低密度脂蛋白中的胆甾醇的定量法 本发明涉及一种在临床诊断领域中对动脉硬化的诊断具有重要意义的低密度脂蛋白(LDL)中的胆甾醇(以下称为LDL胆甾醇)的定量法。
迄今为止，在进行LDL胆甾醇的定量时，都是首先测定试样中的胆甾醇总量，然后向另外一个试样中添加LDL和极低密度脂蛋白(VLDL)的沉淀剂，离心分离，测定上清液中高密度脂蛋白(HDL)中的胆甾醇(以下称为HDL胆甾醇)含量，再根据Friedewald的换算式算出其数值(日本临床广范围血液·尿化学检查免疫学的检查上卷，日本临床社出版，615页，1995年)。按照该方法，必须对总胆甾醇含量和HDL胆甾醇含量分二次测定，另外还需进行离心分离操作等，步骤麻烦。然而，即使单纯地将血清试样直接添加到含有胆甾醇酯酶和胆甾醇氧化酶的试剂中，与测定胆甾醇总量的体系没有差别，对LDL胆甾醇没有特异性。
在特开昭58-165800中公开了一种在特殊的表面活性剂的存在下，不需分离操作即可直接测定LDL胆甾醇含量地方法。然而，按照该方法，在LDL胆甾醇发生反应的同时，HDL胆甾醇也发生反应，LDL的特异性低，而且，该反应条件的设定麻烦，难以适用于多种多样的试样。
另外，在特开平7-280812中公开了这样一种方法，该方法是先使LDL凝聚，然后除去LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇，再将已凝聚的LDL进行解凝聚，通过使LDL胆甾醇进行酶反应来测定LDL胆甾醇的含量。
本发明者们研究出下述a)、b)两种方法，从而完成了本发明，其中：a)在一种能阻断HDL以外的脂蛋白即LDL、VLDL和乳糜微粒(CM)反应的试剂的存在下，使用一种胆甾醇反应试剂与HDL胆甾醇进行特异反应而将其除去，然后根据需要，在一种可使与LDL胆甾醇反应可能化的试剂的存在下，用一种胆甾醇反应试剂，使胆甾醇进行定量的酶反应，这样不需特地进行分离即能特异地定量含有LDL的试样中的LDL胆甾醇；b)仅仅对LDL进行反应阻断，在用一种胆甾醇反应试剂将LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇通过反应除去后，再用一种胆甾醇反应试剂使胆甾醇进行定量的酶反应，这样不需特地进行分离即能特异地定量含有LDL的试样中的LDL胆甾醇。
此处，所谓对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断是指，使HDL以外的脂蛋白凝聚，或者使HDL以外的脂蛋白外壁的反应性减弱，从而仅仅使这些脂蛋白的外壁选择性地不被破坏，这样就可使HDL中的胆甾醇成为能选择性地进行酶反应的状态。另外，所谓将LDL胆甾醇反应可能化是指，通过使LDL的外壁破坏来使LDL胆甾醇成为能够进行酶反应的状态。另外，所谓仅仅对LDL进行反应阻断是指，相反地使LDL凝聚或者使LDL的外壁的反应性减弱，从而使得仅仅是LDL的外壁选择性地不被破坏，这样就可使LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇成为能够选择性地进行酶反应的状态。
本发明涉及一种LDL胆甾醇的定量法，其特征在于，从含有LDL的试样中除去HDL胆甾醇，然后根据需要，在一种可使LDL胆甾醇反应可能化的试剂的存在下，使其与胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶反应，然后定量由此产生的过氧化氢或还原型辅酶。
另外，根据本发明，可以提供一种用于LDL中的胆甾醇定量的试剂，该试剂以能够对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断的试剂和能使LDL中的胆甾醇反应可能化的试剂作为组成成分，或者可以提供一种用于LDL中的胆甾醇定量的试剂，该试剂由能够对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断的试剂和能使LDL中的胆甾醇反应可能化的试剂组合而成。
另外，根据本发明，还可以提供一种以仅仅对LDL进行反应阻断的试剂作为成分的用于LDL中的胆甾醇定量的试剂，一种以仅仅对LDL进行反应阻断的试剂和可使LDL中的胆甾醇反应可能化的试剂作为成分的用于LDL中的胆甾醇定量的试剂，或者一种由仅仅对LDL进行反应阻断的试剂与可使LDL中的胆甾醇反应可能化的试剂组合而成的用于LDL中的胆甾醇定量的试剂。
作为上述定量法之一，可以举出：在一种能对HDL以外的脂蛋白，即LDL、VLDL和CM进行反应阻断的试剂的存在下，用一种胆甾醇反应试剂使HDL胆甾醇发生特异反应而将其除去后，根据需要，在一种可使LDL胆甾醇反应可能化的试剂的存在下，使其与胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶反应，然后定量分析所产生的过氧化氢或还原型辅酶的方法；另外，作为另一种方法，可以举出：在一种仅仅对LDL进行反应阻断的试剂的存在下，用一种胆甾醇反应试剂将LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇除去之后，使其与胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶反应，然后定量分析由此产生的过氧化氢或还原型辅酶的方法。
例如，在一种能对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断的试剂的存在下，使含有HDL和LDL的试样与胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶反应而生成过氧化氢，在此之后或者同时，向其中加入过氧化氢酶、过氧化物酶与苯胺化合物、过氧化物酶与苯酚化合物或者过氧化物酶与4-氨基安替比林，以除去过氧化氢，然后加入色素源(在使用过氧化氢酶的情况下也添加过氧化物酶)和适当的表面活性剂、环糊精类、或者能与LDL作用的胆甾醇酯水解酶以使其发色，从而能对LDL胆甾醇进行定量。此处，所谓能与LDL作用是指，通过破坏已被阻断反应的LDL的外壁，使LDL胆甾醇成为能进行酶反应的状态。
另外，在一种仅对LDL进行反应阻断的试剂的存在下，向含有LDL的试样中加入胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶和色素源以使其发色，这时，通过测定在LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇发生反应之后的吸光度的变化，即可以对LDL胆甾醇进行定量。
另外，在一种仅对LDL进行反应阻断的试剂(在下述的胆甾醇酯水解酶能仅对LDL进行反应阻断的情况下则不需要)的存在下，使含有LDL的试样与胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶作用而生成过氧化氢，在此之后或同时，向其中加入过氧化氢酶、过氧化物酶与苯胺化合物、过氧化物酶与苯酚化合物或者过氧化物酶与4-氨基安替比林，以除去过氧化氢，然后向其中加入色素源(在使用过氧化氢酶的场合也添加过氧化物酶)和能使LDL胆甾醇反应可能化的试剂(在下述的胆甾醇酯水解酶能使LDL胆甾醇反应可能化的情况下则不需要)、胆甾醇水解酶(由于在最初加入的胆甾醇酯水解酶是能使LDL胆甾醇反应可能化的试剂，因此在能够与LDL胆甾醇反应的情况下就不需要)以使其发色，这时即可对LDL胆甾醇进行定量。
本发明的方法适用于血液、尿等含有LDL的体液。
下面对本发明的定量法举例进行说明。例1
①向规定量的试样中加入一种含有能对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断的试剂的中性附近的缓冲液，例如在37℃下加温数分钟以使LDL、VLDL和CM发后反应阻断；②向其中加入一种与LDL没有反应性的胆甾醇酯水解酶(优选是经化学修饰的胆甾醇酯水解酯)、一种与LDL没有反应性的胆甾醇氧化酶(优选是经化学修饰的胆甾醇氧化酶)〔或者胆甾醇氧化还原酶(优选是经化学修饰的胆甾醇氧化还原酶)〕以及过氧化氢酶、过氧化物酶与苯胺化合物、过氧化物酶与苯酚化合物或过氧化物酶与4-氨基安替比林〔或NAD(P)〕，以使HDL胆甾醇反应而将其除去；③加入表面活性剂、环糊精类、螯合剂、能与LDL反应的胆甾醇酯水解酶(优选是未经化学修饰的胆甾醇脂水解酶)、能与LDL反应的胆甾醇氧化酶(优选是未经化学修饰的胆甾醇氧化酶)或能与LDL反应的胆甾醇氧化还原酶(优选是未经化学修饰的胆甾醇氧化还原酶)和色素源〔在使用胆甾醇氧化还原酶的情况下不添加，或者添加NAD(P)〕并将LDL胆甾醇导入过氧化氢中，从而使其发色〔或者导入NAD(P)中〕；④用分光光度计测定在生成的色素的最大波长处的吸光度〔在使用胆甾醇氧化还原酶的情况下，通过测定在300～500nm，处，优选在330～400nm处，例如在340nm处的吸光度来测定NAD(P)H的增加值(也可以加入心肌黄酶、双偶氮盐来使甲色素发色，通过比色来定量甲色素)〕。此处，所谓与LDL没有反应性是指LDL的外壁没有被破坏，以致于未能使LDL胆甾醇成为能够进行酶反应的状态。LDL胆甾醇的含量可以通过与另外在相同条件下使用含有已知浓度的LDL胆甾醇的标准液进行测定时的吸光度进行比较而算出。应予说明，步骤①和②可以同时进行。
作为能对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断的试剂的一个例子，可以举出凝聚剂和二价金属盐的组合。作为凝聚剂，可以举出：肝素或其盐、磷钨酸或其盐、葡聚糖硫酸或其盐、聚乙二醇、硫酸化环糊精或其盐、硫酸化低聚糖或其盐，或它们的混合物等；作为环糊精，可以举出：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精等；作为低聚糖，可以举出：麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖等；作为盐，可以举出：钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、镁盐等。作为二价金属盐，可以举出：镁盐、钙盐、锰盐、镍盐、钴盐等。
作为凝聚剂，优选是使用0.02～10mM的分子量为5000～20000的肝素或其盐、0.1～10mM的分子量为4000～8000的磷钨或其盐、0.01～5mM的分子量为10000～500000的葡聚糖硫酸或其盐、0.1～20mM的分子量为1000～10000的葡聚糖硫酸或其盐、0.3～100mM的分子量为4000～25000的聚乙二醇(PEG)、0.1～50mM的分子量为1000～3000的硫酸化环糊精或其盐、0.1～50mM的分子量为400～3000的硫酸化低聚糖或其盐，或它们的混合物等。更优选是使用0.03～1mM的分子量为14000～16000的肝素或其盐、0.1～3mM的分子量为5000～7000的磷钨酸或其盐、0.01～5mM的分子量为150000～250000的葡聚糖硫酸或其盐、0.1～10mM的分子量为1000～5000的葡聚糖硫酸或其盐、1.0～50mM的分子量为5000～22000的PEG、0.1～10mM的分子量为1000～2000的硫酸化环糊精或其盐、0.1～10mM分子量为400～2000的硫酸低聚糖或其盐，或它们的混合物等。
作为二价的金属盐，可以举出0.1～50mM的镁盐、钙盐、锰盐、镍盐、钴盐等，优选是使用0.1～50mM的镁盐。
作为能对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断的试剂，也可以使用抗载脂蛋白(APO)B抗体、抗载脂蛋白C抗体等，作为抗载脂蛋白B抗体、抗载脂蛋白C抗体，可以举出通过用人血清精制的载脂蛋白B或载脂蛋白C在家兔体内免疫而获得抗载脂蛋白B抗体血清或抗载脂蛋白C抗体血清，进行硫酸铵沉淀、盐析而获得IgG部分，或者用上述的载脂蛋白B或载脂蛋白C在小鼠体内免疫而获得抗载脂蛋白B单克隆抗体、抗载脂蛋白C单克隆抗体(实验操作入门，安东民卫著，讲谈社サイエンティフイツク，21页，1991年)等。
作为酶，可以举出：通常市售的，由那些具有能使脂甾醇水解的能力的动物、植折或微生物得来的胆甾醇酯酶或脂蛋白脂肪酶，由那些能通过使胆甾醇氧化而生成过氧化氢的动物、植物或微生物得来的胆甾醇氧化酶，由动物、植物或微生物得来的胆甾醇脱氢酶等。为了进一步提高这些酶的特异性、稳定性，也可以使用以聚乙二醇为主成分的基团、以聚丙二醇为主成分的基团、在水溶性低聚糖残基等结构中含有糖类的基团、磺丙基、聚氨酯基等对上述的酶进行化学修饰而获得的酶。另外，按照基因操作获取这些基因，将其导入别的微生物中而产生的酶，或者对这些酶进行化学修饰而获得的修饰体，或者通过改变这些基因而产生的酶或者对这些酶进行化学修饰而获得的修饰体等也可以适用。
作为用于修饰酶的试剂(化学修饰剂)，例如可以举出：由一种能够与氨基键合的基团键合到聚乙二醇上而生成的化合物{由N-羟基琥珀酰亚胺基等可以与氨基键合的基团键合到聚乙二醇上而生成的Sunbright VFM4101〔日本油脂(株)制〕等}、具有聚亚烷基二醇结构和酸酐结构的Sunbright AKM系列、同样的ADM系列、同样的ACM系列〔每一种都为日本油脂(株)制：化学工学论文集，第20卷，第3号，459页，1994年〕、由一种可以与氨基键合的基团键合到聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物上而生成的化合物、聚乙二醇单甲基丙烯酸单甲醚与马来酸酐的共聚物等。另外，作为聚氨酯化学修饰剂的聚氨酯P4000activated(ベ-リンガ-マンハイム社制Enzyme modification set能书)、作为葡聚糖修饰剂的葡聚糖T40，TCT-activated(同)、1，3-丙烷磺内酯等也可以使用。通过这些化学修饰剂就可以使用以聚乙二醇为主成分的基团、以聚丙二醇为主成分的基团、含有聚丙二醇与聚乙二醇的共聚物的基团、在结构中含有糖类的基团、磺丙基、聚氨酯基等来修饰酶。
下面例示用上述化学修饰剂与酶进行反应的方法，但并不受这些方法的限制。首先将酶溶解于一种pH8以上的HEPES缓冲液等的缓冲液中，在0～50℃下添加例如0.01～500倍摩尔量的Sunbright，搅拌5～60分钟。该反应液可以直接使用，或者根据需要，通过限外过滤膜除去低分子物后使用。至于胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶和胆甾醇氧化还原酶的用量，优选使用0.1～100μ/ml。
作为与LDL没有反应性的胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶，优选是通过一些以聚乙二醇为主成分的基团、以聚丙二醇为主成分的基团、在水溶性低聚糖残基等结构中含有糖类的基团、磺丙基、聚氨酯基等对胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶进行化学修饰而生成的酶。
作为可与LDL发生反应的胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原剂，优选是未修饰的胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶，但是一些为了使上述酶稳定化而进行了若干修饰后所生成的酶也可以在仅仅能对LDL发生反应的范围内使用。作为修饰剂，可以举出上述的Sunbright VFM4101〔日本油脂(株)制〕等。作为酶的使用量，优选为0.5～100μ/ml。
作为为了获得与LDL的反应性而使用的表面活性剂，可以举出：トリトン×-100等非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂或阴离子型表面活性剂，其用量可在0.02～10％的范围内。另外，作为为了获得与LDL的反应性而使用的环糊精类，可以举出：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-α-环糊精、二甲基-β-环糊精、二甲基-γ-环糊精、羟丙基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、2，3，6-O-甲基-β-环糊精、聚-β-环糊精等，其用量可在0.1～10％的范围内。另外，作为为了获得与LDL的反应性而使用的螯合剂，优选是使用那些能与镁形成配合物的化合物，具体地可以举出：乙二胺四乙酸(EDTA)类、三乙撑四胺-N，N，N′，N″，N，N-六乙酸(TTHA)、反式1，2-环己烷二胺-N，N，N′，N′四乙酸(CYDTA)-水合物等，其用量可在0.005～2％的范围内。作为成为能够检测出过氧化氢的胆甾醇氧化酶的基质的色素源，一般可以使用的有：4-氨基安替比林与诸如苯酚、4-氯苯酚、间甲酚、3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等的苯酚类的组合物，此外，4-氨基安替比林可与已知作为Trinder试剂(同仁化学研究所第19版总合catalog，1994)的N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)间甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-磺丙基间甲苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基间甲苯胺、N，N-二磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基间甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)间甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺等的苯胺类或者N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N′-琥珀酰基亚乙基二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N′-乙酰基亚乙基二胺等组合使用。另外，作为高灵敏度的色素源，也可以使用在特公昭60-33479中记载的10-(N-甲基氨基甲酰基)-3，7-双(二甲基氨基)吩噻嗪(MCDP)、在特公平4-27839中记载的双〔3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基〕胺(BCMA)、特开昭62-296中记载的色素源等，另外，这些色素源也可以与4-氨基安替比林或上述的Trinder试剂 组合使用。作为色素源的浓度，优选为0.01～10mg/ml，这要受溶解度关系的限制。
另外，在除去HDL时，作为可与过氧化物酶一起使用的苯酚化合物和苯胺化合物，上述的苯酚类和苯胺类也同样地可以使用。
作为缓冲剂，除了磷酸盐之外三羟甲基甲烷缓冲液，Good’s缓冲液等也适合使用，作为其浓度，优选为5～500mM。其PH值以5～9范围内为宜。例2
①将试样加入一种含有抗坏血酸氧化酶的缓冲液中，再向其中添加一种含有与LDL的反应性低的(也就是仅仅对LDL发生反应阻断的)胆甾醇酯水解酶、与LDL的反应性低的胆甾醇氧化酶(或者与LDL的反应性低的胆甾醇氧化还元酶)以及过氧化物酶和色素源〔或NAD(P)〕的试剂。②因为LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇的反应首先结束，所以用分光光度计测定其后的吸光度的变化，与另外在同样条件下使用含有已知浓度的LDL胆甾醇的标准液测定时所获得的吸光度变化进行比较，从而算出LDL胆甾醇的含量。
作为与LDL的反应性低的胆甾醇酯水解酶，优选是经化学修饰的胆甾醇酯水解酶，作为与LDL的反应性低的胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶，经过化学修饰的或未修饰的胆甾醇氧化酶或者经过化学修饰的或未修饰的胆甾醇氧化还原酶都可以使用。作为修饰剂，可以举出上述的Sunbright VFM4101〔日本油脂(株)制〕等。作为酶的使用量，优选为0.5～100μ/ml。
作为色素源和缓冲剂，同样地可以使用在例1中记载的色素源和缓冲剂。例3
①将试样加入一种含有仅对LDL进行反应阻断的试剂(在下述的胆甾醇酯水解酶仅对LDL进行反应阻断的情况下不需要)、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶(或胆甾醇氧化还原酶)以及过氧化氢酶、过氧化物酶与苯胺化合物、过氧化物酶与苯酚化合物或过氧化物酶与4-氨基安替比林〔或NAD(P)〕的缓冲液中，使LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇发生反应而被除去；②加入一种能使LDL胆甾醇反应可能化的试剂(在下述的胆甾醇酯水解酶能使LDL胆甾醇反应可能化的情况下不需要)、胆甾醇酯水解酶(由于最初加入的胆甾醇酯水解酶是一种能使LDL胆甾醇反应可能化的试剂，因此在与LDL胆甾醇仍有反应可能的情况下不需要)和色素源〔或者不添加，或添加NAD(P)〕(在使用过氧化氢酶的情况下也添加过氧化物酶，并将LDL胆甾醇导入过氧化氢中而使其发色〔或者导入NAD(P)H中〕；③用分光光度计测定所生成的色素在最大波长处的吸光度〔在使用胆甾醇氧化还原酶的情况下，以300～500nm处，优选330～400nm处，例如340nm处的吸光度来测定NAD(P)H的增加值(也可以加入心肌黄酶、双偶氮盐来使甲色素发色，通过比色来定量甲色素)〕。LDL胆甾醇的含量，可以通过与另外在相同条件下使用含有已知浓度的LDL胆甾醇的标准液测定时获得的吸光度进行比较而算出。
作为仅对LDL有反应阻断作用的试剂，可以举出仅对LDL有反应阻断作用的胆甾醇酯水解酶等，作为能使LDL胆甾醇反应可能化的试剂，可以举出：能使LDL胆甾醇反应可能化的胆甾醇水解酶、表面活性剂、螯合剂等。
作为表面活性剂和螯合剂，同样地可以使用在例1中记载的表面活性剂和螯合剂。
作为酶，可以举出在例1中记载的酶。
作为仅对LDL有反应阻断作用的胆甾醇酯水解酶，优选是通过向那些由动物、植物或微生物得来的胆甾醇酯水解酶中加入10倍以上摩尔比的化学修饰剂而制成的胆甾醇酯水解酶，除此之外，优选是那些由动物、植物或微生物得来的胆甾醇酯水解酶并具有同样特异性的酶，或者是通过改变其遗传因子而发现的具有同样特异性的酶。具体地可以举出，向一种由假单细胞或色杆菌等微生物得来的胆甾醇酯酶的水溶液中加入10倍以上摩尔比的在例1中记载的化学修饰剂以使其反应而生成的酶等。作为化学修饰剂的摩尔比，优选为10～500倍，这要根据出现特异性的效果与由于修饰而引起的活性降低来决定。另外，作为未经化学修饰的胆甾醇酯水解酶，也可以使用通过以下方法获得的酶，例如使一些由短杆菌得来的脂肪酶的基因序列的一部分发生无规变化，再将其导入另外的微生物中，例如大肠杆菌中而发现并生产出具有酶活性而且仅仅对LDL具有反应阻断作用的胆甾醇酯酶，然后再从其中筛选并进行大量培养和生产而获得的酶。胆甾醇水解酶的用量优选为0.1～100μ/ml。另外，为了提高上述的特异性，可以在①的阶段中，在不导致LDL凝聚的范围内添加：肝素、磷钨酸、葡聚糖硫酸、硫酸化环糊精、硫酸化低聚糖或它们的盐，或者将聚乙二醇与镁盐、钙盐、锰盐、镍盐、钴盐等二价金属盐一起添加。作为环糊精、低聚糖及它们的盐，可以举出在例1中记载的环糊精、低聚糖和它们的盐。
作为能使LDL胆甾醇反应可能化的胆甾醇酯水解酶，优选是未修饰的胆甾醇酯酶，其用量优选为0.5～100μ/ml。
作为胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶，优选是使用由那些可以通过氧化胆甾醇而生成过氧化氢的微生物获得的胆甾醇氧化酶、由动物或微生物得来的胆甾醇脱氢酶，但是为了提高这些酶的特异性和稳定性，也可以利用那些以聚乙二醇为主成分的基团或水溶性的低聚糖残基等对上述的酶进行化学修饰。在此情况下的化学修饰剂的摩尔比，优选为0.1～500倍，这要根据稳定化效果和由于修饰而引起的活性降低来决定。胆甾醇氧化酶和胆甾醇氧化还原酶的使用量优选为0.1～100μ/ml。
下面举例示出使上述化学修饰剂与酶反应的方法，但并不受这些方法的制约。首先将酶溶解于PH8以上的HEPES缓冲液等的缓冲液中，在0～50℃下添加例如规定倍数摩尔量的Sunbright，搅拌1～24小时。将此反应液直接地使用或者根据需要用限外过滤膜除去低分子物后使用。
在除去LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇时，作为与过氧化物酶一起使用的苯酚化合物和苯胺化合物，同样地可以使用上述的苯酚类和苯胺类，作为色素源和缓冲剂，同样地可以使用上述的色素源和缓冲剂。
因为上述本发明的各种体系一般都含有用于测定胆甾醇的体系，所以也可以使用为了更好地使胆甾醇氧化酶活性化而使用的表面活性剂或胆酸类，另外，也可以使用为了使球蛋白等蛋白可溶化的各种盐类。作为表面活性剂，可以使用浓度在0～1％范围内的非离子型、阴离子型、阳离子型表面活性剂；作为胆酸类，可以使用浓度在0～5％范围内的胆酸、去氧胆酸、牛磺胆酸、鹅去氧胆酸等；作为盐类，可以使用浓度在0～100mM范围内的氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、硝酸镁、氯化锂、硫酸银、氯化铵、硫酸锭、氯化钙、硝酸钙、乙酸钙、氯化镍、硝酸镍、乙酸镍、氯化钴、硝酸钴等。
对附图的简单说明
图1表示含有LDL胆甾醇228.4mg/dl血清的稀释倍率与按实施例1的方法测得的吸光度的相关关系。
图2表示使用以超离心法分离获得的HDL、LDL、VLDL以及人血清，按照实施例9的方法用日立7250自动分析仪测得的吸光度与时间过程的关系。
图3表示含有LDL胆甾醇228.4mg/dl血清的稀释倍率与按实施例11的方法测得的吸光度的相关关系。
用于实施本发明的最佳方案
实施例1 LDL胆甾醇的定量
(1)酶的化学修饰
把由假单胞菌得来的胆甾醇酯酶1g溶解于20mM的磷酸缓冲液(pH＝8)100ml中，冷却至5C后，向其中加入Sunbright VFM4101〔日本油脂(株)制〕15g，反应4小时。将该反应液(PEG部分的分子量＝6000)直接作为试剂B的PEG修饰胆甾醇酯酶使用。另外，使用由短杆菌得来的胆甾醇氧化物酶1g和Sunbright VFM4101，0.1g进行与上述同样的反应。直接使用该反应液(PEG部分的分子量＝6000)作为试剂B的PEG修饰胆甾醇氧化物酶。
(2)LDL胆甾醇的定量
试剂A3-吗啉代丙烷
磺酸(MOPS)缓冲剂 20mM(pH＝7)
葡聚糖硫酸 0.7g/l
MgSO4·7H2O 7.5g/l
叠氮化钠 0.1g/l
抗坏血酸氧化酶 3μ/ml
试剂B MOPS缓冲剂 20mM(pH＝7)
过氧化物酶 30μ/ml
PEG修饰的胆甾醇酯酶 1μ/ml
PEG修饰的胆甾醇氧化酶 3μ/ml
胆酸钠 5g/l
EMSE 0.3g/l
试剂C MOPS缓冲剂 20mM(pH＝7)
未修饰的胆甾醇酯酶 2μml
4-氨基安替比林 0.4g/l
把含有LDL胆甾醇228.4mg/dl的血清，①直接地；②用生理食盐水稀释为8/10；③同样地稀释为6/10；④同样地稀释为4/10；⑤同样地稀释为2/10；以及⑥只使用生理食盐水，将它们分别地作为试样进行如下操作。
将试样20μl添加到试剂A2.25ml中，在37℃下保温5分钟，然后添加试剂B0.75ml，在37℃下保温5分钟，以除去HDL胆甾醇，这时，测定试样在555nm处的吸光度(EI)。然后，添加试剂C0.75ml，在37℃下保温5分钟后，测定试样在波长555nm处的吸光度(E2)。LDL胆甾醇的浓度是通过使用一种胆甾醇浓度已知为200mg/dl的标准液进行同样的操作，再通过将其与(E2-E1)×稀释倍率所获的数值进行比较而算出。其中，所谓稀释倍率是指(试剂A+试剂B)/(试剂A+试验B+试剂C)的体积比。
使用含有LDL胆甾醇228.4mg/dl的血清获得的结果示于图1中。
实施例2
使用在实施例1的②中记载的试剂B和试剂C，把在试剂A中使用的凝聚剂和二价金属盐改变为下述各种组合物，使用日立7070自动分析仪(条件为：试样4μl、试剂A，270μl、试剂B，90μl、试剂C，90μl)分别测定各个血清试样。另一方面，使用日立RPL 42Tロ-タ-，按照“医学あゅみ，第94卷(第8号)，359页，1975年”中记载的方法(超离心法)定量分析LDL胆甾醇。其结果如表1所示，每一个结果都和用超离心法获得的数值非常一致。
甲
磷钨酸 10mg/ml
MgSO4·7H2O 7.5mg/ml
乙
葡聚糖硫酸钠(MW＝4000) 1mg/ml
MgSO4·7H2O 10mg/ml
丙
肝素钠 10mg/ml
CaCl2·2H2O 10mg/ml
丁
PEG20000 50mg/ml
MgSO4·7H2O 5mg/ml
戊
磷钨酸 10mg/ml
葡聚糖硫酸钠(MW＝200000) 7.5mg/ml
MgSO4·7H2O 7.5mg/ml
己
磷钨酸 10mg/ml
肝素钠 7.5mg/ml
MgSO4·7H2O 7.5mg/ml
庚
磷钨酸 10mg/ml
PEG6000 7.5mg/ml
MgSO4·7H2O 7.5mg/ml
表1试剂A测定值甲乙丙丁戊己庚超离心法177.7mg/dl178.9mg/dl178.1mg/dl177.2mg/dl179.0mg/dl178.8mg/dl176.5mg/dl178.4mg/dl
实施例3
使用Sunbright AKM1511〔日本油脂(株)制〕、聚氨酯P4000activated (ベ-リンガ-マンハイム社制)或葡聚糖T40，TCT-activated(ベ-リンガ-マンハイム社制)代替Sunbright VFM4101，与实施例1的(1)同样地对酶进行化学修饰。使用实施例1的(2)中记载的试剂A和试剂C，使用上述获得的化学修饰酵素代替试剂B中的PEG修饰胆甾醇酯酶和PEG修饰胆甾醇氧化酶，与实施例2同样地测定在实施例2中使用的血清试样。其结果分别为178.0mg/dl、179.1mg/dl、179.8mg/dl，这些结果皆与按超离心法获得的数值很一致。
实施例4
使用实施例1的②中记载的试剂A，使用浓度为300μ/ml的过氧化氢酶代替试剂B中的过氧化物酶，使用在试剂C中加有30μ/ml的过氧化物酶作为试剂C，与实施例2同样地测定在实施例2中使用的血清试样。其结果为178.6mg/dl，该数值与按超离心法获得的数值很一致。
实施例5
使用在实施例1的(2)中记载的试剂A和试剂C，使用相同浓度的TOOS(测定波长555nm)、DAOS(测定波长593nm)、MAOS(测定波长630nm)或TOPS(测定波长550nm)代替试剂B中的EMSE，与实施例2同样地测定在实施例2中使用的血清试样。其结果分别为177.9mg/dl、177.8mg/dl、179.2mg/dl、178.8mg/dl，这些数值与按超离心法获得的数值很一致。
实施例6
使用实施例1的(2)中记载的试剂A和试剂B，使用浓度为0.1mg/ml的MCDP(测定波长666nm)或BCMA(测定波长755nm)代替试剂C中的4-氨基安替比林，与实施例2同样地测定在实施例2中使用的血清试样。获得结果分别为178.3mg/dl、179.0mg/dl，这些数值与按超离心法所获的数值很一致。
实施例7
使用在实施例1的(2)中记载的试剂A和试剂B，使用浓度为20mg/ml的二甲基-β-环糊精代替试剂C中的未修饰胆甾醇酯酶，与实施例2同样地测定在实施例2中使用的血清试样。其结果为177.4mg/dl，该数值与按超离心法获得的数值很一致。
实施例8
把在实施例1的(2)中记载的试剂A和试剂B按3∶1的比例混合并将其作为试剂D，向该溶液3ml中加入在实施例2中使用的血清试样20μl，在37℃下保温5分钟，这时测定该试样在555nm处的吸光度(E1)。接着，加入试剂C0.75ml，在37下保温5分钟后测定该试样在波长555nm处的吸光度(E2)。使用胆甾醇浓度已知为200mg/dl的标准液进行同样的操作，通过与(E2-E1)×稀释倍率所获数值进行比较而算出LDL胆甾醇的浓度。其中，所谓稀释倍率是指(试剂D)/(试剂D+试剂C)的体积比。其结果为177.6mg/dl，该数值与按超离心法获得的数值很一致。
实施例9
试剂A MOPS缓冲剂 10mM(pH＝7)
硫酸钠 2mg/ml
EMSE 0.3mg/ml
抗坏血酸氧化酶 3μ/ml
试剂B MOPS缓冲剂 10mM(pH＝7)
4-氨基安替比林 0.5mg/ml
胆酸钠 3mg/ml
PEG修饰的胆甾醇酯酶 5μ/ml
未修饰的胆甾醇氧化酶 7μ/ml
过氧化物酶 10μ/ml
作为PEG修饰的胆甾醇酯酶，使用与实施例1同样的酶。
使用上述的试剂，使用日立7250自动分析仪测定在实施例2中使用的血清试样。测定在添加试剂B后3.5分钟至5分钟之间的吸光度变化(E3)。使用一种胆甾醇浓度为200mg/dl的标准液进行同样的操作(E4)，通过E3与E4值的比较算出LDL胆甾醇的浓度。其结果为178.6mg/dl，该数值与按超离心法获得的数值很一致。
应说明，图2中示出了按离心法分离的HDL、LDL、VLDL和人血清的时间过程。
实施例10
试剂A MOPS缓冲剂 10mM(pH＝7)
葡聚糖硫酸钠(Mw＝500000) 0.5mg/ml
MgSO4·7H2O 5mg/ml
EMSE 0.3mg/ml
过氧化物酶 10μ/ml
PEG修饰的胆甾醇酯酶 2μ/ml
未修饰的胆甾醇氧化酶 3μ/ml
抗坏血酸氧化酶 3μ/ml
B试剂 MOPS缓冲剂 10mM(pH＝7)
4-氨基安替比林 0.5mg/ml
トリトン×-100 3mg/ml
EDTA·4Na 5μ/ml
作为PEG修饰的胆甾醇酯酶，使用与实施例1同样的酶。
使用上述的试剂，使用日立7250自动分析仪测定在实施例2中使用的血清试样(E5)。使用一种胆甾醇浓度为200mg/dl的标准液进行同样的操作(E6)，通过E5与E6数值的比较算出LDL胆甾醇的浓度。其结果为177.3mg/dl，该数值与按超离心法获得的数值很一致。应说明，自动分析仪的测光点是在添加试剂B5分钟之后。
实施例11
(1)酶的化学修饰
将一种由假单胞菌获得的胆甾醇酯酶1g溶解于20mM的磷酸缓冲液(pH＝8)100ml中，冷却至15℃后，向其中添加SunbrightVFM4101〔日本油脂(株)制〕25g，使其反应4小时。直接使用该反应液(PEG部分的分子量＝6000)作为试剂B的PEG修饰的胆甾醇酯酶。另外，使用一种由短杆菌得来的胆甾醇氧化酶1g和Sunbright VFM4101 0.5g进行与上述同样的反应。直接使用该反应液(PEG部分的分子量＝6000)作为试剂A的PFG修饰的胆甾醇氧化酶。
(2)LDL胆甾醇的定量
试剂A MOPS缓冲剂 20mM(pH＝7)
MgSO4·7H2O 2g/l
过氧化物酶 30μ/ml
PEG修饰的胆甾醇酯酶 2μ/ml
PEG修饰的胆甾醇氧化酶 5μ/ml
胆酸钠 1g/l
EMSM 0.3g/l
抗坏血酸氧化酶 3μ/ml
试剂B MOPS缓冲剂 20mM(pH＝7)
未修饰的胆甾醇酯酶 3μ/ml
4-氨基安替比林 0.4g/l
将一种按离心法测得含有LDL胆甾醇228.4mg/dl的血清，①直接地；②用生理食盐水稀释为8/10；③同样地稀释为6/10；④同样地稀释为4/10；⑤同样地稀释为2/10；以及⑥只使用生理食盐水，将它们分别地作为试样进行如下操作。
将试样20μl添加到试剂A2.25ml中，在37℃下保温5分钟以除去LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇。然后添加试剂B0.75ml，在37℃下保温5分钟后测定在波长600nm处的吸光度。所获结果示于图3中。
另一方面，向一种预先将试剂A与试剂B按3∶1的比例混合而成的液体中添加一种含有胆甾醇200mg/dl的标准液20μl，在37℃下培养5分钟后，根据在600nm处测得的吸光度算出上述血清试样中的LDL胆甾醇浓度，所获结果为229.7mg/dl，该数值与按离心法获得的数值很一致。
实施例12
使用在实施例11的(2)中记载的试剂B，向试剂A中加入下列各种组合的凝聚剂和二价金属盐并将其作为试剂A使用，使用日立7070自动分析仪(条件为：试样4μl、试剂A，270μl、试剂B，90μl)分别测定在实施例11的(2)中使用的血清试样。另一方面，使用日立RPL 42Tロ-タ-，按照“现代医疗，第23卷(第1号)，113页，1991年”记载的方法(超离心法)定量分析LDL胆甾醇。其结果如表2所示，每一个结果都与按离心法获得的数值很一致。
甲 磷钨酸 0.1mg/ml
MgSO4·7H2O 1mg/ml
乙 葡聚糖硫酸钠(Mw＝20000) 0.1mg/ml
MgSO4·7H2O 2mg/ml
丙 肝素钠 0.3mg/ml
CaCl2·2H2O 3mg/ml
丁 PEG20000 20mg/ml
MgSO4·7H2O 3mg/ml
戊 磷钨酸 0.1mg/ml
葡聚糖硫酸钠(Mw＝200000) 0.1mg/ml
MgSO4·7H2O 2mg/ml
己 磷钨酸 0.1mg/ml
肝素钠 0.1mg/ml
MgSO4·7H2O 2mg/ml
庚 葡聚糖硫酸(Mw＝500000) 0.1mg/ml
PEG6000 5mg/ml
MgSO4·7H2O 2mg/ml
表2 试剂A 测定值 甲 224.5mg/dl 乙 229.1mg/dl 丙 226.6mg/dl 丁 227.3mg/dl 戊 227.0mg/dl 己 230.8mg/dl 庚 225.9mg/dl 超离心法 228.4mg/dl
实施例13
使用Sunbright AKM1511〔日本油脂(株)制〕、聚氨酯P4000activated(ベ一リンガ-マンハイム社制)或葡聚糖T40，TCT-activated(ベ-リンガ-マンハイム社制)代替Sunbright VFM410，与实施例11(1)同样地对酶进行化学修饰。使用实施例11(2)中记载的试剂B，使用按上述方法获得的化学修饰酶代替试剂A中的PEG修饰胆甾醇酯酶和PEG修饰胆甾醇氧化酶，与实施例11(2)同样地测定实施例11(2)中使用的血清试样。其结果分别为228.0mg/dl，229.1mg/dl，226.8mg/dl，这些数值与按离心法获得的数值很一致。
实施例14
使用浓度为300μ/ml的过氧化氢酶代替在实施例11(2)中记载的试剂A中的过氧化物酶，向试剂B中加入过氧化物酶300μ/ml和叠氮化钠0.5mg/ml，与实施例11(2)同样地测定在实施例11(2)中使用的血清试样。其结果为228.6mg/dl，该数值与按超离心法获得的数值很一致。
实施例15
使用在实施例11(2)中记载的试剂B，使用同样浓度的TOOS(测定波长555nm)、DAOS(测定波长593nm)、MAOS(测定波长630nm)或TOPS(测定波长550nm)代替试剂A中的EMSE，与实施例11(2)同样地测定在实施例11(2)中使用的血清试样。其结果分别为227.9mg/dl、227.4mg/dl、225.2mg/dl、224.8mg/dl，这些数值与按超离心法获得的数值很一致。
实施例16
删去在实施例11(2)中记载的试剂A中的EMS，使用浓度为0.1mg/ml的MCDP(测定波长666nm)或BCMA硫酸盐(测定波长755nm)，与实施例11(2)同样地测定实施例11(2)中使用的血清试样。其结果分别为228.3mg/dl、229.0mg/dl，这些数值与超离心法获得的数值很一致。
实施例17
使用实施例11(2)中记载的试剂A，向试剂B中加入聚氧乙烯单月桂酸酯5mg/ml、トリトンX-100，5mg/ml或十二烷基苯磺酸钠1mg/ml，与实施例11(2)同样地测定在实施例11(2)中使用的血清试样。在反应3分钟结束后，获得的结果分别为228.6mg/dl、226.1mg/dl、227.0mg/dl，这些数值与按离心法获得的数值很一致。
实施例18
使用实施例11(2)中记载的试剂A，使用聚氧乙烯单月桂酸酯5mg/ml、トリトンX-100，5mg/ml或十二烷基苯磺酸钠1mg/ml代替试剂B中未修饰的胆甾醇酯酶，与实施例11(2)同样地测定在实施例11(2)中使用的血清试样。反应在3分钟内结束，其结果分别为227.9mg/dl、229.2mg/dl、226.1mg/dl，这些数值与按超离心法获得的数值很一致。
实施例19
使用实施例11(2)中记载的试剂B，使用相同浓度的去氧胆酸或牛磺胆酸代替试剂A中的胆酸，与实施例11(2)同样地测定实施例11(2)中使用的血清试样。其结果分别为229.9mg/dl、225.7mg/dl，这些数值与按超离心法获得的数值很一致。
根据本发明，可以提供一种不需要烦杂的分离操作即可简便地定量LDL胆甾醇的方法。