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1、(10)申请公布号 CN 104225685 A (43)申请公布日 2014.12.24 CN 104225685 A (21)申请号 201410478759.0 (22)申请日 2014.09.18 A61L 27/54(2006.01) A61L 27/50(2006.01) A61L 27/22(2006.01) A61L 27/18(2006.01) D01D 5/00(2006.01) D04H 1/728(2012.01) D04H 1/541(2012.01) (71)申请人 东华大学 地址 201620 上海市松江区松江新城人民北 路 2999 号 (72)发明人 莫秀梅 。
2、张建光 孙彬彬 宋炜 (74)专利代理机构 上海泰能知识产权代理事务 所 31233 代理人 黄志达 (54) 发明名称 一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方 法 (57) 摘要 本发明涉及一种导电缓释型神经组织工程 支架的制备方法， 包括 ： 将丝素蛋白 Silk 和乳 酸 - 己内酯共聚物溶于溶剂中， 溶解搅拌， 得到溶 液， 然后加入聚苯胺 PANi 和樟脑磺酸， 搅拌混匀， 得到皮层静电纺丝溶液 ； 将神经生长因子 NGF 完 全溶解在超纯水中， 得到芯层静电纺丝溶液 ； 将 皮层静电纺丝溶液、 芯层静电纺丝溶液分别装入 注射器中， 进行同轴静电纺丝， 然后熏蒸处理， 真 空干燥， 。
3、即得导电型神经组织工程支架。 本发明制 备出的纳米纤维支架从外加电刺激导电高分子， 生物化学神经生长因子以及神经再生所需的拓扑 结构取向引导等途径促进神经修复速度。本发明 方法操作简单， 可重复性好， 经济效益高， 为临床 中遇到的神经缺损修复提供新的实验思路。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104225685 A CN 104225685 A 1/1 页 2 1. 一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法， 包括 ： (1)将。
4、质量比为25-50:75-50的丝素蛋白和乳酸-己内酯共聚物共混物溶于溶剂中， 完 全溶解搅拌均匀后得到质量体积百分比为 8-10的溶液， 然后加入质量比为 1:1 的聚苯胺 PANi 和樟脑磺酸， 搅拌混匀， 得到皮层静电纺丝溶液 ； (2) 将神经生长因子 NGF 完全溶解在超纯水中， 得到芯层静电纺丝溶液 ； (3) 将将皮层静电纺丝溶液、 芯层静电纺丝溶液分别装入注射器中， 进行同轴静电纺 丝， 然后熏蒸处理， 真空干燥， 即得导电缓释型神经组织工程支架。 2. 根据权利要求 1 所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法， 其特征在 于 ： 所述步骤 (1) 中乳酸 - 己内酯共。
5、聚物的分子量为 Mn 30 万， 聚苯胺的分子量 Mn 1.5 万。 3. 根据权利要求 1 所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法， 其特征在 于 ： 所述步骤 (1) 中溶解搅拌时间为 5-6h， 加入聚苯胺 PANi 和樟脑磺酸， 搅拌均匀时间为 24-48h， 搅拌速率均为 200-300r/min。 4. 根据权利要求 1 所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法， 其特征在 于 ： 所述步骤 (1) 中皮层静电纺丝溶液中聚苯胺 PANi 的质量体积百分比为 1.2-1.6。 5. 根据权利要求 1 所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法， 其特征在 于 ： 所。
6、述步骤 (2) 中芯层静电纺丝溶液中神经生长因子 NGF 的浓度为 10g/ml。 6. 根据权利要求 1 所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法， 其特征在 于 ： 所述步骤 (3) 中同轴静电纺丝工艺具体为 ： 皮层静电纺丝溶液装入注射器中， 在微量推 进泵的作用下进入同轴装置复合毛细喷头的内外毛细喷丝口之间的环状空隙处 ； 将芯层静 电纺丝溶液装入注射器， 在微量注射泵的作用动下进入同轴装置复合毛细喷头的内毛细喷 丝头， 开启静电压发生器， 推进泵， 以及滚筒接收装置的电机， 进行纺丝。 7. 根据权利要求 1 所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法， 其特征在 于 ： 。
7、所述步骤 (3) 中同轴静电纺丝工艺参数为 ： 纺丝喷头为内层为 8 号外层为 16 号的同心 轴喷丝头 ； 注射泵的推进速度分别为芯层 0.2ml/h 和壳层 1.0ml/h ； 在同心轴喷丝头和滚 筒接收装置之间接入的调节电压为 12-13kV ； 同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间的距离为 5-6cm ； 滚筒电机提供给滚筒的转速为 4000r/min。 8. 根据权利要求 1 所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法， 其特征在 于 ： 所述步骤 (3) 中熏蒸处理为乙醇进行熏蒸处理。 9. 根据权利要求 8 所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法， 其特征在 于 ： 所述乙。
8、醇的体积百分数为 75， 熏蒸处理时间为 24-48h。 10. 根据权利要求 1 所述的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法， 其特征在 于 ： 所述步骤 (3) 中真空干燥时间为 48-72h。 权 利 要 求 书 CN 104225685 A 2 1/4 页 3 一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法 技术领域 0001 本发明属于神经缺损修复涉及生物材料制备领域， 特别涉及一种导电缓释型神经 组织工程支架的制备方法。 背景技术 0002 周围神经的再生以及功能的恢复一直是困扰临床的一个难题， 每年全世界都有大 量的患者需要进行神经修复。到目前为止， 最常采用的方法是自体神经移植来。
9、治疗神经断 裂或者缺损。但是， 自体神经可供移植的来源非常有限。此外在显微外科手术中很难避免 神经纤维的错向对接， 从而影响神经功能的恢复。 近年来随着组织工程的逐步发展， 利用生 物材料构建的神经再生导管， 为临床神经缺损修复带来了希望。 0003 然而周围神经再生不仅要恢复其结构， 更重要的是恢复其对靶器官的支配功能， 为了达到或超过自体神经移植的修复效果， 近年来研究者们不断致力可控制的活性复合神 经导管的制备。 众所周知， 神经传导的根本在于神经纤维上膜电位的变化， 神经传导即为电 信号的传导， 近几年来有很多文献报道电刺激可以促进并引导神经细胞迁移。 同时， 神经生 长因子(nerv。
10、e growth factor,NGF)也可以对运动神经的再生起促进作用， 至目前为止， 未 见有基于同轴静电纺丝技术制备一种负载神经生长因子 (NGF) 导电型神经组织工程支架 的报道。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方 法， 本发明的优点在于巧妙的利用同轴静电纺丝技术， 得到导电缓释型纳米纤维神经导管， 其生物相容性好， 能够引导神经细胞沿着取向生长， 加速神经轴突的延伸， 促进受损神经再 生修复 ； 本方法操作简单， 可重复性好， 经济效益。 0005 本发明的一种导电缓释型神经组织工程支架的制备方法， 包括 ： 0006 (1)将。
11、质量比为25-50:75-50的丝素蛋白和乳酸-己内酯共聚物溶于溶剂中， 溶解 搅拌， 得到质量体积百分比为 8-10的溶液， 然后加入质量比为 1:1 的聚苯胺 PANi 和樟脑 磺酸， 搅拌混匀， 得到皮层静电纺丝溶液 ； 0007 (2) 将神经生长因子 NGF 完全溶解在超纯水中， 得到芯层静电纺丝溶液 ； 0008 (3) 将皮层静电纺丝溶液、 芯层静电纺丝溶液分别装入注射器中， 进行同轴静电纺 丝， 然后熏蒸处理， 真空干燥， 即得导电缓释型神经组织工程支架。 0009 所述步骤 (1) 中乳酸 - 己内酯共聚物的分子量为 Mn 30 万， 乳酸 - 己内酯的比 例为 50:50，。
12、 聚苯胺 PANi 的分子量 Mn 1.5 万。 0010 所述步骤 (1) 中溶剂为六氟异丙醇。 0011 所述步骤 (1) 中溶解搅拌时间为 5-6h， 加入聚苯胺 PANi 和樟脑磺酸， 搅拌均匀时 间为 24-48h， 搅拌速率均为 200-300r/min。 0012 所述步骤 (1) 中樟脑磺酸可以使聚苯胺具有导电特性。 说 明 书 CN 104225685 A 3 2/4 页 4 0013 所述步骤 (1) 中皮层静电纺丝溶液中聚苯胺 PANi 的质量体积百分比为 1.2-1.6。 0014 所述步骤 (2) 中超纯水配制的神经生子因子 (NGF) 溶液需现配现用， 避免长时间 。
13、放置影响其活性。 0015 所述步骤 (2) 中芯层静电纺丝溶液中神经生长因子 NGF 的浓度为 10g/ml。 0016 所述步骤 (3) 中同轴静电纺丝工艺具体为 ： 皮层静电纺丝溶液装入注射器中， 在 微量推进泵的作用下进入同轴装置复合毛细喷头的内外毛细喷丝口之间的环状空隙处 ； 将 芯层静电纺丝溶液装入注射器， 在微量注射泵的作用动下进入同轴装置复合毛细喷头的内 毛细喷丝头， 开启静电压发生器， 推进泵， 以及滚筒接收装置的电机， 进行纺丝。 0017 所述喷丝口为同心轴的复合毛细管， 所制备的纳米纤维具有 “芯 - 壳” 结构。 0018 所述步骤(3)中同轴静电纺丝工艺参数为 ： 。
14、纺丝喷头为内层为8号外层为16号的 同心轴喷丝头 ； 注射泵的推进速度分别为芯层0.2ml/h和壳层1.0ml/h ； 在同心轴喷丝头和 滚筒接收装置之间接入的调节电压为 12-13kV ； 同心轴喷丝头和滚筒接收装置之间的距离 为 5-6cm ； 滚筒电机提供给滚筒的转速为 4000r/min。 0019 所述步骤 (3) 中熏蒸处理为乙醇进行熏蒸处理。 0020 所述乙醇的体积百分数为 75， 熏蒸处理时间为 24-48h。 0021 所述步骤 (3) 中真空干燥时间为 48-72h。 0022 本发明的取向纳米纤维支架由负载神经生长因子 (NGF) 的同轴静电纺纳米纤维 所构成， 神经生。
15、长因子 (NGF) 位于纳米纤维的芯层， 导电物质位于纳米纤维的皮层， 纳米纤 维呈现 “芯 - 壳” 结构， 神经生长因子 (NGF) 在神经修复过程中缓慢释放， 取向结构为神经 细胞增殖提供良好的微环境， 外加电刺激可以促进神经轴突的延伸， 三者的协同作用从而 加速神经修复速度 ； 该发明制备装置简易、 控制参数较少、 所制得的神经支架具有良好的细 胞相容性， 有望在下一步的临床中得到应用。 0023 本发明制备出的纳米纤维支架从外加电刺激(导电高分子)， 生物化学(神经生长 因子 ) 以及神经再生所需的拓扑结构 ( 取向引导 ) 等途径促进神经修复速度， 研究外加电 刺激， 神经生长的缓。
16、释， 以及取向结构三者对神经再生的协同作用。 0024 有益效果 0025 (1) 本发明的优点在于巧妙的利用同轴静电纺丝技术， 得到导电缓释型纳米纤维 神经导管， 其生物相容性好， 能够引导神经细胞沿着取向生长， 加速神经轴突的延伸， 促进 受损神经再生修复 ； 0026 (2) 本方法操作简单， 可重复性好， 经济效益高。 附图说明 0027 图 1 静电纺丝接收装置示意图 ； 0028 图2为丝素蛋白和乳酸-己内酯共聚物的纺丝液中加入导电材料聚苯胺后所的支 架的颜色变化 ； 0029 图 3 负载 NGF 的纳米纤维透射电镜照片 (A) 及 NGF 在纳米纤维中分布的激光共聚 焦照片 (。
17、B) ； 0030 图 4 负载 NGF 的纳米纤维的扫描电镜照片 ； 说 明 书 CN 104225685 A 4 3/4 页 5 0031 图 5 大鼠肾上腺嗜铬神经瘤细胞 (PC-12) 在支架上轴突的生长情况 ： 在未加电刺 激条件下， 未负载神经生长因子的激光共聚焦照片 (A) 及负载神经生长因子的激光共聚焦 照片(B) ； 在外加电刺激条件下(沿取向方向施加100mV/cm的电压)， 未负载神经生长因子 的激光共聚焦照片 (C) 及负载神经生长因子的激光共聚焦照片 (D) ； 0032 图 6 为导电型支架的循环伏安曲线图及拟合方程。 具体实施方式 0033 下面结合具体实施例， 。
18、进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0034 实施例 1 0035 称取蛋白丝素 0.1g， 乳酸 - 己内酯共聚物 0.3g， 溶于 5ml 六氟异丙醇 (HFIP)， 乳 酸 - 己内酯共聚物分子量为 Mw 30 万， 以 200r/min. 的速率磁力搅拌 5 小时混合均匀得 到总浓度 8 (w/v) 的溶液 ； 混合均匀后分别加入 60mg 的聚苯胺 (Mn 1.5 万 ) 和樟脑磺 酸。
19、， 再以 300r/min. 的速率磁力搅拌 48h 混合均匀制得皮层静电纺溶液， 取 10g/ml 的神 经生长因子 (NGF) 超纯水溶液 1ml 作为芯层静电纺溶液。将壳层静电纺丝溶液装入注射 器， 微量注射泵的推进速度控制为 1ml/h， 将芯层静电纺丝溶液装入另一个注射器， 微量注 射泵的推进速度控制为 0.2ml/h。同轴静电纺丝所用的同心轴芯层溶液通过的针头为 8 号 针头， 壳层溶液通过的针头为 16 号针头， 针头与 12kV 的高压相连。用铝箔平整包缠的直径 为 5cm 的滚筒接收纳米纤维丝， ， 电机控制滚筒转速 4000r/min.， 同心轴喷丝头和滚筒接收 装置之间的。
20、距离为 5cm， 5h 后铝箔上接收到一定厚度的取向纳米纤维膜。上述支架取下后 放入密闭容器， 用体积分数 75的乙醇进行蒸汽处理 24h， 处理完毕后真空干燥 48h， 去除 残留溶剂。在上述支架上种植大鼠肾上腺嗜铬神经瘤细胞 (PC-12)， 并沿纤维取向方向施 加 100mV/cm 的电刺激。结果表明 ： 在未电击的情况下， 未负载与负载神经生长因子的支架 上细胞的中间轴突长度分别为 0.04m 和 13.9m ； 在点击的情况下， 未负载与负载神经生 长因子的支架上细胞的中间轴突长度分别为 7.5m 和 19.7m。 0036 实施例 2 0037 称取蛋白丝素0.125g， 乳酸-己。
21、内酯共聚物0.375g， 溶于5ml六氟异丙醇(HFIP)， 乳酸 - 己内酯共聚物分子量为 Mw 30 万， 以 200r/min. 的速率磁力搅拌 5 小时混合均匀 得到总浓度10(w/v)的溶液 ； 混合均匀后分别加入80mg的聚苯胺(Mn1.5万)和樟脑 磺酸， 再以 300r/min. 的速率磁力搅拌 48h 混合均匀制得皮层静电纺溶液， 取 10g/ml 的 神经生长因子 (NGF) 超纯水溶液 1ml 作为芯层静电纺溶液。将壳层静电纺丝溶液装入注射 器， 微量注射泵的推进速度控制为 1ml/h， 将芯层静电纺丝溶液装入另一个注射器， 微量注 射泵的推进速度控制为 0.2ml/h。。
22、同轴静电纺丝所用的同心轴芯层溶液通过的针头为 8 号 针头， 壳层溶液通过的针头为 16 号针头， 针头与 13kV 的高压相连。用铝箔平整包缠的直径 为 5cm 的滚筒接收纳米纤维丝， 电机控制滚筒转速 4000r/min.， 同心轴喷丝头和滚筒接收 装置之间的距离为 6cm， 5h 后铝箔上接收到一定厚度的取向纳米纤维膜。上述支架取下后 采用放入密闭容器、 用体积分数 75的乙醇进行蒸汽处理 48h， 处理完毕后真空干燥 72h， 说 明 书 CN 104225685 A 5 4/4 页 6 去除残留溶剂。 说 明 书 CN 104225685 A 6 1/3 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104225685 A 7 2/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104225685 A 8 3/3 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104225685 A 9 。