本发明涉及对细胞繁殖有抑制作用的肽类並涉及有特定的和/或有一般抑制作用的新肽类化合物。 哺乳动物体含有庞大的形形色色的不同结构和功能的细胞，分化和发育的机理也是大量研究的焦点。大家知道，对有不断更新的细胞系统来说，这种机理普通包括多能干细胞贮存库，这种干细胞分裂并恒定的向细胞系统提供新细胞。而起初由“贮存库”供给均一的干细胞，不久就定向变到这种或那种形态，以后发展成所要求功能的细胞。
这种干细胞系统的例子是骨髓造血系统和上皮表皮系统。
以前已经报告，相应于范围小的一般式的肽类可能抑制造血系统（参见EP-A-0112656），而相应于范围稍大的一般式的并通过二硫桥键相连的一组二聚肽类可刺激造血系统（参见WO88/03535）。然而，一般认为上述两种情况下除造血以外未观察到其他作用。
现在我们意外的发现，某些包括在EP-A-0112656中揭示的一类肽对抑制细胞繁殖有更普遍的作用，对氨基酸序列和/或关键侧链残基的保护做修改，可使肽的作用转向特定的重要系统。
我们的发现是基于如下观察，在上述我们的专利申请中揭示地某些五肽的序列存在于某些所谓G-蛋白即Gai蛋白中，在细胞内壁发现G蛋白，并在透膜受体和在细胞内靠近G蛋白的效应器之间提供重要连接。依据与之相联系的效应器，它们涉及许多细胞功能，它由3个相连的亚单位，α、β和γ组成，α-亚单位与活化毗连效应器有关。起初由其功能表示G蛋白的特征，原先发现那些Gi蛋白亚群抑制腺苷酸环化酶。这一发现导致普遍的认为这些肽在抑制上皮、表皮系统和细胞系统增殖有作用。
根据本发明，我们提供式（Ⅰ）中化合物（用以制备抑制非造血细胞繁殖的药剂）。
其中Ra代表
Rb代表
Rc代表
Rd代表
Re代表
以及Rf代表
（其中n和m独立的代表0或1;
p和q分别代表1或2;
R1和R2两者是氢原子或一起代表氧;
R3和R4两者是氢原子或一起代表碳-碳键;
R5是氢或酰基;
R6和R7独立的代表一个羟基或一个氨基;
R8代表氢;C2-6烷基;C7-20芳烷基，这些芳烷上可以带1个或多个羟基，氨基或甲氧基;或代谢下不稳定的S-保护基;
R9代表氢或甲基;
R10代表羟基或氨基。为制备抑制非造血细胞增殖的药品时氨基酸谷氨酰胺的残基或有N-末端谷氨酰氨单位的肽;除丙氨酸（可以用D-或L-型）及甘氨酸外，所有那些氨基酸残基都是L-型。
如上所述N-末端有保护基R5，它可能是有1-20个碳原子的酰基，例如有1-5个碳原子的低烷酰基像乙酰基，或有7-20个碳原子的芳酰基或芳烷酰基像苯甲酰基或苯乙酰基。
R5也可以是由一个氨基酸或一个肽链衍生的酰基。特别是R5可是由丝氨酸或肽衍生的酰基，该肽来自除去连续的N-末端氨基酸的下面氨基酸序列：LysIle-Ile-His-Glu-Asp-Gly-Tyr-Ser。
正如下面详细解释的，有上述序列或其部分有上述序列的肽类高度的同源于Gia蛋白，已知该蛋白控制许多细胞功能，包括抑制生长。式Ⅰ中包括的所有肽的末端氨基最好用像烷酰基，芳烷酰基或芳酰基的酰化加以保护。
当R8是C2-6的烷基，例如它可是乙基，丁基或己基。当R8是芳烷基时，适宜为芳甲基如苄基，二苯甲基或三苯甲基。当R8是代谢不稳定的基团，例如这可是有5-10个碳原子的芳硫基，如吡啶硫基或如上述的酰基。
本发明中的化合物更合意的是五肽，更确切的说更可取的是n等于0。
在Ra为环状基时最好为五元环，更确切地说m最好是0。
本发明中的五肽抑制广泛的各种细胞繁殖，（除造血系统外）在医学上是有价值的，其中过量的细胞繁殖需要治疗，如牛皮癣，或癌治疗中很可能是损伤特殊细胞群。很多类型的细胞对在抗癌治疗中应用的细胞毒药物或放射治疗是特别敏感的，一个已知的技术是应用药物抑制细胞繁殖，如在抗癌治疗期间造血系统的细胞繁殖，随后在抑制药物消失时，正常细胞繁殖恢复。本发明中的肽类对这种治疗表现出有恰当短的生物半衰期。同样，某些对癌治疗敏感的细胞群的繁殖与癌细胞本身一起被抑制。在癌细胞达到繁殖的敏感时期而正常细胞不太敏感时抗癌疗效才开始。
在治疗期间当像骨髓细胞，吞噬细胞或粒细胞受到CSF药物刺激时，某一类型的细胞繁殖就产生了。对细胞生长的抑制可以把这种细胞恢复到正常生长状态。
许多自身免疫病，即产生抗自身组织的活性白细胞。通过抑制白细胞的功能（至少暂时地）可相应的减低这种自身免疫反应。
通过影响Gai蛋白内转移细胞信号机理，由Gai蛋白控制的其他功能可被活性肽调节，例如钙代谢细胞移动，胞浆细胞过程亦被Gai蛋白调解。
因此本发明也可提供含全部或部分序列大体上与上面讨论的Gai蛋白相似的新多肽，这些序列为……Lys-Ile-Ile-His-Glu-Asp-Gly-Tyr-Ser-Ra′-Rb-Rc-RJReRI-Gln-Tyr……或其部分或稍微有些变化，如在Ann.Rev.Biochem.56PP.624-625（1987）和Proc.Natl.Acad Sci.USA 85 PP.3066-3070（1988）中所叙述的。这样的序列至少含一个Tyr残基更可取，以便有助于多肽的标记。如下面说明的，N-末端NH2受到保护更好，如上面讨论的N-乙酰化。在上述相应的序列中，N-末端氨基酸残基可能是Glu，这也可有利于被P-Glu置换。
这种多肽将看做为式（Ⅰa）的化合物，也可像上面规定的那样表示为式（Ⅰ）的化合物，其中R5是由丝氨酸残基或有C-末端丝氨酸单位衍生的酰基，和/或R10是氨基酸谷氨酰氨残基或有N-末端谷氨酰氨单位的肽。这些多肽含总数达12个氨基酸更好，最好是10个或少于10个。
一般说来，可取的是，任何所加的肽序列中的N-末端NH2应当通过酰化受到保护。这有助于避免肽的酶降低。式（Ⅰ）中允许的大多数Ra残基对增加没有脱保护的氨基酸或类似的转化成游离NH2基是不适宜的。因此，当R5是一个酰基而不是由氨基酸或肽衍生的酰基时，将需要脱酰化。类似地，R1和R2一起形成一个氧代基，做为P-Glu中的单位需要转变成相应的开链残基如Glu或Gln。
本发明利用肽的作用，通过Gai-蛋白作用于细胞浆的过程。
在我们较早期的欧洲专利No112656的说明书中描述的那些化合物，已在以前做为有许多医学用途的化合物而叙述过了。上述式Ⅰ中的所有其他化合物既是新的又是仅做为中间体。因此，根据本发明的进一步特征，我们提供了上面规定的式（Ⅰ）中的化合物，这不同于用做控制细胞繁殖的化合物。
pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys
pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys
pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys
pGlu-Glu-Asp-Cys-Gly-Lys
pGlu-Glu-Asp-Cys-Ala-Lys
pGlu-Glu-Asp-Cys-LysNH2
由上面式（Ⅰ）中选择一些肽是新的，并已发现具有特别合乎需要的组合性质。根据本发明的一个方面我们提供了式（Ⅱ）的化合物，
其中Ra，Rb，Rc，Re，Rf以及n如式Ⅰ中规定的。R11是C2-6的烷基或C7-20的可带一个或多个羟基，氨基或甲基取代基的芳烷基，所有的氨基酸就像对式（Ⅰ）规定的是手性型的。根据这个式子特别可取的化合物是
pGlu-Glu-Asp-Benzylcys-Lys
pGlu-Ala-Asp-Benzylcys-Lys
已发现有这种类型被保护的半胱氨酸残基的化合物能改善体内的稳定性，并保持细胞繁殖抑制的活性。
可制备上述苄基半胱胺酸化合物的类似物，其中苯取代是较稳定的，如在4-位以苯丙氨酸基代替半胱氨酸基的化合物。根据本发明的另一方面的叙述，我们提供式（Ⅲ）的化合物。
其中Ra，Rb，Rc，Re，Rf和n的定义如式（Ⅰ），所有的氨基酸就像对式（Ⅰ）所叙述的都是手性型。这样一些化合物也保持了体内活性，特别可取的例子是pGlu-Glu-Asp-Phe-Lys及pGlu-Gly-Asp-Phe-Lys
对比起来，可制备具有代谢不稳定保护基的肽，以便在体内达到慢慢释放未保护的肽。根据本发明的进一步的叙述，我们提供式（Ⅳ）中的化合物
其中Ra，Rb，Rc，Re，Rf和n如式Ⅰ所规定，R12是代谢不稳定的基团，例如2-吡啶硫基，所有的氨基酸就像对式（Ⅰ）规定的是手性型的。更可取的化合物是pGlu-Glu-Asp-（2-吡啶基-二硫半胱氨酸基）-Lys，发现该化合物对造血系统有延迟抑制作用，即体内给药3天以后发生作用，而没有保护的类似物是1天。
除造血系统外，通过稍加修改氨基酸序列，特别是Glu2被Gly2取代就可达到抑制白细胞功能（包括免疫功能）。因此，根据本发明的进一步特征我们提供了式（Ⅴ）的化合物，
其中Ra，Rc，Rd，Re，Rf和n如式（Ⅰ）所规定，所有的氨基酸残基如对式（Ⅰ）规定的一样是性型。式Ⅴ中较好的化合物是PGlu-Gly-Asp-Phe-Lys及pGlu-Gly-Asp-Cys-Lys，其中发现后者除对造血系统抑制外还抑制体内粒细胞和巨噬细胞移动（对豚鼠形成皮肤窗和BCG局部刺激），在体外抑制粒细胞对金黄葡萄球菌的摄取（由流式细胞光度计计数测定）。
通过以丝氨酸残基取代4位的半胱氨酸残基而制备的一组肽，完全没有造血系统的抑制作用而被替代的是对表皮和上皮细胞繁殖的抑制。
根据本发明这类化合物有式（Ⅵ）
其中Ra，Rb，Rc，Re，Rf和n像式Ⅰ所规定的，所有氨基酸的手性型亦像对式（Ⅰ）所叙述的;较好的化合物是
pGlu-Glu-Asp-Ser-Lys
pGlu-Asp-Glu-Ser-Lys
pGlu-Glu-Glu-Ser-Lys.
在选择性的细胞抑制治疗恶性造血细胞时这些化合物在非造血细胞增殖抑制方面有极大的用途，同时对晚期鳞癌病例及牛皮癣的恶性表皮及上皮细胞繁殖也有抑制作用。
最后，可应用本发明的肽通过把分子偶联到该肽链上以把其他分子作为靶目标。因此我们提出：
a）用于治疗、诊断或用于由放射性同位素或放射性标记的配基组成的化合物，直接或间接的以共价键连于本发明的肽用于分析测定;
b）用于包括细胞毒配位基的化合物以共价连于本发明的肽;以及
c）用于诊断或检测包含荧光素配位基的分析的化合物以共价连接于本发明的肽
一般说来，为了发挥对细胞毒药物的防护作用，本发明的肽类药物，剂量以1-10ng注射给病人，例如70公斤体重每天给4-5ng。如果通过静脉输注或类似的技术，每70公斤体重剂量可为30-300ng，例如6天大约为100ng。大体上说，在病人细胞外液内产生肽的浓度大约为10-11M-10-7M是合乎需要的。
一般说来，与细胞毒药物如阿糖胞苷合并治疗，需要仔细选择时间以保证在细胞毒药物仍然存在时保护骨髓系统。
根据本发明的更进一步的特征提供药物组合物包括，式（Ⅰa），（Ⅱ），（Ⅲ），（Ⅳ），（Ⅴ），或（Ⅵ）中像前面规定的至少一个化合物或其生理适合的盐做为活性成分，并与药物载体或赋形剂混合。例如根据本发明，组合物的剂型可适合于口服，滴鼻，非肠道给药或直肠给药。
这里正像过去常常说的，术语“药物”包括本发明在兽医方面的应用。
按照本发明中的化合物可提出常规给药的药物剂型，如片剂，包衣片剂，鼻喷雾剂，溶液，乳剂，粉剂，胶囊或缓释剂型，为制备这些剂型，可使用常规的赋形剂及通常的生产方法。例如生产片剂可将活性成分或用已知赋形剂与活性成分混合，这些赋形剂如稀释剂，像碳酸钙，磷酸钙或乳糖，崩解剂如玉米淀粉或藻酸，粘合剂如淀粉或明胶，润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉，和/或获得的持续释放的剂型如由羧基聚亚甲基，羧甲基纤维素，醋酸磷苯二甲酸纤维素制备。
这些片剂可按需要由几层组成。可用片心包衣生产包衣片，这种片心是用类似制片的方法得到的，普通用的片剂包衣剂如聚乙烯吡咯烷酮或紫胶，阿拉伯胶，滑石粉，氧化钛或糖。为了得到持续性释放剂或避免配伍禁忌，片心也可由几层构成。为了得到持续释放剂包衣片也可由几层组成，在上面提到的那种赋形剂的情况也可用于片剂。
可用常规法生产注射液，如加防腐剂像对-羟基苯甲酸酯，或加稳定剂如EDTA。然后将溶液充入注射用瓶或安瓿。可以通过所谓微型泵来提供延迟型释放注射剂。
鼻喷雾剂可类似地调成水溶液装入喷雾器用气溶胶推进剂或提供手压的方法。含有一个或几个活性成分的胶囊的生产是，把活性成分与惰性载体如乳糖或山梨糖相混合，然后将混合物填装入明胶胶囊。
例如，合宜的栓剂的生产是通过混合活性成分或活性成分与常规的为这种目的的设计的载体如天然脂或聚乙二醇或其衍生物。
所含本发明化合物的剂量单位含1-10mg较好，例如4-5mg的肽。
本发明中的肽可以用任何方便的方法合成。一般说来，存在的活性侧链基（氨基，巯和/或羧基）在整个偶联反应时应当保护，但在整个合成步骤中，留下某些侧链基不保护也是可能的（如羟基，咪唑基，一级酰胺基，如像PyroGlu的环氨基酸的酰氨基）。
最后一步将是通式Ⅰ中整个或部分保护的肽衍生物的去保护，这样的过程就形成本发明的更进一步的方面。
在制备肽链时，原则上可以在C-末端或在N-末端开始，虽然只有C-末端开始的步骤常用。
因此，可通过像赖氨酸适宜保护的衍生物与适当保护的半胱氨酸衍生物的反应在C-末端开始。赖氨酸衍生物有一个游离的α-氨基，而其他的反应物有游离的或活化的羧基和一个保护的氨基。偶联以后，中间体可以通过层析法纯化，然后N-去保护以使加入另一个N-保护基团及游离或活化的氨基羧残基。这一步继续下去，直至要求的氨基酸序列完成。
可应用的羧基活化取代物包括对称的或混合的酸酐，或活化的酯如像对-硝基苯酯，2，4，5-三氯苯酯，N-羟基苯并三唑酯（OBt），N-羟基琥珀酰亚氨基酯（OSu）或五氟苯酯（OPFP）。
例如游离氨基和羧基的偶联可应用二环己基碳二亚胺（DCC）来实现。可应用的其他偶联剂是，N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉（EEDQ）。
一般说来在低温及适当的溶剂系统实现偶联反应是方便的，例如-20℃至室温，溶剂可为四氢呋喃，二氧杂环己烷，二甲基甲酰氨，二氯甲烷或这些溶剂的混合物。
在固相树脂支撑物上进行合成是更为方便的。氯甲基化的聚苯乙烯（用1%二乙烯苯交联）是支撑物的一种有用类型;在这种情况下，合成从C-末端开始，例如把N-保护的赖氨酸偶联到支撑物上。
许多适宜的固相技术在以下的作者杂志中叙述过：Eric Alherton，Christopher J.Logun，和Robert C.Sheppard，J，Chem.Soc.Perkin I，538-46（1981）;Jomes P.Tam，Foe S.Tjoeng，和R.B.Merrified J.Am.Chem.Soc.102，6117-27（1980）;James P.Tom，Richard D.Dimarchi和R.B.Merrifield Int.J.Peptide Protein Res 16 412-25（1980）;Manfred Mutter和Dieter Bellof，Helvetica Chimica Acta 67 2009-16（1984）。
已知氨基酸的保护基有广泛选择的余地，并得到下列作者的证明：Schroder.E，和Lubke，K.肽类（The Peptides），卷1和卷2，学术出版社（Academic Press），纽约和伦敦，1965和1966;Pettit，G.R.合成肽类（Synthelic Peptides），卷1-4，van Nostrand，Reinhold，New York 1970，1971，1975和1976;Houben-Weyl Methoden der Organischen Chemie，Synthese von Peptiden（肽的合成）15卷，Georg Thiemie，Synthese von Peptidem（肽的合成）15卷，Georg Thieme Verlug Stuttgart，Ny，1983;肽类分析、合成、生物学1-7，Ed：Erhard Gross，Johannes Meienhofer，Academie Press，纽约，旧金山，伦敦;固相肽合成znd ed.，John M.SOWut，Janis D，young，皮尔斯化学公司（Pierce Chemical Cnmpany.）。
例如可应用的氨保护基包括，像苄氧羰基（z-），叔-丁氧羰基（Boc-），4-甲氧基-2，3，6-三甲苯磺酰基（Mtr），9-芴基甲氧羰基（Emoc），应当重视的是，在由c-末端制备肽时，每一个新加的氨基酸的α-氨基是保护着的，并且在下一步偶联以前必须选择性除掉，对这种临时性氨基保护基特别有用的保护基是Fmoc（9-芴基甲氧羰基），这种保护基可以在有机溶剂中用哌啶处理就可选择性的除掉。
例如应用的羧基保护基包括容易裂开的酯基，如苄基（-OBzl），对-硝基苄基（-ONB），或叔-丁基（-toBu）以及偶联在固体支撑物上，例如甲基连到聚苯乙烯。
巯保护基包括对-甲氧苄基（Mob），三苯甲基（Trt），乙酰氨基甲基（Acm）。
广泛存在的其它这种基团，例如在上面参考文献叙述的细节及在上文对所有这样基团的应用的叙述过程全属于本发明的范畴。
除掉氨基保护基和羧基保护基的方法广泛存在。然而，这必须与使用的合成策略一致，在下一步偶联以前，侧链保护基对用于除去临时α-氨基保护基的条件必须是稳定的。
氨保护基如Boc（叔-丁氧羰基）和酸基保护基如toBu（前已说明）可用像三氟醋酸这样的酸处理而同时除掉。巯保护基如Trt可用氧化剂如碘选择性除掉。
含半胱氨酸的肽可用本文叙述的方法合成，以除掉所有的保护基包括巯保护基做为最后合成一步。
下面给出的例子只是做为举例。
市售溶剂重蒸并按下法储存：二甲基甲酰氨（DMF）在4A分子筛，二氯甲烷（DCM）在Cacl2，三乙胺（TEA）经NNa/pb合金（烘炉），三氟醋酸（TFA）经4A分子筛上储藏。TLC系统如下：
S1：硅胶/CHCl3∶MeOH（98∶2）
S2：硅胶/CHCl3∶MeOH（95∶5）
S3：硅胶RP8/0.1%TFA在5%EtOH（水溶液）纯化的最终产物用逆相高效液相层析（HPLC）来分析。HPLC系统由HP1090M色谱仪装有自动进样器和一批HP1040二极管（Hewlett-Packard，Waldbronn，FRG）及Supelcosil LC-18柱（250×4.6mm，5μ颗粒）组成。将样品溶于0.1%（V/V）TFA（水溶液），用从0-30%的0.1%TEA（水溶液）乙腈的线性梯度溶液洗脱。流速为2ml/分。洗脱液用在214nm的4nm谱带宽度来检测。在电子方面减去溶剂色谱吸收，得到的结果用百分数来表示。
氨基酸分析：
含半胱氨酸的肽用过甲酸氧化转成酸不稳定的半胱氨酸基，再转成酸稳定的磺基丙酸，然后在6MHCl110℃水解16小时。用硫代异腈酸苯酯使无水水解产物衍生物化和用Heinrikson（Anal、Bioch.136，65-74，1984）叙述的方法分析。
实例1
L-焦谷氨酰基-L-谷氨酰基-L-天冬氨酰基-L-半胱氨酰基-L-赖氨酸：化合物（1）
（a）t-Boc（S-对-甲氧基苄基）-L-半胱氨酰基-（ε-苄氧羰基-L-赖氨酸苄酯（Ⅰ）
把ε-苄氧羰基赖氨酸苄酯盐酸盐（406mg）溶于3mlDMF中，加TEA直到在气相用一片湿PH试纸检测出有游离的TEA为止。向这个溶液加溶在3ml DMF中的t-Boc-（S-P-甲氧苄基）-L-半胱氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。在适当的时间间隔，部分的加TEA以保持溶液为稍微碱性。混合物室温放置过夜，茚三酮检查为阴性后，反应直接用于2.5×75cm交联葡聚糖凝胶LH-20柱，用DMF平衡，用标准反应物校准（在例子中给出的t-Boc（-γ-苄基-L-谷氨酸-P-硝基苯酯和P-硝基酚）。柱流靠重力流动维持，在收集大约10mL的部分以前流出物在280nm检测。通过每一部分的t·1·c（板层）来鉴定产物，各相应部分被汇集在一起，真空挥发;产量：700mg（100%）油状产物，在板层上（t·1·c）是均质的（氯仿/丙酮（9/1），Rf＝0.64，（b）t-BOC-（β-苄基-L-天冬氨酰基-（S-P-甲氧苄基）-L-半脱氨酰基-（ε-苄氧羰基）-L-赖氨酸苄酯（Ⅱ）
把700mg保护的二肽（Ⅰ）溶于25ml无水DCM（二氯甲烷），加25ml无水TFA（三氟醋酸）。30分钟后，真空除去酸和溶剂。残渣被溶于DCM并再挥发干。向残渣在3mlDMF中并用TEA制成弱碱性的溶液，加t-BOC-（β-苄基）-L-天冬氨酸P-硝基苯酯（488mg）在3mlDMF中的溶液。经常检查碱性，并经常加少量TEA来保持碱性。茚三酮反应变阴性以后（大约2小时后）反应混合物用于交联葡聚糖凝胶LH-20柱（2.5×75），产物在t.l.c上为均一的（氯仿/丙酮（9/1）），Rf＝0.70。（c）t-Boc-（γ-苄基）-L-谷氨酰基-（β-苄基）-L-天冬氨酰基-（S-P-甲氧苄基）-L-半胱氨酰基-（ε-苄氧羰基（-L-赖氨酸苄酯（Ⅲ）
将900mg保护的三肽衍生物Ⅱ按上面叙述的方法用TFA去保护，溶于3mlDMF并用TEA做成微碱性。向这个溶液加504mg t-BOC-（γ-苄基）-L-谷氨酸P-硝基苯酯（在3mLDMF中）。2.5小时后茚三酮反应变成阴性，为纯化目的像上面叙述的将反应混合物用于交联葡聚糖LH-20柱。这个反应混合物中成分的分离和检测按上述方法用t.l.c来进行。将适宜的部分汇集在一起，蒸发、干燥。产量：1140mg（100%）浅黄色油，板层上均一的点（氯仿/丙酮（9/1）），Rf＝0.53。
d）苄氧羰基-L-焦谷氨酰基-（γ-苄基）-L-谷氨酰基-（β-苄基）-L-天冬氨酰基-（S-P-甲氧苄基）-L-半胱氨酰基-（ε-苄氧羰基）-L-赖氨酸苄酯（Ⅳ）
像对Ⅰ叙述的用TFA在DCM中将1140mg四肽Ⅲ去保护并溶于3mLDMF中。用TEA把该溶液做成微碱性，并加423mg苄氧羰基-L-焦谷氨酸P-硝基苯酯在3mLDMF中的溶液。反复检查反应混合物的碱性，若需要则用TEA恢复其碱性。大约3小时后茚三酮反应变成阴性，五肽衍生物Ⅳ可像上述法纯化。产量1230mg（96%）浅黄色油，板层为均一物（氯仿/丙酮（9/1）），Rf＝0.44（拖尾）。
（e）L-焦谷氨酰基-L-谷氨酰基-L-天冬氨酰基-L-半胱氨酰基-L-赖氨酸
将50mg保护的五肽衍生物Ⅳ溶于50mL0℃的液体氟化氢，加500mg蛋氨酸为净化剂，放置一小时。在0℃真空挥发掉氟化氢至干，残渣用乙酸乙酯搅拌。洗涤的乙酸乙酯倒出并弃去。留下的物质溶于稀醋酸并冷冻干燥。
通过反相HPLC将冷冻干燥物（2mg）纯化，用C18-柱10mm×10cm，流速2.8ml/分，用溶液A（0.1%三氟醋酸水溶液）和溶液B（0.1%三氟醋酸在乙腈中的溶液）进行梯度洗脱，0.10%B溶液经30分钟加完。用214nm的紫外吸收光或二硫吡啶（含巯基）进行检测。
可以用实例1的一般步骤合成许多另外的肽。这些列于下表内并对其鉴定及表示其特征：
实例30
PGlu-Glu-Asp-Ser-Lys-OH
用紫外uv304nm检测，LKB Biolynx 4170全自动肽合成仪来合成肽，Fmoc（9-芴基甲氧羰基）用做临时N-保护基，UV追踪。经酸不稳定的间隔基anm把C-末端氨基酸连于多聚体支撑物
标准方案是：
循环偶联 30分钟
用DMF洗涤 10分钟
用20%哌啶/DMF去保护 10分钟
用DMF洗涤 10分钟
用DCC做成对称酸酐来活化C-末端氨基酸，以N，N-二甲氨基吡啶为催化剂将其偶联于多聚体上。循环60分钟后，在整个合成中使用标准的方法。
所用氨基酸衍生物：
Fmoc-Ly（ε-N-BOC）-OH
Fmoc-Ser（O-tBu）ODBH
Fmoc-Asp（β-tOBu）-OPfp
Fmoc-Glu（γ-toBu）-OPfp
pGlu-OPClP
最后洗涤完全保护的五肽以后，聚合体用乙醚洗涤，空气干燥。
肽被完全去保护，在操作中用95%TFA水溶液处理1小时由聚合体上裂开。过滤后用TEA洗涤，挥发，最后肽在RP8柱上纯制，用在0.1%TFA的乙醇洗脱。
产量：44%
纯度：92%以上（HPLC RP18，214nm）
氨基酸分析：合格