一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法.pdf

本发明公开了一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法。首先将全血抗凝、离心制得血小板丰富血浆，然后通过深度离心和洗涤获得洗涤血小板，将其与抗肿瘤药物混合反应，得到抗肿瘤药物的血小板载药体系。该载药体系具有来源广、生物相容性高、载药率高等优势，且可增加药物在肿瘤组织的释放，同时增加药物的抗肿瘤效应，减轻了化疗药物的毒副作用,对提高患者生活质量和医疗质量具有重要意义，并且具有一定的社会和经济效益，具有广阔的应用前景。

1.  一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）环境温度为20±5℃，在全血中加入重量百分含量为2-4%柠檬酸钠溶液，离心后得到血小板丰富血浆；
（2）将步骤（1）得到的血小板丰富血浆再深度离心，并用PBS缓冲液洗涤至不再含有血浆及其他血液成分，得到洗涤血小板；
（3）将步骤（2）得到的洗涤血小板与抗肿瘤药物在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1~2小时，得到抗肿瘤药物与血小板反应物；
（4）将步骤（3）得到的抗肿瘤药物与血小板反应物通过琼脂糖凝胶2B分离柱分离，并离心洗涤，得到携载抗肿瘤药物的血小板载药体系。

2.  根据权利要求1所述的一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，全血与重量百分含量为2-4%柠檬酸钠溶液的体积比为7:1~10:1。

3.  根据权利要求2所述的一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，全血与重量百分含量为2-4%柠檬酸钠溶液的体积比为9:1。

4.  根据权利要求1所述的一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中离心为以1200rpm离心10-15min。

5.  根据权利要求1所述的一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中深度离心为以3600rpm离心8~12min。

6.  根据权利要求1所述的一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）得到洗涤血小板计数控制在(2.5-3.0)×10⁵/ul。

7.  根据权利要求1所述的一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中抗肿瘤药物为蒽环类抗肿瘤药物、生物碱类抗肿瘤药物或烷化剂类抗肿瘤药物的一种，抗肿瘤药物的浓度为0.05~0.15mmol/L。

8.  根据权利要求1所述的一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中抗肿瘤药物与洗涤血小板的体积比为（1~4）:1。

9.  根据权利要求8所述的一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中抗肿瘤药物与洗涤血小板的体积比为2:1。

10.  根据权利要求1所述的一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中离心洗涤是用PBS缓冲液以12000rpm离心洗涤2~3次，每次2~4分钟。

一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法
技术领域
本发明属于生物药物载体制备领域，尤其涉及一种以血小板作为药物载体携载抗肿瘤药物的制备方法。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康和生命的一大疾病，且发病率有逐年升高的趋势，目前主要的治疗方法包括手术治疗、化疗和放疗，但对于一些晚期病人通常不能行手术治疗，另外对于一些患有恶性程度较高的肿瘤的患者，在手术治疗前后往往会辅以化学治疗，因而化疗在当今肿瘤的治疗中仍占有很重要的地位。但是化疗具有明显的副作用，包括骨髓抑制、免疫功能低下、消化道反应等，所以研究和开发能将抗肿瘤药物传递到肿瘤细胞内部或周围以期较少副反应的药物载体具有十分重要的意义。
目前而言，药物载体主要包括磁性纳米药物载体、脂质体载体、微粒载体等，但它们均存在诸多缺点，如载药率不高，稳定性较差，毒性作用较强等，因而生物药物载体凭借其良好的生物相容性、缓控释药等特点在众多载药体系中脱引而出。
以生物作为药物载体的研究已进行了很多年，研究较为深入的包括白蛋白载药和红细胞载药等。临床上应用成功的典型范例是以人血清白蛋白为载体的紫杉醇产品，研究显示其可在肿瘤细胞和组织中蓄积，可用于治疗乳腺癌、卵巢癌等。另外的研究显示，经红细胞包载后释放的甲氨蝶呤和长春新碱等药物，抑制肿瘤生长及诱导其凋亡的效果较裸药更为显著。
血小板是从骨髓成熟的巨核细胞脱落下来的碎片，直径约2um，在成人血液中数量约为（1-3）×10¹¹个/L，其寿命约7-14天，平均9天，衰老的血小板大多被肝脏中的Kupfer细胞清除，因而血小板具有良好的生物相容性、安全性及较长的血循环时间。血小板在止血、愈合伤口、血栓形成等过程中起着重要作用，并且与肿瘤的发生发展也具有密切的关系。肿瘤细胞经过一系列反应活化血小板，活化的血小板通过肿瘤细胞诱导的血小板聚集（TCIPA）作用聚集在肿瘤细胞周围，形成血小板-肿瘤细胞复合物，正是这种作用促进了血小板与肿瘤细胞的粘附，并且活化后的血小板将摄取的药物释放，而血小板摄取药物及小颗粒的作用与巨噬系统的吞噬作用不同，即不会将内吞的物质杀死和清除，从而保证了药物原有的结构和活性，保留了药效。另外研究显示，血小板的载药率远高于纳米颗粒的载药率，且血小板与细胞毒药物具有协同作用，可以增加其杀伤作用。因此以血小板作为药物载体，具有含量丰富、生物相容性高、载药率高、增加细胞毒药物作用的优势，但目前就血小板作为药物载体的相关研究仍较少。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种以血小板作为药物载体携载柔抗肿瘤药物的制备方法，制成包载抗肿瘤药物的血小板载药体系，具有载药率高、在肿瘤组织的酸性环境中释放率高，并且可增加药物的抗肿瘤特性的优点。
为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的。
一种携载抗肿瘤药物的血小板载药体系的制备方法，包括以下步骤：
（1）环境温度为20±5℃，在全血中加入重量百分含量为2-4%柠檬酸钠溶液，离心后得到血小板丰富血浆；
（2）将步骤（1）得到的血小板丰富血浆再深度离心，并用PBS缓冲液洗涤至不再含有血浆及其他血液成分，得到洗涤血小板；
（3）将步骤（2）得到的洗涤血小板与抗肿瘤药物在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1~2小时，得到抗肿瘤药物与血小板反应物；
（4）将步骤（3）得到的抗肿瘤药物与血小板反应物通过琼脂糖凝胶2B分离柱分离，并离心洗涤，得到携载抗肿瘤药物的血小板载药体系。
所述步骤（1）中，全血与重量百分含量为2-4%柠檬酸钠溶液的体积比为7:1~10:1。优选为9:1。
所述步骤（1）中离心为以1200rpm离心10~15min。
所述步骤（2）中深度离心为以3600rpm离心8~12min。
所述步骤（2）得到洗涤血小板计数控制在(2.5-3.0)×10⁵/ul。
所述步骤（3）中抗肿瘤药物为蒽环类抗肿瘤药物、生物碱类抗肿瘤药物或烷化剂类抗肿瘤药物的一种，抗肿瘤药物的浓度为0.05~0.15mmol/L。
所述蒽环类抗肿瘤药物优选柔红霉素，生物碱类抗肿瘤药物优选长春新碱，烷化剂类抗肿瘤药物优选环磷酰胺。
所述步骤（3）中抗肿瘤药物与洗涤血小板的体积比为1~4:1。优选为2:1。
所述步骤（4）中离心洗涤是用PBS缓冲液以12000rpm离心洗涤2~3次，每次2~4分钟。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明将血小板作为生物载药系统，包载某些常见抗肿瘤药物应用于肿瘤的化学治疗中。通过将化疗药物包载于血小板中，增加了药物在肿瘤组织的释放，并且延长了药物在血液中的循环时间，同时血小板载体对细胞毒药物具有协同作用，以较少的药物剂量即达到相同的抗肿瘤作用，从而减少了对正常细胞、组织的损伤，减轻了化疗药物的毒副作用。血小板作为机体的一部分，包载药物后不会引起免疫排斥反应，避免了作为外来物的纳米载药系统存排斥反应的问题，同时血小板的含量丰富，其装载药物的量远远高于纳米载体，另外由于血小板可与肿瘤组织相粘附，实现了将药物选择性释放于特定部位的目的，有效的减轻了药物副作用。这对提高患者生活质量和医疗质量具有重要意义，并且具有一定的社会和经济效益，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1本发明制备的血小板携载柔红霉素的荧光显微镜图像；其中左图为单纯的血小板、右图为血小板携载了柔红霉素；
图2为单独血小板和血小板携载柔红霉素后的扫描电镜图像；其中左图为单纯的血小板、右图为血小板携载了柔红霉素；
图3为血小板载柔红霉素的体外释放曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种携载柔红霉素的血小板载药体系的制备方法，该方法包括如下步骤：
第一步： 在环境温度为20±5℃的室温条件下，在取得的全血中加入重量百分比为3.2%柠檬酸钠溶液抗凝，全血与柠檬酸钠溶液的体积比为9:1，1200rpm离心12min后得到血小板丰富血浆；
第二步：血小板丰富血浆以3600rpm离心10min，并用PBS缓冲液洗涤三次，使其不再含有血浆及其他血液成分，弃去上清，得到洗涤血小板，控制血小板计数为（2.5-3.0）×10⁵/ul。
第三步：将0.1mmol/L的柔红霉素与制得的洗涤血小板混合，柔红霉素与洗涤血小板的体积比为2:1，轻轻将其吹打至混合均匀。将混合物在37±0.5℃的避光环境中以100rpm震荡反应1小时，然后通过琼脂糖凝胶2B分离柱分离，再用PBS缓冲液以12000rmp离心洗涤两次，每次3分钟，即得到新型的血小板携载柔红霉素的载药体系。
采用上述方法制备出的携载柔红霉素的血小板载药体系，通过荧光显微镜和扫描电镜进行表征，结果表明柔红霉素可被包载于血小板内，且未影响血小板的形态如图1、图2所示。采用高效液相色谱法计算得到其包封率和包载率分别为61.3%和83.4%，表明药物的包封率及包载率均较高。通过观察不同pH环境中药物的释放率，证明酸性环境中药物的释放率明显增加如图3所示，表明血小板载药体系可减少细胞毒药物在正常细胞、组织的释放，从而降低化疗药物的毒副作用。
下面通过试验对本实施例的有益效果作进一步的详细说明。
1、由于柔红霉素具有自发荧光性，通过荧光显微镜观察血小板载药体系，可见药物被包载于血小板内如图1所示，通过高效液相色谱法定量计算其包封率和包载率，分别为61.3±1.3%和83.4±1.7%，表明血小板载药体系对蒽环类抗肿瘤药物具有较高的包封及包载率。通过扫描电镜，发现载药后的血小板形态与单纯的血小板形态相似，无明显改变如图2所示，说明药物不会对血小板造成明显影响，另外通过CCK-8法检测到血小板对肿瘤细胞无明显影响，提示血小板可作为安全、高效的药物载体。
2、本发明制备的携载柔红霉素的血小板载体，药物释放曲线结果显示由血小板包载的药物在肿瘤组织的酸性环境中释放较多且具有缓释作用，而在中性和碱性环境中的释放明显减少如图3所示，因此降低了化疗药物对机体的毒副作用，并延长了药物在体内的半衰期。
3、CCK-8实验结果显示：血小板携载柔红霉素的载药体系体外作用于人类淋巴瘤细胞株Raji细胞株后，与裸药相比对细胞生长的抑制作用更加明显。
4、通过流式细胞术和DAPI染色，发现由血小板携载后的柔红霉素与裸药相比，可促进Raji细胞的凋亡，并且用流式细胞术检测到血小板载药体系增加了肿瘤细胞内的药物浓度，从某种程度上解释了由血小板携载后的柔红霉素抗肿瘤作用增加的原因。
实施例2
一种携载长春新碱的血小板载药体系的制备方法，该方法包括如下步骤：
第一步： 在环境温度为20±5℃的室温条件下，在取得的全血中加入重量百分比为2%柠檬酸钠溶液抗凝，全血与柠檬酸钠溶液的体积比为7:1，1200rpm离心10min后得到血小板丰富血浆；
第二步：血小板丰富血浆以3600rpm离心8min，并用PBS缓冲液洗涤两次，使其不再含有血浆及其他血液成分，弃去上清，得到洗涤血小板，控制血小板计数为（2.5-3.0）×10⁵/ul。
第三步：将0.05mmol/L的长春新碱与制得的洗涤血小板混合，长春新碱与洗涤血小板的体积比为1:1，轻轻将其吹打至混合均匀。将混合物在37±0.5℃的避光环境中以100rpm震荡反应2小时，然后通过琼脂糖凝胶2B分离柱分离，再用PBS缓冲液以12000rmp离心洗涤三次，每次2分钟，即得到新型的血小板携载长春新碱的载药体系。
通过高效液相色谱法定量计算其包封率和包载率，分别为51.1±0.7%和80.1±1.1%，表明血小板载药体系对生物碱类抗肿瘤药物具有较高的包封及包载率。
实施例3
一种携载环磷酰胺的血小板载药体系的制备方法，该方法包括如下步骤：
第一步： 在环境温度为20±5℃的室温条件下，在取得的全血中加入重量百分比为4%柠檬酸钠溶液抗凝，全血与柠檬酸钠溶液的体积比为10:1，1200rpm离心15min后得到血小板丰富血浆；
第二步：血小板丰富血浆以3600rpm离心12min，并用PBS缓冲液洗涤三次，使其不再含有血浆及其他血液成分，弃去上清，得到洗涤血小板，控制血小板计数为（2.5-3.0）×10⁵/ul。
第三步：将0.05mmol/L的环磷酰胺与制得的洗涤血小板混合，环磷酰胺与洗涤血小板的体积比为4:1，轻轻将其吹打至混合均匀。将混合物在37±0.5℃的避光环境中以100rpm震荡反应1.5小时，然后通过琼脂糖凝胶2B分离柱分离，再用PBS缓冲液以12000rmp离心洗涤两次，每次4分钟，即得到新型的血小板携载环磷酰胺的载药体系。
通过高效液相色谱法定量计算其包封率和包载率，分别为63.1±3.3%和84.1±2.3%，表明血小板载药体系对烷化剂类抗肿瘤药物具有较高的包封及包载率。
本发明按照上述实施例进行了说明，应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。