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1、10申请公布号CN104046700A43申请公布日20140917CN104046700A21申请号201410322626422申请日20140708C12Q1/6820060171申请人山东省农业科学院生物技术研究中心地址250100山东省济南市历城区工业北路202号72发明人张全芳步迅刘艳艳54发明名称一种快速鉴定驴皮、马皮和骡子皮的检测试剂盒57摘要本发明从马、驴和骡子的遗传背景出发，创新性的同时使用CKM核基因NDNA和线粒体基因组DNAMTDNA的16SRRNA基因对驴、马、马骡和驴骡进行准确的鉴别，本试剂盒采用分子信标探针MB法进行5重多色荧光定量PCR检测技术，同时能检测驴、。
2、马、马骡及驴骡四种成分，而且本试剂盒中加入外源性内参作为内标，可检测和避免因样本含有PCR抑制物而产生的假阴性结果。5重多色荧光定量PCR是在同一管内检测，无需开盖，不易污染，具有准确稳定、操作简单，灵敏度极高特异性强等有益效果，为驴皮、马皮及骡子皮的鉴定探索了新的途径。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图4页10申请公布号CN104046700ACN104046700A1/1页21一种鉴定驴皮、马皮、骡子皮的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用的引物和探针为马和驴CKM核基因NDNA通用引物CKMF5AA。
3、GAAGCTGCGGGACAAGG3CKMR5CAGCCCACGGTCATGATGA3马的CKM核基因特异探针CKMMP5CGCGAGAGTGGAAAGAATGAGAGGCAGAACTCGCG3驴的CKM核基因特异探针CKMLP5CGCGAGAGTGGAAAAAATGAGAGGCAGAACTCGCG3马和驴的线粒体16SRRNA基因通用引物MTUF5ATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGC3MTUR5AGGATTTTCTGTTCTCCGAGGTCAC3马的线粒体16SRRNA基因特异探针MTMP5CGCCACAAACCTAACCTTCAGGGACAGGCG3驴的线粒体16SRRNA基。
4、因特异探针MTLP5CGCCAAACCTAACCCTCAGGGACAACCGCC3内参引物IACF5ACCGTTACCGAGTCCAGGTG3IACR5TTCGGACTCGATCAGAGCAC3内参探针IACP5CGACGGTCCTTTCTAATGTTGCGTCG3。权利要求书CN104046700A1/7页3一种快速鉴定驴皮、马皮和骡子皮的检测试剂盒技术领域0001本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴定动物物种的方法，特别涉及利用一种分子信标探针MB荧光定量PCR检测法鉴定驴皮、马皮和骡子皮的检测方法及试剂盒。背景技术0002阿胶为马科动物驴的去毛之皮经熬制而成的胶状物，医疗保健。
5、价值极高，具有补血养血、美容养颜、延年益寿、强筋健骨，增强免疫力等五大功能优势，因此阿胶作为一种保健食品在市场上占有重要的位置，深受消费者的青睐。然而随着胶类市场的不断发展，随着熬胶原料供应的紧张和原料价格上涨，目前一些不法分子在利益的驱使下，用马皮、骡子皮、牛皮或者猪皮等低廉皮张冒充驴皮现象越来越多，为医药保健品市场安全带来巨大隐患。当前毛皮鉴定方法滞后，国内外动物毛皮的鉴定仍然没有统一的技术标准或较成熟的鉴别方法，传统的宏观观察法、显微镜观察法具有一定主观性，无法准确和快速的区分皮张，对于形态相似的马皮，骡子皮和驴皮则更加难以区分。0003近年来随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生。
6、物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据动物纤维结构形态的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。其中，公开号为CN1605868A的专利所述方法是通过选取细胞色素B基因聚合酶链式反应限制性酶切片段长度多态性方法制备的DNA指纹图谱来鉴定，但该方法不能对骡子与驴或骡子与马加以区分。其原因在于从骡子的遗传背景分析，母马与公驴所生的种间杂种叫马骡，反之母驴配公马所生的种间杂种叫驴骡。马骡和驴骡在形态结构、生理特性和生活习性方面的差异，主要有细胞质遗传和遗传印记共同作用的结果。马和驴在正反交中，受精卵的核。
7、基因相同。由马的32条染色体和驴的31条染色体提供；受精卵的质基因不同，马骡主要由母马卵细胞的线粒体提供，驴骡主要有母驴卵细胞的线粒体提供。如果是驴骡，同样有驴的线粒体基因，如果是马骡就含有马的线粒体基因，所以仅利用线粒体细胞色素B基因无法同时鉴别马、驴与骡子。因此，本发明首次将线粒体16SRRNA基因和核基因结合，建立的一种快速鉴别驴皮、马皮、骡子皮的荧光定量检测方法对阿胶原料驴皮的快速鉴定具有重要的创新性实践意义，填补了国内外马科动物种属鉴定方法的空白。发明内容0004本发明的目的是提供一种鉴定动物物种的方法，特别涉及一种分子信标探针MB荧光定量PCR检测法鉴定驴皮、马皮、骡子皮的方法及试。
8、剂盒。0005为实现上述目的，该试剂盒包括马和驴共有的一对核基因CKM引物及对应的马和驴2种核基因特异探针，一对马和驴线粒体16SRRNA基因的共有引物及对应的2种特异检测探针，另外还有一组外源性内参体系包括人工合成一种外源性内参序列并构建的质粒载体作模板，和对应的外源引物及探针，可检测和避免因样本含有PCR抑制物而产生说明书CN104046700A2/7页4的假阴性结果。本发明从马、驴和骡子的遗传背景出发，创新性的同时选择了CKM核基因NDNA，以及线粒体基因组DNAMTDNA的16SRRNA基因进行分析，设计分子信标探针MB特异探针作为鉴定马、驴和骡子的依据，其理由一是从骡子的遗传背景分析。
9、，母马与公驴所生的种间杂种叫马骡，反之母驴配公马所生的种间杂种叫驴骡。马和驴在正反交中，受精卵的核基因相同。由马的32条染色体和驴的31条染色体提供；受精卵的质基因不同，马骡主要由母马卵细胞的线粒体提供，驴骡主要有母驴卵细胞的线粒体提供。因此，可以推断出当待测样本检出马、驴的核基因以及驴的线粒体基因时就可以确定为驴骡；当待测样本检出马，驴的核基因以及马的线粒体基因时即为马骡；当待测样本只有马基因与马线粒体时，即为马；当待测样本既有驴的核基因又有驴线粒体基因时即为驴。二是本发明根据相关文献报道克隆得到CKM基因及线粒体MTDNA基因组上的16SRRNA基因，对两种基因序列分析比对发现在马与驴物种。
10、间基因序列具有稳定性遗传差异，以此设计马和驴的特异探针。0006分子信标具有高灵敏性，高特异性、相较于TAQMAN探针荧光本底低，不仅可以用于基因的定量、定性检测，还可以应用到基因点突变等分析，基于这些优点，本试剂盒采用分子信标探针MB法进行5重五色荧光定量PCR检测技术，同时能检测驴、马、驴骡及马骡四种成分，而且本试剂盒中加入外源性内参作为内标，可检测和避免因样本含有PCR抑制物而产生的假阴性结果。0007本试剂盒包括PCR缓冲液、MGCL2和DNTPS的反应混合物，TAQ酶，超纯水，高特异性扩增的驴、马、驴骡及马骡的引物混合物，对上述物种进行特异检测的分子信标探针混合物，以及内标引物，人工。
11、构建的内标质粒及探针混合物。0008本试剂盒在引物设计方面根据NCBI数据库中查找驴和马的CKM核基因NDNA及线粒体MTDNA基因组上的16SRRNA基因序，应用同源分析工具CLASTER软件对其同源性比对，利用引物设计软件PRIMER50根据筛选出的核心片段两端相似序列设计一对通用引物，使用BEACONDESIGNER20设计特异分子信标MB探针，设计好的探针进一步用在线软件HTTP/MFOLDRNAALBANYEDU/QMFOLD确定其二级结构，设计好的探针、引物NCBI数据库中BLAST分析其特异性，探针分别采用5种不同发光基团，对各个探针的5端进行荧光素修饰，马的NDNA特异探针CK。
12、MMP用CY3标记，驴的NDNA特异探针CKMLP用ROX标记，马的MTDNA探针MTMP用FAM标记，驴的MTDNA探针MTLP用JOE标记，内标探针IACP用CY5标记，3端的淬灭基团均用DABCYL修饰。0009用于快速准确鉴定驴皮、马皮、骡子皮的检测试剂盒所使用的引物为0010马和驴CKM核基因NDNA通用引物0011CKMF5AAGAAGCTGCGGGACAAGG30012CKMR5CAGCCCACGGTCATGATGA30013马的CKM核基因特异探针0014CKMMP5CGCGAGAGTGGAAAGAATGAGAGGCAGAACTCGCG30015驴的CKM核基因特异探针0016。
13、CKMLP5CGCGAGAGTGGAAAAAATGAGAGGCAGAACTCGCG30017马和驴的线粒体16SRRNA基因通用引物0018MTUF5ATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGC3说明书CN104046700A3/7页50019MTUR5AGGATTTTCTGTTCTCCGAGGTCAC30020马的线粒体16SRRNA基因特异探针0021MTMP5CGCCACAAACCTAACCTTCAGGGACAGGCG30022驴的线粒体16SRRNA基因特异探针0023MTLP5CGCCAAACCTAACCCTCAGGGACAACCGCC30024内参引物0025IACF5ACC。
14、GTTACCGAGTCCAGGTG30026IACR5TTCGGACTCGATCAGAGCAC30027内参探针0028IACP5CGACGGTCCTTTCTAATGTTGCGTCG30029本发明所用PCR复合扩增反应的条件优先选用20L的PCR扩增体系包括PREMIXPH值为89，镁离子浓度为25MM，4种DNTP的终浓度各为250M，TAQ酶的用量为02U/L，引物探针混合物中的引物、探针的终浓度为041M，及1PG/UL的内标DNA。003020UL反应体系如下0031试剂名称浓度用量LHSTAQ5U/L02PREMIX10X2PRIMERMIX2UM2PROBEMIX2UM2IACD。
15、NA1PG/UL1DNATEMPLATE120NG/L2双蒸水108总体积2000320033使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应需在4通道的任何型号的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序951MIN；45个循环,955S，6035S，在此收集荧光信号。0034本发明所检测驴皮、马皮和骡子皮的基因组DNA采用CHELEX100加热释放DNA及玻璃奶纯化基因组DNA的办法进行提取，具体实施步骤如下00351取样用剪刀剪取小块驴皮、马皮及骡子皮，每份剪取一块大约05CM3，约50MG装到EP管中，加入2粒钢珠，放入液氮罐速冻，然后在组织研磨机上，以1000次/MIN速度震荡研磨1MIN，向E。
16、P管中加1ML去离子水，高速震荡，10000RPM/MIN短暂离心，倾去上清液，重复2次。说明书CN104046700A4/7页600362向离心管中加入400UL消化缓冲液，该缓冲液PH80，由200MMTRISHCL，25MMEDTA，100MMNACL，05SDS构成，加入5的CHELEX100380UL然后置于5060度水浴中保温，期间不时轻轻搅拌混匀，直到颗粒状物全部溶解，待溶液冷却至室温后，加入20MG/ML蛋白酶K20UL，混匀，56度保温1H，期间不时轻微摇匀。00373高速震荡510S，100沸水浴8MIN；00384离心吸取上清转至新的EP管中，加入等体积氯仿，充分混匀，1。
17、2000RPM离心10MIN，小心将上清转至新的EP管中；00395向收集液体中加GLASSMILK5UL,加600ULGDNABINDINGBUFFER6MNACL,充分混匀，65水浴15MIN，中间要反转几次；00406室温放置5MIN，中间要反转几次；4000RPM离心1MIN，弃上清，留管底；0041770酒精500UL洗涤8000R/MIN离心1MIN，重复此步骤2次；00428加入500UL无水乙醇，；吹打悬浮，洗涤8000R/MIN离心1MIN，弃上清；004398000R/MIN离心30S，用10UL枪头吸走残余液体，室温干燥10MIN；004410加50ULTEPH70705。
18、MIN水浴，离心，吸取上清转移至新的离心管中，20度保存。004511用NANODROP检测两种方法提取DNA浓度，做好记录；0046本发明中使用的方法提取的基因组DNA产量高，纯度好，可以消除对后续荧光定量PCR反应条件的抑制，可以应用于更高级别分子生物学实验检测，如DNA测序，基因克隆等。本发明与现有的检测技术相比其优点在于本发明从马、驴和骡子的遗传背景出发，创新性的同时使用CKM核基因NDNA和线粒体基因组DNAMTDNA的16SRRNA基因对驴、马、马骡和驴骡进行准确的鉴别，本试剂盒采用分子信标探针MB法进行5重多色荧光定量PCR检测技术，同时能检测驴、马、马骡及驴骡四种成分，而且本试。
19、剂盒中加入外源性内参作为内标，可检测和避免因样本含有PCR抑制物而产生的假阴性结果。5重多色荧光定量PCR是在同一管内检测，无需开盖，不易污染，具有准确稳定、操作简单，灵敏度极高特异性强等有益效果，为驴皮、马皮及骡子皮的鉴定探索了新的途径。附图说明0047图1A马线粒体MTMP探针灵敏度检测，001NG马皮DNA模板仍有扩增曲线。0048图1B驴线粒体MTLP探针灵敏度检测，001NG驴皮DNA模板有扩增曲线。0049图1C马核基因CKMMP探针灵敏度检测，01NG马皮DNA有扩增曲线。0050图1D驴核基因CKMLP探针灵敏度检测，01NG的驴皮基因组DNA有扩增曲线。0051图2A同时检出。
20、核基因驴源性探针CKMLP扩增曲线，线粒体基因驴源性探针MTLP扩增曲线，该物种鉴定为驴。0052图2B同时检出核基因马源性探针CKMMP扩增曲线，线粒体基因马源性探针MTMP扩增曲线，该物种鉴定为马。0053图2C同时检出核基因驴源性探针CKMLP和马源性探针CKMMP扩增曲线，检出线粒体基因驴源性探针MTLP扩增曲线，该物种鉴定为驴骡。0054图2D同时检出核基因驴源性CKMLP探针和马源性探针CKMMP扩增曲线，检出线粒体基因马源性探针MTMP扩增曲线，该物种鉴定为马骡。说明书CN104046700A5/7页7具体实施方式00551特异性试验0056分别以羊肉、牛肉、鸭肉、狐狸肉、鸡肉、。
21、水貂肉和猪肉中提取的基因组DNA和从马、驴及骡子中提取的基因组DNA为模板，按照上述优化的反应体系和反应条件进行荧光定量PCR，检测引物和探针的特异性。20L反应体系包含表10057表10058试剂名称浓度用量LHSTAQ5U/L02PREMIX10X2PRIMERMIX2UM2PROBEMIX2UM2IACDNA1PG/UL2DNATEMPLATE20NG/L2双蒸水108总体积200059结果显示，马、驴、马骡和驴骡均有CT值，而其他样本没有扩增。结果见表2。可见本试剂盒中的引物及探针具有很强的物种特异性。0060表200610062说明书CN104046700A6/7页800632灵敏度。
22、试验0064基因组DNA灵敏度试验0065按照专利所述驴皮等动物皮张基因组提取方法对马皮、驴皮及骡皮提取目标基因组DNA，用NANODROP定量到50NG，做10梯度稀释101，102，103，104，每个梯度均取2L为模板量，按照上述方法分别对马皮、驴皮及骡皮DNA检测以考察本试剂盒的灵敏度。结果显示图1，当荧光定量模板用量为001NG时线粒体DNA的探针MTMP，MTLP仍有扩增曲线；当荧光定量模板用量为01NG时，核基因CKMMP/LP探针仍有明显的扩增曲线，但当模板用量为001NG时基本无扩增曲线了，必须保证核基因CKMMP/LP探针及线粒体探针均有扩增曲线，所以该方法的检测限为01N。
23、G；00663、重复性试验0067分别取纯马，驴，及骡子DNA各3个样本，按照上述优化好的体系、PCR条件进行实时定量PCR，每个样品进行3次复孔的独立重复，考察方法的稳定性，结果见表2。结果显示每个样品的3次独立重复实验CT值得标准方差均小于05。说明检测结果重复性好，检测稳定性高。0068表3重复性试验结果0069说明书CN104046700A7/7页9007000714对某家阿胶制品公司收购的驴皮检测0072使用优化后的荧光定量PCR方法，对某家阿胶制品公司收购的驴皮检测，验证方法的使用价值。样本的分类与检测结果见表4及图2。由表中可见，收购的驴皮中，检出马皮及骡子皮。0073表40074说明书CN104046700A1/4页10图1A图1B说明书附图CN104046700A102/4页11图1C图1D说明书附图CN104046700A113/4页12图2A图2B说明书附图CN104046700A124/4页13图2C图2D说明书附图CN104046700A13。