易发生肠道疾病，补充地衣芽孢杆菌可以促进有益菌的生长繁殖，抑制有害菌的增殖，从而促进肠道微生态平衡的建立，减少腹泻及其他肠道疾病的发生。
枯草芽孢杆菌对蛋种鸡生产性能的影响
1  材料方法
1.1  试验用枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌由山东高龙生物科技有限公司提供，有效活菌数500亿cfu/g
1.2  试验用鸡与试验地点
2000只伊莎蛋种鸡，由蒙阴县伟业种禽有限公司提供并完成该实验。
1.3  方法 
1.3.1  试验设计与分组
45周龄伊莎蛋种鸡2000只，随机分成两组，每组设5个重复，每个重复200只，预饲期3d，饲喂基础日粮，预饲期结束时，调整分组使试验组与对照组各项生产性能观测指标基本一致。试验期32 d，对照组饲喂基础日粮（不添加任何微生态制剂），试验组饲喂每吨基础日粮添加100g枯草芽孢杆菌制剂（含量500亿cfu/g）。
1.3.2  饲养管理 
试验组和对照组在同一鸡舍内，采用全阶梯式笼养，每笼3只。两组饲养管理完全一致，均采用人工喂料，自由采集和饮水，每天光照16h。
1.4  测定指标 
每天记录产蛋数、种蛋合格率。试验开始8d后，每4d进行种蛋受精率、孵化率和健雏率的测定。
受精率（%）=受精蛋数/人孵蛋数×100 
孵化率（%）=出雏数/受精蛋数×100
健雏率（%）=健雏数/出苗数×100
1.5  数据统计分析
试验数据采用spss12.0软件进行单因子方差分析，差异显著时进行LSD多重比较。以
P<0.05为差异显著水平。
2  结果与分析 
2.1  饲料添加枯草芽孢杆菌对蛋种鸡生产性能的影响（见表4）

注：同行数字肩标有相同字母表示差异显著（P<0.05），含有不同字母表示差异不显著（P>0.05），下表同。
由表4可见，日粮添加枯草芽孢杆菌可以一定程度降低蛋种鸡的采食量，差异不显著（P>0.05），但是显著提高产蛋率2.38% （P<0.05）、蛋重2.82% （P<0.05）和种蛋合格率2.63%（P<0.05）。芽孢杆菌可在体内产生一些营养物质能被宿主所利用，这些营养物质包括短链脂肪酸、氨基酸和维生素等，另外，芽孢杆菌还可产生一些消化酶，帮助动物笑话饲料中不可利用物质，为蛋鸡提供了更多的营养，短链脂肪酸还可以刺激肠壁上皮细胞的增殖和肠绒毛的增长，从而增加营养物质的吸收，因此，添加枯草芽孢菌后尽管采食量有所下降，但种鸡的产蛋率提高了。 
2.2   饲料添加枯草芽孢杆菌对种蛋孵化性能的影响 
 
表5结果表明，日粮中添加100g/t枯草芽孢杆菌，可提高受精率0.43%（P>0.05），显著提高孵化率4.12%（P<0.05）和健雏率3.76%（P<0.05）。肠道内乳酸菌等有益菌数量提高，而大肠杆菌、肠球菌数量降低。肠道内容物氨化物、硫化物等有害气体减低。这样减少细菌病的发病率。因此，种蛋的受精率和孵化率都得以提高了。这说明种鸡的肠道健康对生殖道的健康都是有益的。
3、结论 
日粮中添加枯草芽孢杆菌不仅可以提高种鸡的产蛋率、蛋重和种蛋的合格率，而且可以改善蛋的受精率、孵化率和健雏率。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。