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1、10申请公布号CN104203975A43申请公布日20141210CN104203975A21申请号201280030902922申请日20120625LMBP9680CB20120604PCT/EP2011/06713220110930EPPCT/EP2012/06130420120614EP61/500,36020110623US61/500,46420110623US61/541,36820110930US13/435,56720120330USC07K16/00200601G01N33/00200601C07K16/28200601C07K16/4220060171申请人埃博灵克斯股。
2、份有限公司地址比利时根特茨维纳德72发明人尤迪特鲍迈斯特玛丽葆拉吕西安娜阿曼达布什卡罗布东玛丽安格比斯维尔勒斯诺尔克斯特凡妮斯塔埃朗74专利代理机构中科专利商标代理有限责任公司11021代理人吴小明54发明名称用于预测、检测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术57摘要本发明提供，并且在某些具体但非限制性的方面中涉及测定法，所述测定法可以用于预测给定的ISV是否遭受如本文所述的蛋白干扰和/或在所述测定法如例如在ADA免疫测定法中产生（非特异性）信号。所述预测性测定法可以例如用于测试给定的ISV是否可能具有产生所述蛋白干扰和/或所述信号的倾向；用于选择不易遭受或较不容。
3、易遭受所述蛋白干扰或产生所述信号的ISVS；作为这样的测定法或测试，其可以用于测试对ISV的某些修饰是否完全或部分减少其产生这样的干扰或这样的信号的倾向；和/或作为这样的测定法或测试，其可以用于指导ISV的修饰或改进从而减少其产生所述蛋白干扰或信号的倾向；方法，所述方法用于修饰和/或改进ISVS从而消除或减少其产生所述蛋白干扰或所述信号的倾向；可以引入ISV的修饰，其消除或减少所述ISV产生所述蛋白干扰或所述信号的倾向；被特异性选择例如，使用本文所述的测定法从而不具有或具有较低/减小的产生所述蛋白干扰或所述信号的倾向的ISVS；被修饰和/或改进的ISVS，其不具有或具有较低/减小的产生所述蛋白。
4、干扰或所述信号的倾向。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2013122386PCT国际申请的申请数据PCT/EP2012/0622512012062587PCT国际申请的公布数据WO2012/175741EN2012122783生物保藏信息51INTCL权利要求书5页说明书57页序列表55页附图16页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书5页说明书57页序列表55页附图16页10申请公布号CN104203975ACN104203975A1/5页21免疫球蛋白单可变结构域ISV，其是纳米抗体或包含VH序列即，不同于纳米抗体的或衍生自VH序列的ISV，所述ISV具有。
5、序列为VTVSSXN的C端末端，其中N1,2或3并且优选地1或2，其中每个XALA或GLY；或N1,2或3并且优选地1或2，其中每个XALA；或N1,2或3并且优选地1或2，其中每个XGLY；或N2或3，其中至少一个XALA或GLY其余的氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸但是优选独立地选自VAL,LEU和/或ILE；或N2或3，其中除了一个X之外所有的XALA或GLY其余的氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸但是优选独立地选自VAL,LEU和/或ILE或在其C端末端包含所述ISV优选地所述纳米抗体的蛋白或多肽。2根据权利要求1所述的免疫球蛋白单可变结构域ISV、蛋白或多肽，其中N。
6、1,2或3并且优选地1或2，其中每个XALA或GLY；或N1,2或3并且优选地1或2，其中每个XALA；或N1,2或3并且优选地1或2，其中每个XGLY。3根据权利要求1所述的免疫球蛋白单可变结构域ISV、蛋白或多肽，其中X不是半胱氨酸。4免疫球蛋白单可变结构域ISV，其是纳米抗体或包含VH序列或衍生自VH序列的ISV，所述ISV具有序列为VTVSSXN的C端末端，其中N是110，优选地15，如1,2,3,4或5和优选地1或2，如1，并且其中每个X是优选地天然存在的氨基酸残基，所述氨基酸残基独立地选择并且优选独立地选自由丙氨酸A、甘氨酸G、缬氨酸V、亮氨酸L或异亮氨酸I组成的组，条件是X不是半。
7、胱氨酸；或在其C端末端包含这样的ISV并且优选地这样的纳米抗体的蛋白或多肽。5根据权利要求14中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域ISV、蛋白或多肽，其中所述C端ISV是纳米抗体。6根据权利要求15中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域ISV、蛋白或多肽，其具有少于500的与214结合的RU值，所述RU值是根据在实施例9中提出的方案使用BIACORE并且在根据公式测量的RU/蛋白的MWX106，关于ISV、蛋白或多肽的分子量调整测量的RU值后确定。7用于预测ISV或包含至少一个ISV的蛋白或多肽是否将在免疫测定法如ADA测定法中产生蛋白干扰的方法，所述方法包括进行至少包括下述步骤的免疫测定法I使。
8、所述ISV或蛋白/多肽与已经获自人受试者并且已经基于其识别和/或结合所述ISV的C端末端的能力选择/分离的抗体接触；和II确定所述ISV、蛋白或多肽在所述免疫测定法中是否与所述抗体结合。8根据权利要求7所述的方法，其中所述ISV是纳米抗体或作为VH结构域或包含VH结构域的其它ISV即，不同于纳米抗体。9根据权利要求7或8所述的方法，其中所述ISV是纳米抗体。10根据权利要求7或9中任一项所述的方法，其中所述蛋白或多肽在其C端末端具有所述ISV。11根据权利要求710中任一项所述的方法，其中所述ISV、蛋白或多肽在步骤II权利要求书CN104203975A2/5页3中与所述抗体结合的事实意味着所。
9、述ISV、蛋白或多肽能够产生或具有较高或增加的风险产生这样的蛋白干扰。12根据权利要求7或11中任一项所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。13根据权利要求712中任一项所述的方法，其中所述抗体是这样的多克隆抗体，其已经如下获得从已经获自人受试者并且适合用作获得多克隆抗体的原材料的生物样品开始，通过包括至少一个免疫亲和层析步骤和任选地一个或多个其他的用于从所述样品中分离和/或纯化多克隆抗体的步骤（在所述亲和步骤之前和/或之后进行）的方法获得，在所述亲和层析中使用这样的亲和基质，所述亲和基质携带ISV或包含至少一个ISV的蛋白或多肽和/或其中将所述ISV或包含至少一个ISV的蛋白或多肽用作亲和结。
10、构部分或抗原。14根据权利要求13所述的方法，其中在亲和基质上携带和/或用作亲和结构部分或抗原的所述ISV或包含至少一个ISV的蛋白或多肽是这样的ISV或包含至少一种这样的ISV的蛋白或多肽，所述ISV在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾，或其中在亲和基质上携带和/或用作亲和结构部分或抗原的所述ISV或包含至少一个ISV的蛋白或多肽在其C端末端具有这样的ISV或纳米抗体，所述ISV或纳米抗体在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾。15根据权利要求13或14所述的方法，其中在亲和基质上携带和/或用作亲和结构部分或抗原的所述ISV或包含至少一个ISV的蛋白或多。
11、肽是这样的ISV或包含至少一种这样的ISV的蛋白或多肽，所述ISV在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾并且在位置14处具有脯氨酸残基；或其中在亲和基质上携带和/或用作亲和结构部分或抗原的所述ISV或包含至少一个ISV的蛋白或多肽在其C端末端具有这样的ISV或包含至少一个ISV的蛋白或多肽，所述ISV在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾并且在位置14处具有脯氨酸残基。16根据权利要求1315中任一项所述的方法，其中在所述亲和基质上携带和/或用作所述亲和结构部分或抗原的ISV或纳米抗体是序列优化的和/或人源化的纳米抗体如序列优化的和/或人源化VHH或骆驼源化。
12、的VH，如骆驼源化的人VH；或其中在所述亲和基质上携带和/或用作亲和结构部分或抗原的基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物在其C端末端具有这样的ISV或纳米抗体，所述ISV或纳米抗体是序列优化的和/或人源化的纳米抗体（如序列优化的和/或人源化的VHH或骆驼源化的VH，如骆驼源化的人VH）。17根据权利要求15或16中任一项所述的方法，其中在所述亲和基质上携带和/或用作所述亲和结构部分或抗原的ISV或纳米抗体是序列优化的和/或人源化的纳米抗体，所述序列优化的和/或人源化的纳米抗体在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾并且在位置14处具有脯氨酸残基，其已经被引入作为相应的天然存在的。
13、VHH的人源化和/或序列优化的部分；或其中在所述亲和基质上携带和/或用作亲和结构部分或抗原的基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物在其C端末端具有序列优化的和/或人源化的纳米抗体，所述序列优化的和/或人源化的纳米抗体在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾并且在位置14处具有脯氨酸残基，其已经被引入作为相应的天然存在的VHH的人源化和/或序列优化的部分。18权利要求711中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。权利要求书CN104203975A3/5页419根据权利要求711或权利要求18中任一项所述的方法，其中所述抗体是这样的多克隆抗体，其已经如下获得从已经获自人受试者并。
14、且适合用作获得单克隆抗体的原材料的生物样品开始，通过包括至少一个筛选或选择步骤和任选地一个或多个其他的用于从所述样品中分离和/或纯化单克隆抗体的步骤（在所述筛选和/或选择步骤之前和/或之后进行）的方法获得，在所述筛选或选择步骤中ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物用于筛选和选择结合所述ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物和具体地结合其C端末端的单克隆抗体。20根据权利要求19所述的方法，其中在所述筛选或选择步骤中所用的ISV或纳米抗体在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾，或其中在所述筛选或选择步骤中所用的基于ISV的药物或基于纳米抗体的药。
15、物在其C端末端具有这样的ISV或纳米抗体，所述ISV或纳米抗体在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾。21根据权利要求19或20所述的方法，其中在所述筛选或选择步骤中所用的ISV或纳米抗体在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾并且在位置14处具有脯氨酸残基，或其中在所述筛选或选择步骤中所用的基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物在其C端末端具有这样的ISV或纳米抗体，所述ISV或纳米抗体在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾并且在位置14处具有脯氨酸残基。22根据权利要求19、20或21所述的方法，其中在所述筛选或选择步骤中所用的ISV或纳米。
16、抗体是序列优化的和/或人源化的纳米抗体如序列优化的和/或人源化的VHH或骆驼源化的VH，如骆驼源化的人VH；或其中在所述筛选或选择步骤中所用的基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物在其C端末端具有这样的ISV或纳米抗体，其是序列优化的和/或人源化的纳米抗体如序列优化的和/或人源化的VHH或骆驼源化的VH，如骆驼源化的人VH。23根据权利要求2122中任一项所述的方法，其中在所述筛选或选择步骤中所用的ISV或纳米抗体是序列优化的和/或人源化的纳米抗体，所述序列优化的和/或人源化的纳米抗体在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾并且在位置14处具有脯氨酸残基，其已经被引入作为相应的天。
17、然存在的VHH的人源化和/或序列优化的部分；或其中在所述筛选或选择步骤中所用的基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物在其C端末端具有这样的序列优化的和/或人源化的纳米抗体，所述序列优化的和/或人源化的纳米抗体在其C端末端以氨基酸序列VTVSSSEQIDNO33结尾并且在位置14处具有脯氨酸残基，其已经被引入作为相应的天然存在的VHH的人源化和/或序列优化的部分。24能够用于预测ISV或包含至少一个ISV的蛋白或多肽在免疫测定法中是否会产生或具有较高或增加的倾向产生蛋白干扰和/或预测所述ISV或包含至少一个ISV的蛋白或多肽是否将与人血液或血清中存在的干扰因子结合的方法，所述方法包括进行至少包括下。
18、述步骤的免疫测定法I使所述ISV或纳米抗体或基于ISV或基于纳米抗体的药物与单克隆抗体214即，用作“分析抗体”接触；和II确定所述ISV或纳米抗体或基于ISV或基于纳米抗体的药物在所述免疫测定法中是否与所述单克隆抗体214结合。25根据权利要求24所述的方法，其中所述ISV是纳米抗体或作为VH结构域或包含权利要求书CN104203975A4/5页5VH结构域的其它ISV即，不同于纳米抗体。26根据权利要求24或25所述的方法，其中所述ISV是纳米抗体。27根据权利要求2427中任一项所述的方法，其中所述蛋白或多肽在其C端末端具有所述ISV。28根据权利要求2427中任一项所述的方法，所述方法。
19、根据在实施例9中所述的方案进行。29药物组合物，其包含根据权利要求16中任一项所述的ISV、蛋白或多肽；和至少一种适合的载体、稀释剂或赋形剂。30根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述组合物、ISV、蛋白或多肽意欲用于治疗人的慢性疾病，和/或所述ISV、蛋白或多肽意欲在即以治疗活性剂量施用其的受试者的循环中即以药理学活性水平存在至少一周，优选地至少两周，如至少一个月的时期；和/或所述ISV、蛋白、多肽是这样的从而使其在人受试者中具有至少3天，如至少一周，并且最多可达10天以上的半衰期优选地以T1/2表示；和/或这样所述ISV、蛋白、多肽或药物组合物意欲作为两个以上的剂量施用于人，所述两个以。
20、上的剂量在至少3天，如至少1周，例如至少2周或至少一个月，或甚至更长即至少3个月，至少6个月或至少一年的时期内施用，或甚至长期施用。31根据权利要求16中任一项所述的ISV、蛋白或多肽，其用于治疗人的疾病。32根据权利要求16和/或权利要求31中任一项所述的ISV、蛋白或多肽，其中所述ISV、蛋白或多肽意欲用于治疗人的慢性疾病，和/或所述ISV、蛋白、多肽意欲在即以治疗活性剂量施用其的受试者的循环中即以药理学活性水平存在至少一周，优选地至少两周，如至少一个月的时期；和/或所述ISV、蛋白、多肽是这样的从而使其在人受试者中具有至少3天，如至少一周，并且最多可达10天以上的半衰期优选地以T1/2表。
21、示；和/或这样所述ISV、蛋白、或多肽意欲作为两个以上的剂量施用于人，所述两个以上的剂量在至少3天，如至少1周，例如至少2周或至少一个月，或甚至更长即至少3个月，至少6个月或至少一年的时期内施用，或甚至长期施用。33根据权利要求16、权利要求31或32中任一项所述的ISV或蛋白或多肽在制备药物组合物中的应用，和具体地，在制备根据权利要求29或30所述的药物组合物中的应用。34根据权利要求33所述的应用，其中所述ISV、蛋白或多肽意欲用于治疗人的慢性疾病，和/或所述ISV、蛋白、多肽意欲在即以治疗活性剂量施用其的受试者的循环中即以药理学活性水平存在至少一周，优选地至少两周，如至少一个月的时期；和。
22、/或所述ISV、蛋白、多肽是这样的从而使其在人受试者中具有至少3天，如至少一周，并且最多可达10天以上的半衰期优选地以T1/2表示；和/或这样所述ISV、蛋白、或多肽意欲作为两个以上的剂量施用于人，所述两个以上的剂量在至少3天，如至少1周，例如至少2周或至少一个月，或甚至更长即至少3个月，至少6个月或至少一年的时期内施用，或甚至长期施用。35治疗方法，所述方法包括向人受试者例如向需要所述治疗的患者施用根据权利权利要求书CN104203975A5/5页6要求16,31或32之一所述的ISV或蛋白或多肽或根据权利要求29或30所述的药物组合物。36根据权利要求35所述的治疗方法，其中所述药物组合物。
23、、ISV、蛋白或多肽意欲用于治疗人的慢性疾病，和/或所述ISV、蛋白、多肽意欲在即以治疗活性剂量施用其的受试者的循环中即以药理学活性水平存在至少一周，优选地至少两周，如至少一个月的时期；和/或所述ISV、蛋白、多肽是这样的从而使其在人受试者中具有至少3天，如至少一周，并且最多可达10天以上的半衰期优选地以T1/2表示；和/或这样的所述药物组合物、ISV、蛋白、或多肽意欲作为两个以上的剂量施用于人，所述两个以上的剂量在至少3天，如至少1周，例如至少2周或至少一个月，或甚至更长即至少3个月，至少6个月或至少一年的时期内施用，或甚至长期施用。权利要求书CN104203975A1/57页7用于预测、检。
24、测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术0001本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域领域。0002免疫球蛋白单可变结构域或“ISV”在本文中通常定义为这样的氨基酸序列，其0003包含免疫球蛋白折叠或在适合的条件下如生理条件下能够形成免疫球蛋白折叠即通过折叠，即从而形成免疫球蛋白可变结构域如，例如，VH，VL或VHH结构域；0004和0005形成或在这样适合的条件下能够形成免疫球蛋白可变结构域，其包含功能性抗原结合位点在其不需要与另一个免疫球蛋白可变结构域相互作用如VHVL相互作用以形成功能性抗原结合位点的意义上。0006本领域目前已知的免疫球蛋白单可变结构域的一些实例是。
25、VHHS和/或其它纳米抗体,DABS和单结构域抗体。在这些之中，到提交本申请之日时，各种纳米抗体处于I期和II期临床试验中。这使得获得可靠的测定法变得重要，所述测定法用于分析来自用ISVS治疗的人如临床试验受试者，和在所述ISVS上市后，用所述ISVS治疗的患者的生物样品。0007这不仅对于管理目的是重要的，而且对于用生物药物治疗患者也是重要的，因为开出所述治疗处方的临床医生也希望获得监测治疗的各个方面的可靠测定法。0008例如，在生物药物分子的临床开发中，重要的是评估它们的免疫原潜力，以及具体地它们可以激发所谓“抗药物抗体”或“ADAS”的程度。这可以使用所谓的“抗药物抗体”或“ADAS”（。
26、免疫测定法）进行测定见例如SHANKAR等的综述，JOURNALOFPHARMACEUTICALANDBIOMEDICALANALYSIS药物和生物医学分析杂志,482008,12671281以及MIRESLUIS等,JIMMUNOLMETH2892004,116PENG等,JOURNALOFPHARMACEUTICALANDBIOMEDICALANALYSIS药物和生物医学分析杂志,54,2011,629635和LOYET等,JIMMUNOLMETH3452009,1728。所述ADA测定法和进行该测定法的方法是药学领域的标准常识并且在生物药物产品的临床开发中常规使用它们并且也为世界上的各个。
27、管理机构所要求。0009例如，如在MIRESLUIS的文章第3和第4页上所述，并且如例如也在PENG的文章的图中示意性地举例，已知许多不同的ADA测定法形式，如“ELISA桥接形式”，“ELISA直接形式”，“间接形式”，放射免疫沉淀测定法RIP,“表面等离振子共振”和“电化学发光桥接形式”。本领域技术人员清楚进行ADA免疫测定法的其它形式。0010技术人员也熟悉许多不同的商购技术平台，其已经显示适合于建立和进行ADA测定法。这些包括但不限于MSD平台MESOSCALE，GYROLABGYROS和OCTET平台FORTEBIO。0011ADA测定形式的一些非限制性实例也在图1A1C中示意性地显。
28、示。0012通常，应该注意在这些用于检测或测量针对ISV的ADAS的ADA测定法中，ISV用作“分析试剂”即，作为用于检测任何ADAS在测试样品中是否存在的化合物”，并且ADAS是“抗原”即，在测试的样品中待检测的化合物。因此，在这些测定法中，ISV通常说明书CN104203975A2/57页8/经常结合于载体（如ELISA板），而ADAS如果存在在进行测定法的样品中存在。0013为了更好地理解本文所述的本发明，也应该注意作为对比在本文中用于预测ISV是否产生蛋白干扰的方法中，ISV通常用作“抗原”即，作为待检测的化合物，并且抗体（其如本文进一步所述）用作“分析试剂”即作为分别检测给定的ISV。
29、是否结合；并且由此分别检测其是否具有产生蛋白干扰的较高或增加的风险的工具。因此，在根据本发明的这种方法中，用作分析试剂的抗体其在本文中也称为“分析抗体”通常结合于载体即结合于ELISA板，并且ISV存在于待测试的样品中。然而，通常应该注意到本发明不限于其中“分析抗体”结合于载体的测定法。例如，在进行根据本发明的测定法的备选方法中如例如在图1中显示并且在实施例中描述，分析抗体替代性地用作桥接剂BRIDGINGAGENT，并且因此在溶液中而不是结合于板尽管其通过包被在板上的ISV间接结合于板。然而，也在实施例中所述的特异性桥接测定法中其是竞争性测定法，分析抗体仍旧用作分析试剂即，分别确定目的ISV。
30、是否结合；并且因此分别确定其是否具有产生蛋白干扰的较高风险或增加的风险。还设想，基于本文进一步的公开内容，技术人员能够设计其他的测定形式，其中分析抗体可以用作分析试剂从而分别确定给定的ISV是否能够结合；并由此确定其是否具有产生蛋白干扰的较高或增加的风险。0014作为研究单链FVS或“SCFVS“其是包含免疫球蛋白单可变结构域的构建体，并且类似于ISVS，不与恒定结构域缔合的结果，已经在本领域中描述，免疫球蛋白可变结构域的C端形成疏水补片（HYDROPHOBICPATCH），其在抗体中被埋在可变结构域和恒定结构域之间的界面中，但是当可变结构域不与恒定结构域缔合时，成为溶剂暴露的NIEBA等,P。
31、ROTEINENGINEERING,10,4354441997。还描述了暴露的C端可以形成B细胞表位，其可以产生抗药物抗体和/或与（新出现和/或预先存在的）抗药物抗体相互作用WO11/07586，可以接着使用上述提及的ADA测定法来确定它的存在。为此原因，已经提议对形成可变结构域的C端的部分的一些氨基酸残基进行突变以减少所述疏水性和/或去除所述表位。例如，NIEBA等提议突变VH区的位置11,14,41,84,87和/或89（按照KABAT编号），而在WO11/07586中，提议突变VL结构域的位置99,101和/或148AHO编号或VH结构域的位置12,97,98,99,103和/或144也。
32、是AHO编号这些位置对应于根据KABAT的位置11,83,84,85,89和103。0015然而，这些参考文献中都没有意识到在受试者的血液或血清中存在的某些蛋白会干扰涉及ISVS的ADA测定法，并且因为此，这些文献中并不涉及（也没有提供方案给）这样的问题，即在所述ADA测定法中怎样避免非特异性蛋白干扰，从而允许ADA测定法用于确定待测试样品中新出现或已经存在的抗药物抗体的真实存在/程度。0016作为对比，本发明提供这样的方法和测定法，其容易使技术人员预测免疫球蛋白单可变结构域是否具有在ADA测定法中遭受非特异性蛋白干扰的倾向。本文所述的方法和测定法还允许技术人员，在发现可变结构域可能具有在AD。
33、A测定法中遭受所述蛋白干扰的倾向或风险时，容易测试可变结构域提议的修饰从而预测任何这样（提议）的修饰是否减少或基本上完全避免这样的蛋白干扰。0017本发明还描述了可以对可变结构域进行许多修饰从而减少或基本避免这样的蛋白干扰。根据一个非限制性的方面，这种修饰包括将有限量如本文进一步所述的氨基酸残基如本文进一步所述添加到可变结构域的C端末端。令人惊奇的是，已经发现对说明书CN104203975A3/57页9于许多基于其的不同的可变结构域或构建体，甚至将单氨基酸残基加入C端末端如单丙氨酸残基也可以充分地或甚至基本上完全消除ADA测定法中的蛋白干扰问题，即使加入一个这样的氨基酸本身不足以“覆盖”或“包。
34、埋”根据NIEBA等存在于ISV的C端的疏水片也是如此。类似地，但是不希望以任何方式限制本发明或限于任何机制或解释，还认为加入一个这样的氨基酸不足以“覆盖”或“包埋”根据WO11/07586所述可能存在于可变结构域的C端的任何B细胞表位。还应该注意，尽管根据本发明这一具体方面，在可变结构域的C端加入有限量的氨基酸或甚至单氨基酸（即，在C端区本身内不进行任何取代，如由NIEBA等和WO11/07586所提议的）可以并且在许多情形中明显减少或甚至基本上去除非特异性蛋白干扰的问题，但是在C端末端的这样的添加与C端区突变的组合也在本发明这一方面的范围内。然而，在该方面中，还应该注意，本发明不具体受限于。
35、进行这些突变背后的基本原理。例如，本领域公知在C端内对氨基酸残基进行突变包括由NIEBA等和在WO11/07586中清楚提及的那些位置从而对可变结构域包括，但不限于VHH结构域进行人源化或从而对VH结构域进行“骆驼源化”例如参考WO08/020079和本文提及的ABLYNXNV的一些其它申请。0018认为本文教导的方法，测定法和修饰可以应用于任何这样的可变结构域，其不与恒定结构域或用功能为“遮蔽”、覆盖或“包埋”可变结构域的C端区的其他基团或肽结构部分连接或不以其他方式与恒定结构域或用功能为“遮蔽”、覆盖或“包埋”可变结构域的C端区的其他基团或肽结构部分缔合并且更通常，应用于具有溶剂暴露的C端。
36、区的任何可变结构域。然而，根据本发明一个优选的，但非限制性方面，所述方法，测定法和修饰可以具体地应用于重链可变结构域VH结构域，并且根据本发明的一个具体方面，应用于VHH结构域。0019还认为本文所述的方法，测定法和修饰可以适当地应用于包含一个或多个可变结构域的蛋白构建体，并且具体地应用于其中可变结构域形成所述构建体的C端部分的构建体，或在本文所述的方法和测定法情形中，具体应用于其中可变结构域的C端区是溶剂暴露的构建体。此外，根据本发明的一个优选但非限制性方面，所述方法，测定法和修饰应用于这样的构建体，其中VH结构域并且具体地，VHH结构域形成构建体的C端部分，或在本发明的方法和测定法情形中，。
37、是溶剂暴露的。0020所述构建体的一些非限制性实例是多价、多特异性的（如双特异性）或多互补位如双互补位构建体，其包含两个以上直接连接的ISVS或通过一个或多个适合接头连接根据一个具体方面，也用VH或VHH结构域连接的ISVS，所述ISVS形成所述构建体的C端部分。例如，但不限于，所述构建体可以完全包含也是直接连接的或通过一个或多个适合的接头连接的VH结构域，具体地纳米抗体即，VHH结构域，人源化的VHH结构域或骆驼源化的VH结构域。对于这些构建体和怎样构建这些构建体具体地基于纳米抗体的通常教导的一些非限制性实例，例如参考CONRATH等,JBC276,109,73462001以及MUYLDER。
38、MANSREVIEWSINMOLBIOTECHNOL分子生物技术综述,74272001的综述文章。0021然而，例如还认为本发明可应用于具有溶剂暴露的可变结构域的其它构建体并且具体地在其C端具有可变结构域的构建体，如例如单链FVS，具体地在C端具有它们的重链可变结构域的SCFVS。说明书CN104203975A4/57页100022在本发明的说明书和权利要求中，术语如“ISV”，“分析试剂”和“蛋白干扰”具有如本文进一步定义的含义。0023具体地，如本文所述的ISV可以具体地是纳米抗体，或（其它）ISV即，不同于纳米抗体，其是VH结构域或包含VH结构域；并且优选地是纳米抗体。0024此外，包含。
39、ISV的任何蛋白或多肽如基于ISV的药物优选地在其C端末端具有所述或至少一个这样的ISV。此外，所述的ISV可以具体地是纳米抗体，或（其它）ISV即，不同于纳米抗体，其是VH结构域或包含VH结构域；并且优选地是纳米抗体。0025本文所述的发明具体地意欲并且适合应用于ISVS，其包含，基于和/或衍生自重链可变结构域，如VH结构域包括人VH结构域和纳米抗体如VHH结构域包括人源化的和序列优化的VHH结构域或骆驼源化的VH结构域。这些可以是合成的例如，从合成库起始获得和/或基于固定的构架区，半合成的例如人源化的，骆驼源化或序列优化的，或从天然VH或VHH结构域开始，通过亲和力成熟或CDR移植获得或完。
40、全天然存在的VH或VHH结构域。因此本发明关于作为VH或VHH结构域，基于VH或VHH结构域和/或衍生自VH或VHH结构域的ISVS如本文进一步所述。0026在产生本发明时，已经发现在一些用于分析生物样品如血液样品，包括全血、血清和血浆、眼泪、支气管肺泡液/BALF、脑脊髓液或生物流体的其他样品的测定法如，例如在ADA免疫测定法中中，可能存在蛋白干扰，并且这样的蛋白干扰可能在一些这样的测定法和/或在一些这样的样品中产生非特异性信号。已经发现，这样的蛋白干扰不仅在获自用ISVS和具体地，用纳米抗体；或用包含至少一种所述ISV或纳米抗体的蛋白，多肽或其他生物药物治疗的受试者和/或已经施用了其的受试。
41、者如患者或临床试验受试者的样品中存在，而且在从未接受ISV的受试者中也存在说明所述干扰可能是由于与预先存在的蛋白而不是与任何新出现的ADAS的非特异性蛋白蛋白相互作用产生的。0027尽管已经发现在这些测定法中这样的蛋白干扰和/或所述信号不与ISVS的药物性质如药物代谢动力学/PK或药效学/PD性质的任何变化或减少相关，但是还是需要获得这样的技术，其用于预测、检测、减少和/或如果可能避免这样的非特异性蛋白干扰。这是本发明的一般目的。0028具体地，本发明提供，并且在某些具体的但非限制性方面涉及0029测定法，其可以用于预测给定的ISV是否在这样的测定法如例如在ADA免疫测定法中中遭受这样的蛋白干。
42、扰和/或产生这样的非特异信号。这样的预测性测定法可以例如用于测试给定的ISV是否具有产生这样的蛋白干扰和/或这样的信号的倾向；用于选择不易产生或较不容易产生这样的蛋白干扰或产生这样的信号的ISVS；作为这样的测定法或测试，其可以用于测试对ISV的某些修饰是否完全或部分减少其产生这样的干扰或这样的信号的倾向；和/或作为这样的测定法或测试，其可以用于指导ISV的修饰或改进从而减少其产生这样的蛋白干扰或信号的倾向；0030用于修饰和/或改进ISVS从而消除或减少其产生这样的蛋白干扰或这样的信号的倾向；0031可以被引入ISV从而消除或减少其产生这样的蛋白干扰或这样的信号的倾向的修饰；0032可以被特。
43、异性选择例如，使用本文所述的测定法从而不具有或具有较低/减说明书CN104203975A105/57页11少的产生这样的蛋白干扰或这样的信号的倾向的ISVS；0033不具有或具有较低/减少的产生这样的蛋白干扰或这样的信号的倾向的修饰和/或改进的ISVS。0034例如，在第一个非限制性方面中，本发明涉及这样的方法，其可以用于预测给定的ISV或纳米抗体或基于ISV或基于纳米抗体的药物是否在免疫测定法中产生或具有较高或增加的风险产生蛋白干扰即，在其施用于受试者后，生物流体的样品获自所述受试者，并且所述样品进行如本文进一步所述的免疫测定法，所述方法包括进行这样的免疫测定法，其至少包括下述步骤0035I。
44、使所述ISV或纳米抗体或基于ISV或基于纳米抗体的药物与这样的抗体接触，所述抗体获自人受试者并且已经基于它们识别和/或结合ISV或纳米抗体的C端末端的能力进行选择，产生和/或分离“分析抗体”；和0036II确定所述ISV或纳米抗体或基于ISV或基于纳米抗体的药物是否在所述免疫测定法中与所述抗体结合。0037在这种方法中，当所述ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物与所述分析抗体结合时，可以预期所述ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物将产生或具有较高或增加的风险产生这样的蛋白干扰如本文进一步所述。基于此，例如，可以修饰或改进所述ISV、纳米抗体、基于ISV的药物。
45、或基于纳米抗体的药物从而减少或消除其产生这样的蛋白干扰的倾向其也可以使用上述测定法进行测定，并且可以用于修饰所述ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物的一些策略如本文所述例如，包括将少量的氨基酸残基连接于C端末端和/或引入一个或多个具体氨基酸取代。0038因此，一般地，本发明使技术人员获得这样的测定法和方法/技术，其可以用于预测ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物产生蛋白干扰的倾向和/或作为改进ISVS，从而减少或避免它们产生蛋白干扰的倾向的工具。这样做的时候，本发明还给技术人员提供选择ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物的手段，该选择是基于。
46、它们产生蛋白干扰的较低或减少的能力或缺乏任何能力进行的。因此，本发明给技术人员提供重要的测定法和工具，其可以用在优化和开发ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物中。0039此外，如本文进一步所述，本发明教导技术人员许多这样的方法，其中可以修饰或改进ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物从而减少或避免它们产生蛋白干扰的倾向。因此本发明通常还获得了具有减少的、较低的或不具有任何产生蛋白干扰倾向的修饰和/或改进的ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物。0040如本文进一步所述，本发明可以具体地用于预测给定的ISV或纳米抗体或基于ISV或基于纳米抗体的药。
47、物是否在免疫测定法中,和更具体地在ADA测定法中产生蛋白干扰如本文进一步所述。所述ADA测定法可以通常例如是用于检测或测量针对ISVS的ADAS的ADA测定法，并且可以具体地是用于检测或测量针对在上述步骤I和II中所用的ISV的ADAS的ADA测定法。0041此外，如本文提及，如本文所述的ISV可以具体的是这样的纳米抗体或其它ISV即，不同于纳米抗体，其是VH结构域或包含VH结构域并且优选地是纳米抗体。说明书CN104203975A116/57页120042此外，包含ISV的任何蛋白或多肽如基于ISV的药物优选地在其C端末端具有所述（或至少一种）这样的ISV。此外，所述ISV可以具体地是这样的。
48、纳米抗体或其它ISV即，不同于纳米抗体，其是VH结构域或包含VH结构域优选地是纳米抗体。0043在所述免疫测定法或ADA测定法中测试的样品在本文中也称为“测试样品”或“测定样品”。为避免混淆，诸如“测试样品”或“测定样品”不应该与在本文中用作获得在本发明中使用的多克隆或单克隆“分析抗体”的原料的生物样品混淆。0044在一个特别优选但是非限制性的方面中，本发明可以用于预测给定的ISV或纳米抗体或基于ISV或基于纳米抗体的药物是否将在包括使用所述ISV的免疫测定法中和具体地，在ADA测定法中产生蛋白干扰如本文进一步所述。此外，所述ADA测定法可以通常例如是用于检测或测量针对ISVS的ADAS的AD。
49、A测定法，并且可以具体地是用于检测或测量针对在上述步骤I和II中所用的ISV的ADAS的ADA测定法。0045在甚至更具体的但非限制性的方面中，本发明可以用于预测给定的ISV或纳米抗体或基于ISV或基于纳米抗体的药物是否将在免疫测定法中和具体地，在ADA测定法中产生蛋白干扰如本文进一步所述，所述免疫测定法意欲确定或测量所述样品是否包含任何针对ISV的ADAS。此外，例如，所述免疫测定法可以是一种已知类型的ADA测定法关于其例如参考本文引用的关于ADA测定法的现有技术进行所述ADA测定法以确定或测量是否在“测试样品”中存在任何针对所述ISV的ADAS，其中所述测试样品是获自已经施用了所述ISV的受试者如本文进一步所述的生物流体的样品如本文所述。0046如本文进一步所述，在所有这些方面和本文所述的本发明的其他方面中，本发明还可以用于选择在所述免疫测定法或ADA测定法中不易产生或较不容易产生这样的蛋白干扰的ISVS；作为这样的测定法或测试，其可以用于测试ISV的某些修饰是否（完全或部分）减少其在所述免疫测定法或ADA测定法中产生所述干扰的倾向；和/或作为这样的测定法或测试，其可以用于指导ISV的修饰或改进从而减少其在所述免疫测定法或ADA测定法中产生这样的蛋白干扰的倾向。0047本发明的其他方面，。