用含氨基酸的缓冲液通过毛细管电泳分离蛋白质的方法 本发明涉及蛋白质电泳领域，而且论述在通过毛细管电泳在蛋白质分离中得到高分辨力的方法。
【发明背景】
分析哺乳动物血清中蛋白质的水平，已被广泛地用作各种疾病和异常生理状况的指示手段。例如，低于正常水平的白蛋白是肾脏疾病的征兆，而高浓度的白蛋白则是脱水的特征。类似地，前-β脂蛋白水平的升高可以是慢性酒精中毒或雌激素过多症的征兆，而β-脂蛋白水平的升高可以是高胆固醇的征兆。
蛋白质可方便地通过电泳而分离，板凝胶电泳和毛细管电泳都已被应用。毛细管电泳的好处是，可以分析非常少的样品，而且由于毛细管中壁表面与体积之比高，电流所产生的热量可以很快地被散发掉，从而可以在高压下进行电泳，因而缩短了分离时间。开放式毛细管区带电泳(其中分离介质是缓冲溶液)特别有用，因为对于每次使用，毛细管可方便地加以调节并注入溶液。
一旦施加电场，在毛细管壁表面处的电动势是蛋白质移动和分离中的主要因素。蛋白质和毛细管壁之间的相互作用可改变这种移动和分离。在高或低pH下进行的分离(这样会使蛋白质带净电荷)可减少蛋白质和毛细管壁之间的相互作用。这种相互作用在用熔凝氧化硅制成的毛细管中特别强，从而造成蛋白质被吸附在毛细管壁上。通过改变壁表面地电荷密度，吸附作用对电渗流会产生影响。电渗流的改变反之会改变迁移时间、峰分辨力和重复性。尽管影响程度更低，但是这些因素也适用于板电泳，尤其是使用薄板电泳时。
为了通过抑制蛋白质与毛细管壁或其他包括在分离区带中的壁之间的相互作用而改善分离的努力，已导致开发出众多处理方法、添加剂和操作条件。一种技术是使用pH高于样品蛋白质的等电点的缓冲液，从而赋予蛋白质净负电荷，将它们从带负电荷的壁上排斥开。该方法的缺点是蛋白质可能会水解以及发生其他的结构变化。盐浓度高的强碱性缓冲液也已被用作阻断蛋白质与壁之间的离子相互作用的手段。然而，高盐浓度增加了缓冲液的导电性，因而增加了毛细管内热量产生的速度。另一种方法是涂覆壁以掩饰或中和电势，而用于该目的的涂料包括聚丙烯酰胺、乙二醇和五氟苯甲酰基。涂覆的壁的缺点有：由于重复使用过程中涂层的逐渐破坏而导致重复性低，以及消除了电内渗流分量而导致分析速度的下降。另一种方法是在电泳缓冲液中包含硼酸根离子，以便与糖蛋白的糖部分形成复合物从而中和它们的电荷。使用硼酸根离子可能会使某些蛋白质尤其免疫球蛋白变性，从而形成分开的峰。同样，硼酸根离子会增加缓冲液的导电性，限制了电场和分离所能到达的速度。
发明概述
现在发现，通过使用含有氨基酸的碱性电泳缓冲液，可以在没有蛋白质-壁相互作用的不利特性下，通过毛细管电泳而实现有效的和快速的蛋白质分离。这种缓冲液普遍适用于电泳，其中包括各种几何结构的电泳池，但是它对于在毛细管中进行的电泳特别适用。含氧化硅材料的毛细管，尤其内部没有涂覆过的熔凝氧化硅毛细管是优选的。
在最佳的使用中，含有氨基酸的缓冲液被用于加入样品之前毛细管或其他电泳池的预处理，被用作加入样品时样品的稀释缓冲液，以及被用作构成电源和分离区域之间电通路的两个电极液槽中任一个中的电极缓冲液。氨基酸减少了蛋白质-壁之间的相互作用以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用，而且避免了变性的危险。因此，用本发明缓冲液进行的分离可以提供板凝胶电泳所能达到的相同或等价的分离效果，而且精度高、分辨力高、重复性高。
本发明的这些和其他特征及优点，通过下列的描述将更明显。
附图简述
图1是用本发明缓冲液通过毛细管区带电泳分析正常血清样品的电泳图。
图2a是用本发明缓冲液通过毛细管区带电泳分析正常血清样品的电泳图，其中使用一套不同于图1的操作条件。
图2b是用本发明范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图2a相同的血清样品的光密度扫描图。
图3a是用本发明的缓冲液进行的毛细管区带电泳，分析患单克隆丙种球蛋白病的对象的血清样品的电泳图。
图3b是用本发明范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图3a相同的血清样品的光密度扫描图。
图4a是用本发明的缓冲液进行的毛细管区带电泳，分析患多克隆丙种球蛋白病的对象的血清样品的电泳图。
图4b是用本发明范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图4a相同的血清样品的光密度扫描图。
图5a是用本发明的缓冲液进行的毛细管区带电泳，分析患IgA单克隆丙种球蛋白病并有正常IgG的对象的血清样品的电泳图。
图5b是用本发明范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图5a相同的血清样品的光密度扫描图。
图6a是用本发明的缓冲液进行的毛细管区带电泳，分析一对象的血清样品的电泳图，该对象患双克隆或寡克隆丙种球蛋白病且α1和α2升高。
图6b是用本发明范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图6a相同的血清样品的光密度扫描图。
图7a是用本发明的缓冲液进行的毛细管区带电泳，分析患小单克隆(minimonoclonal)丙种球蛋白病的对象的血清样品的电泳图。
图7b是用本发明范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图7a相同的血清样品的光密度扫描图。
图8a是用本发明缓冲液进行的毛细管区带电泳所获得的白蛋白峰面积与用本发明范围之外的缓冲液进行的板凝胶电泳所获得的白蛋白峰面积之间的相关性图。
图8b是类似于图8a的相对α1球蛋白峰面积的相关性图。
图8c是类似于图8a的相对α2球蛋白峰面积的比较图。
图8d是类似于图8a的相对β球蛋白峰面积的比较图。
图8e是类似于图8a的相对γ球蛋白峰面积的比较图。
发明详述和优选实施例
氨基酸在本发明中之所以有效是因为它们在高pH条件下因羧基(-COO-)的离子化而带负电荷。有用的氨基酸包括必需和非必需氨基酸。某些主要氨基酸的例子包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸和谷氨酰胺。其中优选的是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，更佳的是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。优选的氨基酸类别是α-氨基酸，尤其是那些在水溶液中导电率较低的种类如甘氨酸。可在一个缓冲液中使用2种或多种氨基酸而不是仅用一种，尽管在绝大多数情况下用一种氨基酸便已足够了。
氨基酸的浓度并不重要，而且在任一具体情况下的最佳浓度取决于诸如待分析样品的稀释度和毛细管性质(包括施加的任何表面处理及其内直径)等因素。一般，最佳结果是用约10-500mM的氨基酸浓度获得的，更佳地为约20200mM。
缓冲液优选是水溶液，尽管并不限于任何具体的溶剂。溶液是碱性的以便赋予氨基酸负电荷。尽管碱性度可以改变，但是优选的溶液是pH为约8-11，最佳地约9-10的溶液。
用本发明的方法分析的样品优选在注射或上样于柱之前用缓冲液稀释过的样品。稀释程度并不关键，可以变化。然而，一般在1份样品对约1-100份缓冲液，更佳地为1份样品对约3-30份缓冲液进行稀释的情况下可获得最佳结果。
本发明可应用于一般性的蛋白质混合物的液体样品，尤其是用于分析生物流体样品。这种流体的例子有尿液、唾液、脑脊液、全血、血浆和血清。特别是血清样品。
缓冲液还可含有添加剂。例如可加入盐类以增加溶液的离子强度，以便提高分离蛋白区带的分辨力。优选的盐类是无机盐如碱金属和碱土金属的卤化物。例子有钠和钾的卤化物如氯化物、碘化物、溴化物和氟化物，其中优选氯化钠。盐浓度并不关键，可以改变，而最佳范围取决于系统的其他参数。典型的范围是约1-100mM，更佳地为约10-30mM。
还优选的是，缓冲溶液中不含有除氨基酸之外的其他缓冲剂。进一步优选的是，缓冲溶液不含会与蛋白质或毛细管壁形成复合物或结合或相互作用的添加剂。具体地，缓冲液最好不含硼酸根离子、磷酸根离子或硼酸根和磷酸根的取代类似物。然而，即使在这些添加剂存在的情况下，本发明的好处仍能获得。
本发明还提供了各种材质的毛细管中性能更好的优点，无论是有涂层或无涂层的毛细管。然而，如上所述，本发明特别适用于含氧化硅材料如熔凝氧化硅、玻璃或石英的毛细管，最适用于内壁表面未经涂覆的含氧化硅的毛细管。
根据本发明的蛋白质分离，可以方便地用常规电泳分离技术中所用的设备、材料、操作条件和程序进行。优选的毛细管是那些内直径小于约200微米，最佳地约10-100微米的毛细管。本发明还适用于板型池和其他非毛细管系统中进行的电泳分离。对于毛细管系统，优选至少约50伏特/厘米毛细管长度，更佳的电压伏特为约100-1000伏特/厘米。
下列实施例仅仅是为了阐述目的而给出，它们不以任何方式定义或限定本发明。
实施例1
将25mM甘氨酸和25mM NaCl溶解于去离子水中，再用1N NaOH调节pH至11，从而制得电泳缓冲液。使用熔凝氧化硅毛细管，测得其内直径为50μ而外直径为375μ，而总长度为25厘米(从入口至检测器为20厘米)。毛细管内表面未经涂覆，而外表面涂有聚亚酰胺以提高韧性和防止破碎。毛细管的预处理是用1N NaOH洗涤2分钟，用蒸馏水漂洗2分钟，用电泳缓冲液洗涤5分钟。然后，在注有电泳缓冲液的情况下让20kV通过毛细管2小时而调整毛细管。
用电泳缓冲液稀释不含药物的(正常)血清50倍，然后在2psi(0.14kg/cm2)的压力下注入毛细管1秒。在15.00kV的电压下进行电泳，并对波长214mm处的吸收进行检测。在3分钟内出现了5个峰，如图1的电泳图所示。从左至右，这些峰代表γ(伽马)球蛋白组份、β(贝塔)球蛋白组份、α1(阿尔法-1)球蛋白组份、α2(阿尔法-2)球蛋白组份和白蛋白组份。根据平稳的基线，这些峰十分明确。
实施例2
该实施例用本发明的缓冲溶液来比较患不同疾病的人的血清样品的电泳图，而且还包括在不含氨基酸的琼脂糖凝胶上进行电泳的电泳图。
将11.26克甘氨酸和0.76克NaCl溶解于800毫升蒸馏水中，再用1N NaOH调节pH至9.6，再加去离子水至终体积为1000毫升，然后让形成的溶液通过0.5μ的滤膜，从而制得电泳缓冲液。该电泳缓冲液含有150mM甘氨酸。血清样品是将1份样品与9份电泳缓冲液(体积)混合而制备的。毛细管是熔凝氧化硅毛细管，其内直径为25μ而外直径为360μ，而总长度为24厘米，其中从入口至检测器的距离为19厘米。毛细管内表面未经涂覆，而外表面涂有聚亚酰胺。毛细管用1N NaOH洗涤30秒，再用电泳缓冲液漂洗30秒。在20℃下进行毛细管区带电泳(仅使用电泳缓冲液作为分离介质)，其中样品在5psi(0.35kg/cm2)的压力下注入毛细管1秒，在15kV的电压下和16μA下进行电泳3分钟，并在214nm处进行检测。
比较试验是在预浇制的琼脂糖板凝胶中进行，其中用巴比妥缓冲液。该缓冲液组合物含有10mM 5，5-二乙基巴比土酸加50mM 5，5-二乙基巴比土酸钠，pH为8.6，而电压为100V，用蓝染色法使蛋白质显现。
在各图中所示的电泳图轨迹如下：
图2a：正常血清，用甘氨酸电泳缓冲液的毛细管区带电泳。
图2b：正常血清，用巴比妥缓冲液的琼脂糖板凝胶。
图3a：患单克隆丙种球蛋白病的对象的血清，用甘氨酸电泳缓冲液的毛细管区带电泳。
图3b：患单克隆丙种球蛋白病的对象的血清，用巴比妥缓冲液的琼脂糖板凝胶。
图4a：患多克隆丙种球蛋白病的对象的血清，用甘氨酸电泳缓冲液的毛细管区带电泳。
图4b：患多克隆丙种球蛋白病的对象的血清，用巴比妥缓冲液的琼脂糖板凝胶。
图5a：患IgA单克隆丙种球蛋白病并有正常IgG的对象的血清，用甘氨酸电泳缓冲液的毛细管区带电泳。
图5b：患IgA单克隆丙种球蛋白病并有正常IgG的对象的血清，用巴比妥缓冲液的琼脂糖板凝胶。
图6a：患双克隆或寡克隆丙种球蛋白病且α1和α2升高的对象的血清，用甘氨酸电泳缓冲液的毛细管区带电泳。
图6b：患双克隆或寡克隆丙种球蛋白病且α1和α2升高的对象的血清，用巴比妥缓冲液的琼脂糖板凝胶。
图7a：患小单克隆丙种球蛋白病的对象的血清样品，用甘氨酸电泳缓冲液的毛细管区带电泳。
图7b：患小单克隆丙种球蛋白病的对象的血清样品，用巴比妥缓冲液的琼脂糖板凝胶。
在所有这些电泳图中所示的峰(除了图5a和5b之外)是白蛋白和组份α1、α2、β和γ，其中在毛细管区带电泳轨迹中依次为从右至左，而在板凝胶电泳轨迹中为从左至右，而且在每种情况下白蛋白是最大的峰。在图5a中，两个最左侧的峰(保留时间分别为1.16和1.24)分别是IgG和IgA，而在图5b中分别是最右侧的两个峰。这些轨迹显示，如同在使用巴比妥缓冲液的板凝胶电泳轨迹中一样，在用甘氨酸缓冲液的毛细管区带电泳轨迹中这些峰同样有效地被分开。
实施例3
该实施例报道了相关性研究，在该研究中用实施例2中所述的两种方法分析了37个不同病人的的血清样品。对5种组份中每一种，比较了在两种方法之间的峰面积，面积通过积分器确定。还进行了回归分析。对于白蛋白和组份α1、α2、β和γ，结果分别绘制于图8a、8b、8c、8d和8e中。
回归分析得到如下结果：
图8a：y＝0.9836x+2.4469；R2＝0.9176
图8b：y＝1.5197x+0.2363；R2＝0.9223
图8c：y＝0.8888x-0.0989；R2＝0.8931
图8d：y＝0.4147x+2.3944；R2＝0.4587
图8e：y＝1.0696x-0.4784；R2＝0.9789
β区的相关性(图8d)没有和其他4种区的相关性一样好。有两种可能的原因。首先，β2球蛋白可能高亲和性地结合于染料但紫外吸收低。其次，光密度仪的自动划界线不一致。然而其他4种区的相关性令人信服地表明，用甘氨酸缓冲液的毛细管区带电泳是实现在血清样品中蛋白质合适分离的有效手段。
实施例4
该实施例研究了单一血清样品在重复的电泳分离中的数据的重复性。使用了6个毛细管，在实施例2所述的条件下，在每个毛细管中以连续方式进行10次电泳，并且不在中间进行毛细管处理。在每个电泳图中对5个峰的每一个峰加一个内标测量其迁移时间和峰面积。对每个毛细管，在电泳-电泳比较中计算每个10次电泳系列的平均值，并确定标准差和变异系数(标准差除以平均值)。结果列于表I和II，其中“S.D.”指标准差，而“％C.V.”指百分比表示的变异系数。然后在毛细管-毛细管比较中，比较平均值，再计算出总平均值以及标准差和变异系数。这些都列于表III。从所有这3个表中可以看出，获得了高重复性和精确度。
表I各毛细管的电泳-电泳比较 峰→ 内标 白蛋白 α-1 α-2 β γ毛细管 No.1 样品数目10 迁移 时间 (min) 平均值 2.11 1.68 1.55 1.41 1.31 1.16 S.D. 0.034 0.023 0.021 0.014 0.014 0.008 ％C.V. 1.63 1.37 1.37 1.02 1.09 0.7 峰 面 积 平均值 19.2 50.9 5.7 7.2 7.1 9.4 S.D. 0.2098 0.244 0.19 0.155 0.2 0.108 ％C.V. 1.09 0.48 3.33 2.15 2.82 1.15毛细管 No.2 样品数目10 迁移 时间 (min) 平均值 2.17 1.73 1.59 1.44 1.33 1.19 S.D. 0.0206 0.0127 0.0082 0.0074 0.0048 0.0042 ％C.V. 0.95 0.73 0.51 0.51 0.36 0.35 峰 面 积 平均值 18.5 51 5.53 7.54 7.21 9.38 S.D. 0.28 0.17 0.068 0.097 0.145 0.181 ％C.V. 1.51 0.33 1.24 1.28 2.01 1.93毛细管 No.3 样品数目10 迁移 时间 (min) 平均值 2.18 1.73 1.59 1.44 1.33 1.19 S.D. 0.0084 0.0048 0.0048 0.0047 0.0048 0.0042 ％C.V. 0.39 0.28 0.3 0.33 0.36 0.35 峰 面 积 平均值 18.3 51.1 6 7.6 7 9.1 S.D. 0.215 0.294 0.193 0.132 0.132 0.145 ％C.V. 1.17 0.57 3.22 1.73 1.88 1.59
表II其他各毛细管的电泳-电泳比较 峰→ 内标 白蛋白 α-1 α-2 β γ毛细管 No.4 样品数目10 迁移 时间 (min) 平均值 2.09 1.66 1.53 1.38 1.29 1.15 S.D. 0.0597 0.0368 0.03 0.0259 0.0227 0.0195 ％C.V. 2.85 2.21 1.96 1.88 1.76 1.69 峰 面 积 平均值 19.6 51.8 5.2 7.1 7.1 8.9 S.D. 0.129 0.27 0.207 0.123 0.155 0.158 ％C.V. 0.66 0.52 3.98 1.73 2.18 1.77毛细管 No.5 样品数目10 迁移 时间 (min) 平均值 2.06 1.65 1.52 1.37 1.27 1.14 S.D. 0.0534 0.033 0.028 0.0242 0.0206 0.0171 ％C.V. 2.59 2 1.84 1.77 1.62 1.5 峰 面 积 平均值 18.4 51.8 5.5 7.4 7.2 8.6 S.D. 0.135 0.1197 0.1075 0.1449 0.1354 0.1337 ％C.V. 0.73 0.23 1.95 1.96 1.88 1.56毛细管 No.6 样品数目10 迁移 时间 (min) 平均值 2.07 1.67 1.53 1.39 1.29 1.15 S.D. 0.0726 0.0334 0.0273 0.0244 0.0208 0.0155 ％C.V. 3.51 2 1.78 1.76 1.61 1.35 峰 面 积 平均值 18.8 51.2 5.6 7.5 7.2 8.8 S.D. 0.137 0.2098 0.1449 0.165 0.1619 0.1287 ％C.V. 0.73 0.41 2.59 2.2 2.25 1.46
表III毛细管-毛细管比较 峰→ 内标 白蛋白 α-1 α-2 β γ毛细管 1-6样品数目10 迁移 时间 (min)平均值 2.11 1.69 1.55 1.41 1.3 1.16S.D. 0.0508 0.035 0.031 0.0302 0.024 0.0216％C.V. 2.4 2.07 2.02 2.14 1.86 1.86 峰 面 积平均值 18.8 51.3 5.6 7.4 7.1 9S.D. 0.51 0.4 0.26 0.194 0.082 0.327％C.V. 2.71 0.78 4.71 2.62 1.15 3.62
上述内容主要是为了阐述而提供的。对于本领域的技术人员而言很明显，此处所述的操作条件、材料、程序步骤和系统的其他参数可被进一步地以多种形式加以改动或替换，这些同样落于本发明的精神和范围之内。