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1、(10)申请公布号 CN 104030991 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104030991 A (21)申请号 201410280482.0 (22)申请日 2014.06.20 CCTCC NO:M 2014229 2014.05.27 C07D 239/47(2006.01) C12P 17/12(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 淮海工学院 地址 222000 江苏省连云港市新浦区苍梧路 59 号 (72)发明人 夏艳秋 朱强 詹永成 陈静 张晓君 史大华 郭瑛 许福泉 阎斌伦 (74)。
2、专利代理机构 江苏银创律师事务所 32242 代理人 何震花 (54) 发明名称 一种制备巨杆菌素 Bacimethrin 的方法 (57) 摘要 本发明公开了利用海洋细菌发酵制备巨杆菌 素 Bacimethrin 的方法。巨杆菌素 (Bacimethrin ,4-Amino-2-methoxy-5-pyrimidylmethanol) 分 子量为 155.16， 分子式为 C6H9N3O2。通过天然产 物分离方法从海洋解淀粉芽孢杆菌 B5(Bacillus amyloliquefaciens strain chenj-5) 发酵产物 中分离得到。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl.。
3、 权利要求书 3 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书6页 序列表3页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104030991 A CN 104030991 A 1/3 页 2 1. 一种制备巨杆菌素 Bacimethrin 的方法， 其特征在于步骤如下 ： A 海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 的发酵产物的预处理 ： 海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 的发酵产物 煮沸 10 分钟， 静置过夜或离心分离， 去除固体获得上清液 ； 将上清液依次通过截留分子量 为 10000Da、 1000Da 和 300Da 的纳滤。
4、膜， 获得小于 300Da 分子量的膜下过滤液 ； 将此过滤液 真空浓缩至原体积的 1/5 得到浓缩液 ； 其中所述的海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 在国家知识产权局指定的保藏单位保藏， 保藏日期为 2014 年 5 月 27 日， 保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心， 保藏号为 CCTCCNO:M2014229。 B 将浓缩液移至分液漏斗或萃取罐中， 按体积比为 1:1 加入乙酸乙酯充分混匀萃取 10 分钟， 静置 10 分钟水相和有机相分离， 收集乙酸乙酯相 ； 再在残余水相中加入等体积的乙 酸乙酯按上述方法萃取， 合计萃取3次 ； 合并3次的乙酸乙酯萃取液， 减压浓缩， 回收乙酸乙 酯， 获。
5、得乙酸乙酯萃取相的浸膏。 C 称取乙酸乙酯萃取相的浸膏， 用甲醇溶解浸膏并拌入 ODS 填料中， 自然挥干或减压干 燥后装入 20mm*100mm 的制备液相柱的预装柱中 ； 利用 3 个柱体积的 5质量浓度的甲醇水 溶液， 按16ml/min的流速润洗25mm*500mm的ODS制备柱 ； 连接上上述的预装柱， 梯度洗脱， 按每管 45ml 接取洗脱液， 278nm 处检测洗脱峰， 收集 15.35min 处附近的洗脱峰， 并依次标 号 ； 利用高效液相色谱测定各接收管浓缩物中巨杆菌素的纯度 ； 所述梯度洗脱如下 ： 表 1 中压制备液相梯度洗脱表 所述高效液相色谱检测条件如下 ： 权 利 。
6、要 求 书 CN 104030991 A 2 2/3 页 3 C18 柱型号为 Shim-pack VP-ODS， 内径 4.6mm， 柱长 250mm， 填充介质为 C18 ； 检测波长 ： 278nm ； 柱温箱温度 ： 30 ； 上样量为 5ul， 流动相的流速为 1ml/min ； 流动相由 A 液和 B 液组成 ； A 液 ： 甲醇 ； B 液 ： 纯水 ； 用 10甲醇等度洗脱。 D 合并上述巨杆菌素纯度大于 85以上的接收管， 真空减压浓缩至原体积的 1/5， 加入 少量巨杆菌素晶种， 在 15进行结晶 ； 待晶型长大后， 移去母液 ； 利用少量纯甲醇洗巨杆菌 素表面残液， 再加。
7、入少量纯甲醇溶解巨杆菌素结晶， 于 15下进行重结晶， 待晶型长大后， 移去母液， 利用少量纯甲醇洗去巨杆菌素表面残液， 获得巨杆菌素纯晶体。 2. 根据权利要求 1 所述的一种制备巨杆菌素 Bacimethrin 的方法， 其特征为所述海洋 解淀粉芽孢杆菌 B5 的发酵产物通过如下方法制备获得 ： A菌种的活化 ： 取海洋解淀粉芽孢杆菌B5， 采用划线法接种于海水TSB固体斜面培养基 上， 28培养 18 小时， 得到对数生长期的斜面培养物 ； 其中海水 TSB 固体斜面培养基的配置方法为 ： 称取胰蛋白胨 17g， 大豆蛋白胨 3g， 磷 酸氢二钾 2.5g， 葡萄糖 2.5g， 15g 。
8、琼脂粉利用陈海水加热搅拌溶解后， 加陈海水定容至 1000ml， 利用 NaOH 调整 PH 7.27.5， 再在 121条件下灭菌 15min 后获得海水 TSB 固体 斜面培养基。 B 种子液的制备 ： 将海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 固体斜面培养物在无菌条件下， 挑取 2-3 环菌体接种到装有 100mL 无菌海水 TSB 液体培养基的 500ml 三角瓶中 28、 180r/min 的条 件下摇床培养 18 小时， 获得海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 种子液 ； 其中海水 TSB 液体培养基的配置方法为 ： 称取胰蛋白胨 17g， 大豆蛋白胨 3g， 磷酸氢二 钾2.5g， 葡萄糖2.5g， 利。
9、用陈海水加热搅拌溶解后， 加陈海水定容至1000ml， 利用NaOH调整 PH 7.27.5， 再在 121条件下灭菌 15min 后获得海水液体培养基。 C 发酵培养 ： 在通气搅拌式发酵罐内加入巨杆菌素发酵培养基， 在 121下维持 15min 灭菌后， 接入种子液搅拌发酵， 获得发酵产物。种子液预先利用无菌海水调整种子液的浓 度至 2.0*107cfu/ml， 种子液的接种量按 2 (v/v) 接入 ； 搅拌发酵环境参数为 ： 通气量 1.2vvm， 温度为 28， 搅拌速度为每分钟 150 转 ； 发酵时间为 36 小时。 其中巨杆菌素发酵培养基的配置方法为 ： 按照质量体积百分比加入。
10、葡萄糖 0.25， NaCl2， 豆饼粉 1.7， K2HPO30.25， 利用水加热搅拌溶解后， 利用碱水调整 PH 7.2 7.5， 再在 121条件下灭菌 20min 后获得液体发酵培养基。 3. 根据权利要求 2 所述的一种制备巨杆菌素 Bacimethrin 的方法， 其特征为所述海洋 解淀粉芽孢杆菌 B5 的分离方法如下 ： 样品的采集 ： 在连云港海域用无菌采样袋及无菌采样工具采集海水、 海泥、 海带、 浒 苔、 裙带菜、 龙须菜、 紫菜样品， 注明样品名称、 采集日期以及采集地点 ； 样品的富集 ： 海水样品采集来的海水混匀， 取 10mL 加入到装有 100mL 无菌海水 T。
11、SB 液体富集培养基 的 500ml 三角瓶中， 28、 180r/min 的条件下摇床富集培养 2d 得到海水富集培养物 ； 海泥样品采集来的海泥采用五点法采样再混匀， 取 10g 海泥放入事先灭好菌的装有 100ml 海水 TSB 液体富集培养基的 500ml 三角瓶中， 28、 180r/min 的条件下摇床富集培养 2d 得到海泥富集培养物 ； 海带样品用无菌海水冲洗海带样品 3 次后， 放入无菌组织捣碎机中破碎至糊状， 取 权 利 要 求 书 CN 104030991 A 3 3/3 页 4 10g 海带破碎物加入到装有 100mL 无菌海水 TSB 液体富集培养基的 500ml 三。
12、角瓶中， 28、 180r/min 的条件下摇床富集培养 2d 得到海带富集培养物 ； 浒苔、 裙带菜、 龙须菜和紫菜样品处理同海带样品处理， 分别得到浒苔、 裙带菜、 龙须菜 和紫菜富集培养物 ； 海洋细菌的分离及纯化 ： 分别取 1mL 上述富集培养物的清液放入盛有 9mL 无菌海水 的试管中， 进行梯度稀释， 取10-4、 10-5、 10-6稀释度样品0.1mL涂布到直径9cm的海水TSB 固体分离培养基平板上， 28倒置培养 2d， 每个稀释梯度重复 3 次， 观察并挑取形态、 颜色 不同的菌落， 采用三区划线方法进行纯化， 得到若干海洋细菌纯菌株 ； 鳗弧菌拮抗菌的分离和筛选 ： 。
13、将鳗弧菌在无菌条件下， 挑取 2-3 环菌体接种到装有 100mL 无菌海水 TSB 液体培养基的 500ml 三角瓶中， 28、 180r/min 的条件下摇床培养 18 小时， 获得鳗弧菌种子液 ； 取 0.1ml 上述鳗弧菌种子液涂布到海水 TSB 固体平板上， 在上述 每只平板上均匀点种一株步骤中获得的海洋细菌， 在 28条件下进行共培养 36 小时， 观 察并测量抑菌圈大小， 筛选出对鳗弧菌具有拮抗效果的海洋细菌即得到海洋解淀粉芽孢杆 菌 B5。 4. 根据权利要求 3 所述的一种制备巨杆菌素 Bacimethrin 的方法， 其特征为所述 海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 的 gyrB 基。
14、因序列如序列表 SEQ ID NO.1 所示， NCBI 登记号为 JN859130.1。 5. 根据权利要求 4 所述的一种制备巨杆菌素 Bacimethrin 的方法， 其特征为所述海洋 解淀粉芽孢杆菌 B5 的 16SrDNA 基因序列如序列表 SEQ ID NO.2 所示。 权 利 要 求 书 CN 104030991 A 4 1/6 页 5 一种制备巨杆菌素 Bacimethrin 的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种小分子化合物制备方法， 特别是一种来源于海洋微生物的巨杆菌 素生产方法。 背景技术 0002 在动植物养殖业， 长期高剂量使用化学药物和抗生素的驱动下， 产生了耐。
15、药性的 病害菌， 使得动植物病害的防治越来越难， 同时对人类食物安全及人类健康形成了极大的 威胁， 人们不得不寻找新的防治方法。生物防治技术及新型绿色抗生素的开发应用成为了 新宠。从陆生的微生物分离化合物在一个世纪前就开始了， 想从中寻找新型物质的难度太 大， 而海洋微生物的发现及开发还刚刚开始。 0003 本文就从海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 发酵产物中首次分离获得巨杆菌素， 并研究发 现其具有较强的抑菌特性。 目前关于巨杆菌素的生产分离和生物活性分析还未见相关专利 及文献研究报道。 发明内容 0004 本发明提供一种巨杆菌素分离纯化方法 0005 A海洋微生物B5发酵产物预处理 ： 海洋微生物。
16、B5发酵产物煮沸10分钟， 静置过夜 或离心分离， 去除热凝固物及固体颗粒获得上清液。将上清液依次通过 10000 分子量、 1000 分子量超滤膜和 300 分子量的纳滤膜， 获得小于 300 分子量的膜下过滤液。将此过滤液真 空浓缩至原体积的 1/5。 0006 B 将上述浓缩液移至分液漏斗或萃取罐中， 按体积比为 1:1 加入乙酸乙酯充分混 匀萃取 10 分钟， 静置 10 分钟分离， 分离乙酸乙酯相。再在残余相中加入等体积新乙酸乙酯 按上述方法萃取， 共萃取 3 次。合并 3 次萃取液， 减压浓缩， 回收乙酸乙酯， 获得乙酸乙酯萃 取相浸膏。 0007 C 称取适量上述乙酸乙酯萃取相浸。
17、膏用少量甲醇溶解拌入 ODS 填料中， 自然挥干 或减压干燥后装入(20mm*100mm)制备液相柱的预装柱中。 利用5个柱体积的5甲醇水溶 液按 20ml/min 流量润洗 ODS 制备柱 (25mm*500mm)。连接上上述的预装柱， 按下述表 1 洗脱 梯度进行洗脱， 按每管 45ml 接取洗脱液， 278nm 处检测洗脱峰， 收集 15.35min 处的洗脱峰， 并依次标号， 真空旋转浓缩各管洗脱液。用少量纯甲醇溶解后利用高效液相色谱测定各接 收管中巨杆菌素纯度。 0008 所述梯度洗脱如下 ： 0009 表 1 中压制备液相梯度洗脱表 0010 说 明 书 CN 104030991 。
18、A 5 2/6 页 6 0011 0012 所述高效液相色谱纯化的条件如下 ： 0013 C18 柱型号为 Shim-pack VP-ODS， 内径 4.6mm， 柱长 250mm， 填充介质为 C18 ； 0014 检测波长 ： 278nm 0015 柱温箱温度 ： 30 0016 上样量为 5ul， 流动相的流速为 1ml/min。 0017 流动相由 A 液和 B 液组成 ； A 液 ： 甲醇 ； B 液 ： 纯水。用 10甲醇等度洗脱 D 合并上 述巨杆菌素纯度大于 85以上的接收管， 真空减压浓缩至原体积的 1/5， 加入少量巨杆菌 素晶种， 在 15进行结晶。待晶型长大后， 移去母。
19、液。利用少量纯甲醇洗巨杆菌素表面残 液， 再加入少量纯甲醇溶解巨杆菌素结晶， 于 15下进行重结晶， 待晶型长大后， 移去母液， 利用少量纯甲醇洗去巨杆菌素表面残液， 获得巨杆菌素纯晶体。 附图说明 0018 图 1 为海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 菌株的革兰氏染色。 0019 图 2 为海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 菌株的芽孢染色。 0020 图 3 为海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 菌株的鞭毛染色。 0021 图 4 为海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 菌株以 16SrDNA 基因序列为基础构建的系统发生 树 0022 图 5 为海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 菌株以 gyrB 基因序列为基础构建的系统发生树 具体实。
20、施方式 0023 以下结合具体实施例， 对本发明进行详细说明。 0024 实施例 1 产巨杆菌素的海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 的分离方法 : 0025 样品的采集与富集在连云港海域用无菌采样袋及无菌采样工具采集海水， 海 泥， 海带， 浒苔， 裙带菜， 龙须菜， 紫菜样品。注明样品名称、 采集日期以及采 集地点。 0026 样品进行如下处理 ： 海水样品采集来的海水混匀取 10mL 加入到装有 100mL 无 说 明 书 CN 104030991 A 6 3/6 页 7 菌海水 TSB 液体富集培养基的 500ml 三角瓶中 28、 180r/min 的条件下摇床富集培养 2d。 海泥样品采集来。
21、的海泥混匀采用五点法采样再混匀， 取 10g 海泥放入事先灭好菌的装有 100ml 海水 TSB 液体富集培养基的 500ml 三角瓶中 28、 180r/min 的条件下摇床富集培养 2d。海带样品用无菌海水冲洗海带样品 3 次后， 放入无菌组织捣碎机中破碎至糊状， 取 10g 浒苔破碎物加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28、 180r/ min 的条件下摇床富集培养 2d。浒苔， 裙带菜， 龙须菜， 紫菜样品处理同海带样品处理。 0027 海洋细菌的分离及纯化分别取1mL上述样品富集培养物的清液放入盛有9mL无 菌海水的试管中进行梯度稀释取 10-4、 。
22、10-5、 10-6 稀释度样品 0.1mL 涂布到直径 9cm 的海 水 TSB 固体分离培养基平板上， 28倒置培养 2d， 每个稀释梯度重复 3 次观察并挑取形态、 颜色不同的菌落采用三区划线方法进行纯化得到若干海洋细菌纯菌株。 0028 鳗弧菌拮抗菌分离、 筛选， 将鳗弧菌在无菌条件下， 挑取 2-3 环菌体接种到装有 100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中28、 180r/min的条件下摇床培养18小 时， 获得鳗弧菌种子液。取 0.1ml 上述鳗弧菌种子液涂布到海水 TSB 固体平板上， 在上述每 只平板上均匀点种中获得的一株海洋细菌， 在 28条件下进行共培养 3。
23、6 小时， 观察并测 量抑菌圈大小， 筛选出对鳗弧菌具有拮抗效果的海洋细菌。 经菌体形态学、 生理生化及基因 学鉴定确定获得一株海洋解淀粉芽孢杆菌 B5。 0029 筛选到的海洋细菌B5纯培养物， 转入固体斜面试管在28条件培养24小时， 放 在 4冰箱中保存。 0030 实施例 2 产巨杆菌素的海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 的鉴定和表型等方面的研究 : 0031 上述的海洋细菌 B5 的生物学形态描述为 ： 在海水 TSB 培养基上， 菌落形态 ： 圆形 突起， 边缘不整齐， 白色， 干涩无光泽， 该菌株菌体形态 ： 杆状， 两端钝圆， 革兰氏染色阳性， 芽孢中生， 椭圆形， 周生鞭毛。菌体形态。
24、 ： 杆状， 两端钝圆， 革兰氏染色阳性， 芽孢中生， 椭圆 形， 周生鞭毛， 大小为 (0.5 0.8)(1.5. 4.5)m。如图 1， 图 2， 图 3 所示。 0032 上述的海洋细菌B5的生理生化指标 ： 生理生化试验结果表明， 菌株B5的生理生化 试验结果与文献的有关海洋解淀粉芽孢杆菌特征一致， 能利用葡萄糖、 蔗糖、 半乳糖、 甘露 糖、 甘露醇， 不利用果糖、 乳糖、 鼠李糖、 阿拉伯糖、 肌醇， 氧化酶反应、 硝酸盐还原试验、 淀粉 水解试验、 明胶液化， v-p 实验和 2氯化钠生长试验为阳性， 吲哚反应、 MR 试验和脱羧酶试 验为阴性。如表 2。 0033 表 2 海洋。
25、解淀粉芽孢杆菌 B5 的生理生化指标 0034 说 明 书 CN 104030991 A 7 4/6 页 8 0035 0036 注 “-” 表示阴性，“+” 表示阳性 0037 根据形态学观察结果和生理生化特性， 查阅 伯杰氏细菌鉴定手册 第八版等相关 文献， 初步认为海洋细菌 B5 属于芽孢杆菌属。 0038 上述的海洋细菌 B5 的基因学鉴定为 ： 0039 海洋细菌 B5 的 16S rDNA 测序 0040 应 用 细 菌 16SrDNA 基 因 通 用 引 物 , 正 向 引 物 为 (ALF165312) ： 5-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3， 反向引物 ： (ALF。
26、165313) ： 5-CGGCTACCTTGTTACGAC-3， 扩增 海洋细菌 B5 的 16SrDNA 序列， 经扩增产物测序得到海洋细菌 B5 大小为 1381bp 的基因片 段， 其序列已在 GenBank 中登记， 登记号为 JN051504.1， 序列如序列表 SEQ ID NO.1。经与 GenBank数据库中报道的16S rDNA核苷酸序列比对， 序列同源性非常高的100个序列中， 菌 株 chenj-5 的 16S rDNA 核苷酸序列与 Bacillus amyloliquefaciens、 Bacillus subtilis， Bacillus vallismortis。
27、 的 16S rDNA 序列相似度在 99以上， 无法准确区分。见图 4。 0041 海洋细菌 B5 的 gyrB 基因 PCR 扩增与测序 0042 应用 gyrB 基因引物 (-gyrB primers ： ) 0043 UP-1S(5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3)， 0044 UP-2Sr(5-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3)， 扩增海洋细菌B5的16SrDNA序列， 经扩 增产物测序得到海洋细菌B5大小为1165bp的基因片段， 其序列已 在GenBank中登记， 登记 号为 JN859130.1。 0045 用 Blast 在 线 程 序 。
28、进 行 同 源 比 较 , 结 果 表 明 , 所 测 得 序 列 与 数 据 库 中 Bacillusamyloliquefaciens 来源的 DNA gyrase subunit B 基因序列的一致性很高最高 说 明 书 CN 104030991 A 8 5/6 页 9 达 99。见序列表 SEQ ID NO.2， 图 5。 0046 根据菌株的形态特征和基因学特征的分析以及系统发育分析， 鉴定海洋细菌 B5 为解淀粉芽孢杆菌 (B.amyloliquefaciens)。 0047 本 发 明 所 述 的 的 海 洋 解 淀 粉 芽 孢 杆 海 洋 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 B5(Ba。
29、cillus amyloliquefaciens strain chenj-5) 已于 2014 年 5 月 27 日保藏在中国典型培养物保藏 中心 ( 其简称 CCTCC)， 保藏号 ： CCTCCNO:M2014229 该菌株基因序列已于 2012 年 1 月 8 号登 记在 NCBI 中， 登记号 ： JN859130.1。 0048 实施例 3 海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 产巨杆菌素的发酵方法 ： 0049 菌种活化 ： 取海洋解淀粉芽孢杆菌 B5， 采用划线法接种于海水 TSB 固体斜面培养 基上， 28培养 18 小时， 得到对数生长期的斜面培养物。 0050 其中海水 TSB 固体。
30、斜面培养基的配置方法为 ： 称取胰蛋白胨 17g， 大豆蛋白胨 3g， 磷酸氢二钾 2.5g， 葡萄糖 2.5g， 5g 琼脂粉利用陈海水加热搅拌溶解后， 加陈海水定容至 1000ml， 利用 NaOH 调整 PH 7.27.5， 再在 121条件下灭菌 15min 后获得海水 TSB 固体 斜面培养基。 0051 种子液制备过程 ： 将海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 固体斜面培养物在无菌条件下， 挑取 2-3 环菌体接种到装有 100mL 无菌海水 TSB 液体培养基的 500ml 三角瓶中 28、 180r/min 的条件下摇床培养 18 小时， 获得海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 种子液。 0052。
31、 发酵培养过程 ： 在通气搅拌式发酵罐内加入巨杆菌素发酵培养基， 在 121下维 持 15min 灭菌后， 接入种子液搅拌发酵， 获得发酵产物。种子液预先利用无菌海水调整种子 液的浓度至 2.0*107cfu/ml， 种子液的接种量按 2 (v/v) 接入 ； 搅拌发酵环境参数为 ： 通 气量 1.2vvm， 温度为 28， 搅拌速度为每分钟 150 转 ； 发酵时间为 ： 36 小时。获得具有抑制 鳗弧菌活性的海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 发酵产物。 0053 其中巨杆菌素发酵培养基的配置方法为 ： 按照质量体积百分比加入葡萄糖 0.25， NaCl2， 豆饼粉 1.7， K2HPO30.25，。
32、 利用水加热搅拌溶解后， 利用碱水调整 PH 7.27.5， 再在 121条件下灭菌 20min 后获得液体发酵培养基。 0054 实施例 4 海洋解淀粉芽孢杆菌 B5 所产的巨杆菌素的分离纯化方法 0055 A海洋微生物B5发酵产物预处理 ： 海洋微生物B5发酵产物煮沸10分钟， 静置过夜 或离心分离， 去除热凝固物及固体颗粒获得上清液。将上清液依次通过 10000 分子量、 1000 分子量超滤膜和 300 分子量的纳滤膜， 获得小于 300 分子量的膜下过滤液。将此过滤液真 空浓缩至原体积的 1/5。 0056 B 将上述浓缩液移至分液漏斗或萃取罐中， 按体积比为 1:1 加入乙酸乙酯充。
33、分混 匀萃取 10 分钟， 静置 10 分钟分离， 分离乙酸乙酯相。再在残余相中加入等体积新乙酸乙酯 按上述方法萃取， 共萃取 3 次。合并 3 次萃取液， 减压浓缩， 回收乙酸乙酯， 获得乙酸乙酯萃 取相浸膏。 0057 C 称取适量上述乙酸乙酯萃取相浸膏用少量甲醇溶解拌入 ODS 填料中， 自然挥干 或减压干燥后装入(20mm*100mm)制备液相柱的预装柱中。 利用5个柱体积的5甲醇水溶 液按 20ml/min 流量润洗 ODS 制备柱 (25mm*500mm)。连接 上上述的预装柱， 按下述表 3 洗 脱梯度进行洗脱， 按每管 45ml 接取洗脱液， 278nm 处检测洗脱峰， 收集 。
34、15.35min 处的洗脱 峰， 并依次标号， 真空旋转浓缩各管洗脱液。 用少量纯甲醇溶解后利用高效液相色谱测定各 说 明 书 CN 104030991 A 9 6/6 页 10 接收管中巨杆菌素纯度。 0058 所述梯度洗脱如下 ： 0059 表 3 中压制备液相梯度洗脱表 0060 0061 所述高效液相色谱纯化的条件如下 ： 0062 C18 柱型号为 Shim-pack VP-ODS， 内径 4.6mm， 柱长 250mm， 填充介质为 C18 ； 0063 检测波长 ： 278nm 0064 柱温箱温度 ： 30 0065 上样量为 5ul， 流动相的流速为 1ml/min。 006。
35、6 流动相由 A 液和 B 液组成 ； A 液 ： 甲醇 ； B 液 ： 纯水。用 10甲醇等度洗脱 D 合并上 述巨杆菌素纯度大于 85以上的接收管， 真空减压浓缩至原体积的 1/5， 加入少量巨杆菌 素晶种， 在 15进行结晶。待晶型长大后， 移去母液。利用少量纯甲醇洗巨杆菌素表面残 液， 再加入少量纯甲醇溶解巨杆菌素结晶， 于 15下进行重结晶， 待晶型长大后， 移去母液， 利用少量纯甲醇洗去巨杆菌素表面残液， 获得巨杆菌素纯晶体。 说 明 书 CN 104030991 A 10 1/3 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 104030991 A 11 2/3 页 12 0003 序 列 表 CN 104030991 A 12 3/3 页 13 序 列 表 CN 104030991 A 13 1/3 页 14 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104030991 A 14 2/3 页 15 图 4 说 明 书 附 图 CN 104030991 A 15 3/3 页 16 图 5 说 明 书 附 图 CN 104030991 A 16 。