用于间皮瘤预后的组合物和方法.pdf

公开了用于在外科手术后间皮瘤患者预后的组合物和方法。特别地，本公开内容提供了与间皮瘤预后有关的微RNA分子(miRNA)，以及与之相关或来源于其中的各种核酸分子。本公开内容还提供了与间皮瘤预后良好或预后差相关的miRNA的改变的表达。

权利要求书
1.    一种用于确定受试者的间皮瘤的预后的方法，所述方法包括：
(a) 提供来自受试者的生物样品；
(b) 测定所述样品中选自SEQ ID NO: 1‑16、21‑77的核酸序列和与之有至少约80%同一性的序列的表达水平；和
(c) 将所述表达水平与阈值表达水平进行比较，
其中所述核酸的表达水平与所述阈值表达水平的比较表示所述受试者的预后。

2.    权利要求1的方法，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO: 1‑4、11‑12、21、22、27‑35、45‑47、52‑59、70‑72和与之有至少约80%同一性的序列，且其中与所述阈值表达水平相比，所述核酸序列中任一个表达水平的提高表示所述受试者的预后良好。

3.    权利要求1的方法，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO: 5‑10、13‑16、23‑26、36‑44、48‑51、60‑69、73‑77和与之有至少约80%同一性的序列，且其中与所述阈值表达水平相比，所述核酸序列中任一个表达水平的提高表示所述受试者的预后差。

4.    权利要求1‑3中任一项的方法，其中所述受试者是人。

5.    权利要求1中任一项的方法，其中所述方法用来确定所述受试者的治疗进程。

6.    权利要求1‑5中任一项的方法，其中所述生物样品选自体液、细胞系和组织样品。

7.    权利要求6的方法，其中所述体液是血液。

8.    权利要求6的方法，其中所述组织是新鲜、冷冻、固定、蜡包埋或福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织。

9.    权利要求8的方法，其中所述组织是间皮。

10.    权利要求1‑9中任一项的方法，其中所述表达水平通过选自核酸杂交、核酸扩增及其组合的方法测定。

11.    权利要求10的方法，其中所述核酸杂交使用固相核酸生物芯片阵列或原位杂交进行。

12.    权利要求10的方法，其中所述核酸扩增方法是实时PCR。

13.    权利要求12的方法，其中所述实时PCR方法包括正向引物和反向引物。

14.    权利要求13的方法，其中所述正向引物包含与选自SEQ ID NO: 1‑16、21‑77的序列、其片段或与之有至少约80%同一性的序列部分互补的核酸序列。

15.    权利要求13的方法，其中所述正向引物包含选自SEQ ID NO: 78‑100的序列和与之有至少约80%同一性的序列。

16.    权利要求13的方法，其中所述反向引物包含SEQ ID NO: 124和与之有至少约80%同一性的序列。

17.    权利要求13的方法，其中所述实时PCR方法还包括探针。

18.    权利要求17的方法，其中所述探针包含与SEQ ID NO: 1‑16，21‑77、其片段或与之有至少约80%同一性的序列互补的序列。

19.    权利要求17的方法，其中所述探针包含选自SEQ ID NO: 101‑123的序列和与之有至少约80%同一性的序列。

20.    一种用于确定患有间皮瘤的受试者的预后的试剂盒，所述试剂盒包含正向引物和反向引物及探针。

21.    权利要求20的试剂盒，其中所述探针包含与选自SEQ ID NO: 1‑16、21‑77的序列、其片段或与之有至少约80%同一性的序列互补的核酸序列。

22.    权利要求20的试剂盒，其中所述探针包含选自SEQ ID NO: 101‑123的序列和与之有至少约80%同一性的序列。

23.    权利要求20的试剂盒，其中所述正向引物与SEQ ID NO: 1‑16、21‑77、其片段或与之有至少约80%同一性的序列部分互补。

24.    权利要求20的试剂盒，其中所述正向引物包含选自SEQ ID NO: 78‑100的序列和与之有至少约80%同一性的序列。

25.    权利要求20的试剂盒，其中所述反向引物包含选自SEQ ID NO: 124的序列和与之有至少约80%同一性的序列。

26.    权利要求17的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于进行原位杂交分析的试剂。

说明书用于间皮瘤预后的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C. § 119(e) 条款要求2010年7月25日提交的美国临时申请号61/367,419和2010年11月30日提交的申请号61/417,905的优先权，所述申请通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本发明涉及用于在外科手术后间皮瘤患者预后的组合物和方法。特别地，本发明涉及与间皮瘤预后有关的微RNA分子，以及与之相关或来源于其中的各种核酸分子。
发明背景
最近几年中，微RNA (miRs、miRNA)作为新的重要调节RNA类别而出现，其对各种各样的生物过程具有重大影响。这些小的(通常长18‑24个核苷酸)非编码RNA分子可通过促进RNA降解，抑制mRNA翻译，并且还影响基因转录，来调节蛋白质表达模式。miRs在诸如发育和分化、细胞增殖控制、应激反应和代谢等各种过程中起关键作用。目前有大约1100种已知的人miRs。已发现许多miRs的表达在多种人类癌症类型中发生改变，在一些病例中，提出了强有力的证据支持如下推测：这类改变可能在肿瘤进程中起致病作用。
间皮瘤是发生在间皮中的肿瘤，间皮覆盖分别包覆胸腔器官(例如肺和心脏)和腹器(例如消化道和肝)的胸膜、腹膜和心包的表面。在弥漫性胸膜间皮瘤的情况下，胸痛由胸壁胸膜侧的肋间神经侵袭引起，而呼吸与循环障碍可因肿瘤生长和器官侧的胸膜中的胸膜液蓄积而产生(Takagi，Journal of Clinical and Experimental Medicine，(3月增刊)，“Respiratory Diseases”，第469‑472页，1999)。存在最终增殖进入邻近的纵隔器官，发展成直接侵袭心脏，或者借助膈膜发展到腹腔，或者由于另外的淋巴或循环转移而可能在胸腔外发展。
据报道，在美国每年有3,000人发生弥漫性胸膜间皮瘤，在1980年代病例数开始显著增加，并且在60多岁男性中频繁观察到，且男性发病率约是女性发病率的约5倍。按照最新报道，在美国和欧洲，间皮瘤的发病率呈快速升高的趋势，并且根据1995年英国流行病学统计，预测间皮瘤的死亡数在未来25年中将持续增加，在最差可能情况下，已指出在1940年代出生男性中具有达到占所有死亡1%的程度的风险。多种不同的临床疾病病期分类已被用于间皮瘤，由于所用的用于病期分类的方法不同，因此当比较治疗结果时，先前的对间皮瘤的治疗报告便遇到困难(Nakano，Respiration，第18卷，第9期，第916‑925期，1999)。另外，恶性间皮瘤与暴露于石棉具有病因关系，这在动物实验中也得到了证实(Tada，Journal of Clinical and Experimental Medicine (3月增刊)，“Respiratory Diseases”，第406‑408页，1999)。吸入呼吸道的石棉到达胸膜正下方的位置，由于通常20年的慢性刺激，肿瘤最终在此发展，而且该肿瘤在胸膜整个表面散开呈一薄层。因此，虽然恶性间皮瘤被归类为石棉相关疾病，但并非所有恶性间皮瘤都由石棉引起，并且只在全部患者的一半左右中观察到已完整记录的暴露。恶性胸膜间皮瘤(MPM)对治疗具有抗性，这与预后极差有关，需要立即采取对策(Nakano，Respiration，第18卷，第9期，第916‑925页，1999)。
恶性间皮瘤的预后受病期影响。当作为与细胞毒性化学疗法和放射疗法以及辅助免疫治疗(例如干扰素或白介素)的综合治疗(multimodality therapy)的部分进行时，手术可能是有效的治疗，但这只是在早期诊断的罕见情况下。
当研究胸膜或腹膜中间皮瘤的可能性时，应考虑少数差异指征。胸膜和腹膜两者可具有以不同速率伴随原发肿瘤(primaries)的继发性恶性肿瘤，因此间皮瘤和继发性恶性肿瘤或另一种不同来源的原发肿瘤间的区分是重要的。
大多重点都放在独特肿瘤标志物的发现和表征上。然而，没有鉴定出具有足够灵敏性或特异性而在临床上有用的标志物，虽然已表明多个标志物的组合提高预后准确性。对于与间皮瘤有关的特异性和精确的标志物的需求未得到满足，包括对可能具有预后意义以确定对生存是必需或适度的治疗程度的标志物。
发明概述
按照本发明的一些方面，SEQ ID NO: 1‑77或其任何组合的表达水平的改变表示间皮瘤预后。
按照本发明的一个方面，提供用于确定受试者的间皮瘤预后的方法，所述方法包括：
(a) 提供来自受试者的生物样品；
(b) 测定所述样品中选自SEQ ID NO: 1‑16、21‑77的核酸序列和与之有至少约80%同一性的序列的表达水平；和
(c) 将所述表达水平与阈值表达水平进行比较，
其中与所述阈值表达水平相比，SEQ ID NO: 1‑16、21‑77的任一个和与之有至少约80%同一性的序列的水平表示所述受试者的预后。
在一些实施方案中，核酸序列选自SEQ ID NO: 1‑4、11‑12、21、22、27‑35、45‑47、52‑59、70‑72和与之有至少约80%同一性的序列，且与阈值表达水平相比，所述核酸序列中任一个表达水平的提高都表示所述受试者的预后良好。在其它实施方案中，核酸序列选自SEQ ID NO: 5‑10、13‑16、23‑26、36‑44、48‑51、60‑69、73‑77和与之有至少约80%同一性的序列，且与阈值表达水平相比，所述核酸序列中任一个表达水平的提高都表示所述受试者的预后差。
在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，所述方法用来确定受试者的疗程。
在某些实施方案中，获自受试者的生物样品选自体液、细胞系或组织样品。在某些实施方案中，组织是新鲜、冷冻、固定、蜡包埋或福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织。
在某些实施方案中，组织是间皮。
按照一些实施方案，表达水平通过选自核酸杂交、核酸扩增或其组合的方法测定。按照一些实施方案，核酸杂交使用固相核酸生物芯片阵列或原位杂交进行。
按照其它实施方案，核酸扩增方法是实时PCR。按照一些实施方案，PCR方法包括正向引物和反向引物。按照一些实施方案，正向引物与SEQ ID NO: 1‑16、21‑77、其片段或与之有至少约80%同一性的序列部分互补。
按照一些实施方案，正向引物包含选自SEQ ID NO: 78‑100的序列和与之有至少约80%同一性的序列。
按照一些实施方案，反向引物包含SEQ ID NO: 124和与之有至少约80%同一性的序列。
按照一些实施方案，实时PCR方法还包括探针。按照一些实施方案，探针与SEQ ID NO: 1‑16、21‑77、其片段或与之有至少约80%同一性的序列互补。
按照一些实施方案，探针包含选自SEQ ID NO: 101‑123的序列和与之有至少约80%同一性的序列。
本发明还提供间皮瘤预后的试剂盒，所述试剂盒包含正向引物和反向引物和探针。按照一些实施方案，正向引物与SEQ ID NO: 1‑16、21‑77、其片段或与之有至少约80%同一性的序列部分互补。按照一些实施方案，正向引物包含选自SEQ ID NO: 78‑100的序列和与之有至少约80%同一性的序列。按照一些实施方案，反向引物包含SEQ ID NO: 124和与之有至少约80%同一性的序列。按照一些实施方案，探针包含与选自SEQ ID NO: 1‑16、21‑77的序列、其片段或与之有至少约80%同一性的序列互补的核酸序列。按照一些实施方案，探针包含选自SEQ ID NO: 101‑123的序列和与之有至少约80%同一性的序列。
按照一些实施方案，试剂盒包含用于进行原位杂交分析的试剂。按照一些实施方案，试剂盒包含用于进行固相核酸生物芯片阵列的试剂。
附图简述
图1A‑1D是外科手术后间皮瘤患者的Kaplan Meier图，根据预后良好与预后差的患者中差异表达的miRs的表达水平(单位：log2(表达))分组。y轴表示生存患者分数，x轴表示生存月数。
图1A表示hsa‑miR‑130b (SEQ ID NO: 9)的表达。18名患者的表达为9.56单位或更小(实曲线)，其中位生存时间为12个月，19名患者的表达为9.65或更大(虚曲线)，其中位生存时间为4个月。log‑rank的p值= 0.0009
图1B表示hsa‑miR‑29c* (SEQ ID NO: 19)的表达。18名患者的表达小于8.15单位(实曲线)，其中位生存时间为4个月，19名患者的表达超过8.15 (虚曲线)，其中位生存时间为14个月。log‑rank的p值= 0.0027
图1C表示hsa‑miR‑224 (SEQ ID NO: 25)的表达。18名患者的表达为8.71单位或更小(实曲线)，其中位生存时间为10个月，19名患者的表达为8.74或更大(虚曲线)，其中位生存时间为4个月。log‑rank的p值= 0.0015
图1D表示hsa‑miR‑34a (SEQ ID NO: 27)的表达。18名患者的表达为11.63单位或更小(实曲线)，其中位生存时间为4个月，19名患者的表达为11.65或更大(虚曲线)，其中位生存时间为13个月。log‑rank的p值= 0.0148
图2. 利用对MPM患者的miR‑29c* (SEQ ID NO: 19)表达数据100,000次随机重新分布中每一个的鉴别指数，计算的p值的分布。y轴表示频率，x轴表示鉴别指数评分C。垂直实线表示对应于miR‑29c* (SEQ ID NO: 19)的计算的鉴别指数评分C (0.726)。
发明详述
本发明部分基于这样的发现，即miRNA表达可用作用于确定间皮瘤预后的新工具。
按照本发明的一些方面，特定的核酸序列(SEQ ID NO: 1‑77和与之有至少约80%同一性的序列)可用于确定间皮瘤的预后。
在公开和描述本发明的组合物和方法之前，要理解本文所用术语只用于描述具体实施方案的目的，并无意限制。必须注意，本说明书和随附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。
对于本文叙述的数字范围，明确包括每一个介于其间的具有相同精确度的数字。例如对于6‑9的范围，除6和9以外还包括数字7和8，对于6.0‑7.0的范围，还明确包括数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
1. 定义
约
本文所用术语“约”是指+/‑10%。
表达改变
本文所用术语“表达改变”包括过量表达、表达不足和异位表达。按照一些实施方案，表达水平改变是基于核酸序列或其任何组合的表达水平的组合的评分改变。
改善
本文所用改善是指减小病况或疾病的至少一个指示物的严重程度。在某些实施方案中，改善包括延迟或减慢病况或疾病的一个或多个指示物的发展。指示物的严重程度可通过本领域技术人员已知的主观或客观度量确定。
反义
本文所用术语“反义”是指与特定DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。术语“反义链”用来指与“有义”链互补的核酸链。反义分子可通过任何方法产生，包括以反向将目的基因与允许互补链合成的病毒启动子连接的合成。一旦引入细胞，则该转录链与由细胞产生的天然序列组合形成双链体。这些双链体然后阻断进一步转录或翻译。用这种方式可产生突变型表型。
连接的
本文所用“连接的”或“固定化的”是指探针和固相支持体，并可意指探针和固相支持体之间的结合在结合、洗涤、分析和除去条件下足够稳定。结合可以是共价或非共价的。共价键可在探针和固相支持体之间直接形成，或可通过交联剂或通过在固相支持体或探针或两者上包括特定反应基团来形成。非共价结合可以是静电、亲水和疏水相互作用的一种或两种。非共价结合所包括的是分子(例如链霉抗生物素)与支持体的共价连接和生物素化探针与链霉抗生物素的非共价结合。固定还可包括共价和非共价相互作用的组合。
生物样品
本文所用“生物样品”意指包含核酸的生物组织或液体(fluid)的样品。这类样品包括但不限于自受试者中分离的组织或液体。生物样品还可包括组织(例如活检样品和尸检样品、FFPE样品)切片，采集用于组织学目的的冷冻切片、血液、血浆、血清、痰、粪便、泪液、粘液、毛发和皮肤。生物样品还包括外植块和来源于动物或患者组织的原代和/或转化细胞培养物。生物样品还可为血液、血液级分、尿液、渗出物、腹水、唾液、脑脊液、宫颈分泌物、阴道分泌物、子宫内膜分泌物、胃肠分泌物、支气管分泌物、痰、细胞系、组织样品、细针抽吸术(FNA)的细胞内容物或乳房分泌物。还可通过从动物中移出细胞样品来提供生物样品，但也可通过使用之前分离的细胞(例如由其它人、在其它时间和/或出于其它目的分离的细胞)，或通过体内进行本文所述方法来实现。还可以使用归档组织(archival tissues)，例如具有治疗或结果记载的组织。生物样品还可以保存于RNAlater®用于后期分析。
癌症
术语“癌症”意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，不论组织病理类型或侵袭阶段。癌症的实例包括但不限于实体瘤和白血病，包括：成胶质细胞瘤、胺前体摄取脱羧细胞瘤(apudoma)、迷芽瘤、鳃原瘤、恶性类癌综合征、类癌性心脏病、癌(例如Walker癌、基细胞癌、基底鳞状癌、Brown‑Pearce癌、导管癌、Ehrlich瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(例如肺鳞状细胞癌、肺腺癌和肺未分化的大细胞癌)、燕麦细胞癌、乳头状癌、细支气管癌、支气管癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)、组织细胞病症、白血病(例如B细胞白血病、混合细胞白血病、裸细胞白血病、T细胞白血病、T细胞慢性白血病、HTLV‑II相关白血病、淋巴细胞急性白血病、淋巴细胞慢性白血病、肥大细胞白血病和髓细胞性白血病)、恶性组织细胞增多病、霍奇金病、免疫增生性小(immunoproliferative small)、非霍奇金淋巴瘤、浆细胞瘤、网状内皮组织增殖、黑素瘤、成软骨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、巨细胞肿瘤、组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、间皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、滑膜瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、颅咽管瘤、无性细胞瘤、错构瘤、间充质瘤、中肾瘤、肌肉瘤、成釉细胞瘤、牙骨质瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、间皮瘤、滋养叶瘤(trophoblastic tumor)、腺癌、腺瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、粒层细胞瘤、两性胚细胞瘤、肝细胞瘤、汗腺腺瘤、胰岛细胞瘤、睾丸间质细胞瘤、乳头状瘤、睾丸支持细胞瘤、卵泡膜细胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌细胞瘤、肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、神经节瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑脊膜瘤、神经鞘瘤、成神经细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤、神经瘤、副神经节瘤、非嗜铬性副神经节瘤、血管角质瘤、血管淋巴样增生伴嗜酸细胞增多、硬化性血管瘤、血管瘤病、血管球瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤(lymphangiomyoma)、淋巴管肉瘤、松果体瘤、癌肉瘤、软骨肉瘤、叶状囊肉瘤(cystosarcoma, phyllodes)、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤(leimyosarcoma)、白血病性肉瘤、脂肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、肉瘤(例如尤因肉瘤、实验性肉瘤、卡波西肉瘤和肥大细胞肉瘤)、神经纤维瘤病和宫颈发育异常以及其中细胞变得永生化或转化的其它情况。
癌症预后
一种对癌症可能进程或结果及对其治疗的反应的预见或预测。本文所用癌症预后包括辨别癌症病期和亚型，并且预见或预测以下的任一种或多种：易患癌症或诊断为癌症的患者的生存期限、无复发生存期限、易患癌症或诊断为癌症的患者的无进展生存期限、易患癌症或诊断为癌症的患者组群中的反应速率、易患癌症或诊断为癌症的患者或患者组群中的反应期限和/或易患癌症或诊断为癌症的患者中转移的可能性。本文所用“癌症的预后”意指提供癌症的可能进程或结果的预见或预测。在一些实施方案中，“癌症的预后”包含提供以下任一种或多种的预见或预测(预后)：易患癌症或诊断为癌症的患者的生存期限、无复发生存期限、易患癌症或诊断为癌症的患者的无进展生存期限、易患癌症或诊断为癌症的患者组群中的反应速率、易患癌症或诊断为癌症的患者或患者组群中的反应期限和/或易患癌症或诊断为癌症的患者中转移的可能性。
化疗剂
一种用来治疗疾病，尤其是治疗癌症的药物。对于癌症，所述药物通常快速靶向分裂细胞，例如癌细胞。化疗剂的非限制性实例包括顺铂、卡铂、喜树碱、多柔比星、环磷酰胺、紫杉醇、依托泊苷、长春碱、放线菌素D和cloposide。
分类
本文所用“分类”是指其中根据项目(称为性状、变量、性质、特征等)中一个或多个内在特性的定量信息并根据统计模型和/或在先标记项目的训练集，将各个项目分到各组或各类的程序和/或算法。按照一个实施方案，分类意指确定癌症类型。
互补
本文所用“互补”或“互补的”意指核苷酸或核苷酸类似物间的沃森‑克里克(例如A‑T/U和C‑G)或Hoogsteen碱基配对。完全互补或完全互补的可意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物间的100%互补碱基配对。在一些实施方案中，互补序列具有相反方向(5’‑3’)。
Cox回归
本文所用“Cox回归”是用来确定生存和若干独立研究变量之间的关系的统计技术。这种生存分析可用于根据给定协变量的值，对时间与特定事件建模。在调整研究变量后，Cox回归提供治疗对生存率的估计值。在Cox回归中，估算研究变量的系数。Cox回归的基础模型产生比例风险函数(proportional hazard function)，其可通过设定层变量(strata variable)或时间相关协变量而展开。
Ct
Ct信号表示第一个PCR循环，其中扩增穿过荧光阈值(循环阈值)。因此，低的Ct值表示高的微RNA丰度或表达水平。
在一些实施方案中，使PCR Ct信号标准化，使得标准化Ct保持为表达水平的倒数。在其它实施方案中，可将PCR Ct信号标准化，然后成倒数，使得低的标准化倒数Ct表示低的微RNA丰度或表达水平。
检测
“检测”意指检测样品中组分的存在情况。检测还意指检测组分的不存在情况。检测还意指定量或定性测量组分的水平。
差异表达
“差异表达”意指细胞和组织内及细胞和组织间时序基因和/或细胞基因表达模式的定性或定量差异。因此，差异性表达的基因可在性质上改变其表达，包括例如正常组织与疾病组织中的活化或失活。可使基因在特定状态下相对于另一状态打开或关闭，因此允许比较两个或更多个状态。定性调节的基因可在某一状态或细胞类型中显示可通过标准技术检测的表达模式。一些基因可在一种状态或细胞类型中表达，但不能在两种状态或细胞类型中表达。或者，表达的差异可以是定量的，例如其中表达受到调节，或增量调节(导致转录物的量增加)，或减量调节(导致转录物的量降低)。表达的差异程度只需大到足以通过诸如表达阵列、定量逆转录酶PCR、RNA印迹分析(northern analysis)、实时PCR、原位杂交和RNA酶保护等标准表征技术进行量化即可。
鉴别指数
本文所用“鉴别指数”是用于生存分析的统计工具，可供连续独立协变量之用。对于具体的独立变量x，鉴别指数评分C是范围为0‑1的评分，测量x值和生存时间之间的一致性。C越接近1，越预示着x值越高，生存时间越长。相反，C接近0意指x值越低预示着生存时间越长，C~=0.5意指x与生存时间无关。
剂量
本文所用“剂量”意指按单次给药提供的药剂的规定量。在某些实施方案中，剂量可以两次或更多次大丸剂(boluses)、片剂或注射剂给予。例如，在某些实施方案中，在需要皮下给药的情况下，所需剂量要求不易通过单次注射而容纳的体积。在这类实施方案中，可采用两次或更多次注射以达到所需剂量。在某些实施方案中，剂量可用两次或更多次注射给予以使个体中的注射部位反应降到最低。
剂量单位
本文所用“剂量单位”意指其中提供药剂的形式。在某些实施方案中，剂量单位是装有冻干寡核苷酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位是装有重构寡核苷酸的小瓶。
表达谱
本文所用“表达谱(expression profile)”可意指基因组表达谱，例如微RNA的表达谱。谱可通过用于测定核酸序列水平的任何合适方法例如微RNA、标记的微RNA、扩增的微RNA、cRNA等的定量杂交、定量PCR、用于定量的ELISA等来产生，并且可供分析两个样品间的差异基因表达。对受试者或患者肿瘤样品(例如其细胞或收集物(例如组织))进行测定。通过本领域已知的任何合适方法收集样品。目的核酸序列是发现具有预测性的核酸序列，包括上文提供的核酸序列，其中表达谱可包括5、10、20、25、50、100个或更多个(包括所有)所列核酸序列的表达数据。术语“表达谱”还可意指在所测样品中测量核酸序列的丰度。
表达比
本文所用“表达比”是指通过检测生物样品中相应核酸的相对表达水平而确定的两种或更多种核酸的相对表达水平。
FDR
当进行多重统计检验时，例如在比较多个数据特征的两组间的信号时，由于可达到在另外情况下可视为统计显著性的水平的组间随机差，获得假阳性结果的概率越来越高。为了限制这类错误发现的比例，统计显著性定义为仅用于其中差异达到阈值以下p值(双侧t检验)的数据特征，其有赖于所进行的检验数目和这些检验中所获得的p值的分布。
片段
“片段”在本文中用来表示核酸或多肽的非全长部分。因此，片段本身也分别是核酸或多肽。
基因
本文所用“基因”可以是天然基因(例如基因组)或合成基因，其包含转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(例如内含子、5'和3'非翻译序列)。基因的编码区可以是编码氨基酸序列或功能性RNA例如tRNA、rRNA、催化性RNA、siRNA、miRNA或反义RNA的核苷酸序列。基因还可以是相当于编码区(例如外显子和miRNA)的mRNA或cDNA，任选包含与之连接的5'或3'非翻译序列。基因还可以是包含全部或部分编码区和/或与之连接的5'或3'非翻译序列的体外产生的扩增核酸分子。
沟结合物/小沟结合物(MGB)
“沟结合物”和/或“小沟结合物”可互换使用，是指通常以序列特异性方式适应双链DNA的小沟的小分子。小沟结合物可以是长的扁平分子，可呈新月形，因此紧贴地适应双螺旋的小沟中，常常置换水。小沟结合分子通常可包含几个通过具有扭转自由度的键连接的芳族环例如呋喃、苯或吡咯环。小沟结合物可以是抗生素，例如纺锤菌素、偏端霉素、berenil、喷他脒和其它芳族二脒、Hoechst 33258、SN 6999、金霉酸抗肿瘤药物例如色霉素和光神霉素、CC‑1065、二氢环吡咯并吲哚(dihydrocyclopyrroloindole)三肽(DPI3)、1,2‑二氢‑(3H)‑吡咯并[3,2‑e]吲哚‑7‑羧化物(carboxylate) (CDPI3)和相关化合物和类似物，包括Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 第2版，Blackburn和Gait主编，Oxford University Press，1996和PCT公布申请号WO 03/078450中描述的那些，所述文献的内容通过引用结合到本文中。小沟结合物可以是引物、探针、杂交标签互补序列的组分或其组合。小沟结合物可提高它们与之连接的引物或探针的Tm，允许这类引物或探针在较高温度下有效地杂交。
风险
本文所用风险(hazard)用于生存分析理论，其中风险是在时间t时发生的目标事件每时间单位的概率，前提是它在时间t前未发生。
宿主细胞
本文所用“宿主细胞”可以是可含有载体和可支持载体复制的天然存在的细胞或转化细胞。
同一性
本文在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下所用“同一性的”或“同一性”意指在特定区域内具有特定百分比的相同残基的序列。百分比可如下计算，对两个序列进行最佳比对，比较特定区域内的两个序列，确定在两个序列中出现相同残基的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以该特定区域中的位置总数，将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。在其中两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及比较的特定区域只包括单个序列的情况下，单一序列的残基包括在分母中，但不包括在分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可视为等同物。同一性可手工进行或通过应用计算机序列算法例如BLAST或BLAST 2.0进行。
原位检测
本文所用“原位检测”意指在原始位置处因此意指在组织样品(例如活组织检查)中检测表达或表达水平。
抑制
本文所用“抑制”可指预防、阻止、阻抑、减少或消除。
Kaplan‑Meier
本文所用Kaplan‑Meier方法由生存时间数据估算生存函数。生存函数的Kaplan‑Meier估算图是一系列的下降量值的水平阶梯(horizonal steps)，当取足够大的样品时，其接近该群体的真实生存函数。连续的不同取样观察间的生存函数值被假定是常数。Kaplan‑Meier曲线的优势是该方法可考虑一些类型的删失数据，特别是如果患者从研究中退出时发生的删失，即在观察到最终结果前从样品中失去。图中，小的垂直记号线表示损失，其中患者生存时间已右删失。
标记
本文所用“标记”意指通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段可检测的组合物(composition)。例如有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如常用于ELISA的酶)、生物素、洋地黄毒苷(digoxigenin)或半抗原和可使其可检测的其它实体。可将标记在任何位置处掺入核酸和蛋白质中。
逻辑斯谛回归
逻辑斯谛回归是称为广义线性模型的统计模型类别的部分。逻辑斯谛回归允许从一组可以是连续的、离散的、二分的或任何这些的混合的变量预测离散结果，例如组成员。独立变量或反应变量是二分的，例如两种可能的癌症类型之一。逻辑斯谛回归将优势比(odds ratio) (即属于第一组的概率(P)相对于属于第二组的概率(1–P)的比率)的自然对数模型化，作为不同表达水平(以log‑space表示)和其它解释变量的线性组合。逻辑斯谛回归输出可通过规定如果P大于0.5或50%，则病例或样品可归类为第一类型而用作分类器。或者，计算的概率P在其它情况下(例如1D或2D阈值分类器)可用作变量。
转移
本文所用“转移”意指癌从其最初作为原发肿瘤出现的位置扩散到身体其它部位的过程。原发肿瘤的转移进程反映多个阶段，包括从相邻的原发肿瘤细胞分离，在循环中存活，并在继发部位上生长。
错配
“错配”意指第一核酸的核碱基不能够与第二核酸相应位置的核碱基配对。
调节
本文所用“调节”意指干扰功能或活性。在某些实施方案中，调节意指基因表达增加。在某些实施方案中，调节意指基因表达降低。
核酸
本文所用“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指至少两个核苷酸共价连接在一起。单链的描述亦限定了互补链的序列。因此，核酸还包括所描述单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还包括基本相同的核酸及其互补序列。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可为单链或双链，或可含有双链和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA (基因组和cDNA两者)、RNA或杂合体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合及包括以下碱基的组合：尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。核酸可通过化学合成方法或通过重组方法获得。
核酸一般含有磷酸二酯键，但可包括可具有至少一个不同键的核酸类似物，例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O‑甲基氨基磷酸酯(methylphosphoroamidite)键和肽核酸骨架和键。其它类似的核酸包括具有正性骨架、非离子骨架和非核糖骨架的核酸，包括美国专利号5,235,033和5,034,506中描述的核酸，所述专利通过引用结合。含有一个或多个非天然存在的或修饰核苷酸的核酸也包括在核酸的一种定义中。修饰核苷酸类似物可位于例如核酸分子的5'端和/或3'端。核苷酸类似物的代表性实例可选自糖或骨架修饰的核糖核苷酸。然而，应当注意，核碱基修饰的核糖核苷酸，即含有非天然存在的核碱基而不是天然存在的核碱基的核糖核苷酸也是适宜的，所述非天然存在的核碱基例如在5位修饰的尿苷或胞苷，例如5‑(2‑氨基)丙基尿苷、5‑溴尿苷；在8位修饰的腺苷和鸟苷，例如8‑溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7‑脱氮‑腺苷；O‑和N‑烷基化核苷酸，例如N6‑甲基腺苷。2'‑OH基团可被选自以下的基团置换：H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，其中R为C1‑C6烷基、烯基或炔基，卤素为F、Cl、Br或I。修饰核苷酸还包括通过例如以下文献中描述的羟脯氨醇键(hydroxyprolinol linkage)与胆固醇缀合的核苷酸：Krutzfeldt等，Nature 438:685‑689 (2005)和Soutschek等，Nature 432:173‑178 (2004)，其通过引用结合到本文中。可出于多种原因对核糖‑磷酸骨架进行修饰，例如提高这类分子在生理环境的稳定性和半衰期、促进跨细胞膜的扩散或作为生物芯片上的探针。骨架修饰还可提高对降解的抗性，例如在细胞的严酷胞吞环境中。骨架修饰还可降低经由例如肝中的肝细胞的核酸清除。可制备天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可制备不同核酸类似物的混合物和天然存在的核酸和类似物的混合物。
总体生存时间
本文所用“总体生存时间”或“生存时间”意指受试者在疾病诊断或疾病治疗后生存的时间期限。在某些实施方案中，疾病为癌症。
部分互补
本文所用“部分互补”是指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的互补碱基配对小于100%。在一些实施方案中，碱基配对只跨越部分互补核酸分子的特定部分。
药剂
本文所用药剂意指当给予受试者时提供治疗作用的物质。“药物组合物”意指适于给予个体的物质的混合物，其包括药剂。例如药物组合物可包含修饰的寡核苷酸和无菌水溶液。“活性药物成分”意指提供所需作用的药物组合物中的物质。
预防
本文所用预防意指延迟或预先阻止病况或疾病的发作或发展或进展达一段时间，包括数周、数月或数年。
无进展生存期
“无进展生存期”意指患有疾病病况但在给定时间内生存而疾病并未恶化的受试者的分数。在某些实施方案中，通过给疾病分期或评分来评价无进展生存期。在某些实施方案中，通过评价肿瘤大小、肿瘤数和/或转移，来评价患有癌症的受试者的无进展生存期。
探针
本文所用“探针”意指能够通过一种或多种化学键类型、通常通过互补碱基配对、通常通过氢键形成而与互补序列的靶核酸结合的寡核苷酸。根据杂交条件的严格性，探针可结合与探针序列缺乏完全互补性的靶序列。可能存在任何数目的碱基对错配，所述错配将干扰本文所述靶序列和单链核酸间的杂交。然而，如果突变数如此大以致于甚至在最小严格杂交条件下都不能发生杂交，则该序列不是互补靶序列。探针可为单链的或部分单链的和部分双链的。探针的链性(strandedness)受靶序列的结构、组成和性质支配。探针可被直接标记或间接标记，例如用生物素标记，链霉抗生物素复合物可随后与之键合。
启动子
本文所用“启动子”意指能够赋予、激活或提高细胞中核酸表达的合成或天然衍生的分子。启动子可包含进一步提高所述分子表达和/或改变所述分子的空间表达和/或时间表达的一个或多个特异性转录调节序列。启动子还可包含远端增强子或抑制子元件，其可位于距转录起始位点多达几千个碱基对的位置。启动子可来源于以下来源，包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物。启动子可组成型或相对于其中发生表达的细胞、组织或器官，或相对于发生表达的发育阶段，或因响应外部刺激(例如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而差异性调节基因组分的表达。
启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵基因‑启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV‑LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子。
q值
各个假设检验的q值是该检验可称为显著的最小FDR。q值是当对于巢式显著性区域(nested significance regions)组，用给定值拒绝统计数值时出现的最小的阳性FDR。
参比表达谱
本文所用术语“参比表达谱”意指当与测定结果比较时与特定结果在统计上相关联的值。在优选的实施方案中，根据比较微RNA表达与已知临床结果的研究的统计分析来确定参比值。参比值可以是阈值评分值或截止评分值。通常参比值可为阈值，高于该值一种结果更有可能，而低于该值备选阈值更有可能。
灵敏度
本文所用“灵敏度”可意指二元分类检验正确鉴定病况的良好程度的统计学度量，例如将癌症正确归类为两种可能类型中的正确类型的频繁程度。A类的灵敏度是通过检验确定属于“A”类的病例占为“A”类的病例(如通过某一绝对标准或金标准确定的)的比例。
特异性
本文所用“特异性”可意指二元分类检验正确鉴定病况的良好程度的统计学度量，例如将癌症正确归类为两种可能类型中的正确类型的频繁程度。A类的特异性是通过检验确定属于“非A”类的病例占为“非A”类的病例(如通过某一绝对标准或金标准确定的)的比例。
副作用
本文所用副作用意指可归因于治疗的除所需作用外的生理反应。
选择标记
本文所用“选择标记”意指赋予宿主细胞表型的任何基因，选择标记在宿主细胞中表达以利于用遗传构建体转染或转化的细胞的鉴定和/或选择。选择标记的代表性实例包括氨苄西林抗性基因(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)、细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、博来霉素(zeocin)抗性基因、赋予抗生素金担子素A抗性的AURI‑C基因、草胺膦(phosphinothricin)抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因(nptII)、潮霉素抗性基因、β‑葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、绿色荧光蛋白(GFP)‑编码基因和萤光素酶基因。
严格杂交条件
本文所用“严格杂交条件”意指例如在核酸的复杂混合物中，第一核酸序列(例如探针)可与第二核酸序列(例如靶)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同环境下将不同。在确定的离子强度、pH下，可选择严格条件为低于特定序列的热熔点(Tm)约5‑10℃。Tm可为在平衡时50%与靶互补的探针与靶序列杂交的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下) (因为靶序列过量存在，在Tm处，在平衡时50%的探针被占用)。
严格条件可为这样的条件，其中盐浓度小于约1.0 M钠离子，例如在pH 7.0‑8.3下约0.01‑1.0 M钠离子浓度(或其它盐)，对于短探针(例如约10‑50个核苷酸)，温度为至少约30℃，对于长探针(例如大于约50个核苷酸)，至少约60℃。还可加入去稳定剂(例如甲酰胺)来达到严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可为背景杂交的至少2‑10倍。示例性的严格杂交条件包括下列条件：50%甲酰胺、5x SSC和1% SDS，在42℃下温育，或者，5x SSC、1% SDS，在65℃下温育，同时在0.2x SSC和0.1% SDS中于65℃洗涤。
基本互补
本文所用“基本互补”意指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸的区域内，第一序列与第二序列的互补序列有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，或两个序列在严格杂交条件下杂交。
基本同一的
本文所用“基本同一的”意指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸内，第一和第二序列有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，或对于核酸，如果第一序列与第二序列的互补序列基本互补。
受试者
本文所用术语“受试者”是指被选择进行治疗或疗法的人或非人动物。本发明的方法优选应用于人受试者。“有需要的受试者”是指被鉴定为需要疗法或治疗的受试者。在某些实施方案中，受试者需要针对间皮瘤的治疗。在这类实施方案中，受试者具有间皮瘤的一个或多个临床指征或有发生间皮瘤的风险。
靶核酸
本文所用“靶核酸”意指可被另一核酸结合的核酸或其变体。靶核酸可以是DNA序列。靶核酸可以是RNA。靶核酸可包含mRNA、tRNA、shRNA、siRNA或Piwi‑相互作用RNA、或pri‑miRNA、pre‑miRNA、miRNA或反‑miRNA (anti‑miRNA)。
靶核酸可包含靶miRNA结合部位或其变体。一个或多个探针可结合靶核酸。靶结合部位可包含5‑100或10‑60个核苷酸。靶结合部位可包含总共5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30‑40、40‑50、50‑60、61、62或63个核苷酸。靶位点序列可包含美国专利申请号11/384,049、11/418,870或11/429,720中公开的靶miRNA结合部位序列的至少5个核苷酸，所述专利内容结合到本文中。
疗法
本文所用“疗法”意指疾病治疗方法。在某些实施方案中，疗法包括但不限于酪氨酸激酶抑制疗法、化学疗法、手术切除、移植、放射疗法、“基因疗法”、免疫疗法和/或化疗栓塞(chemoembolization)。“治疗剂”意指用于治愈、改善或预防疾病的药剂。“推荐疗法”意指医学专业人员推荐用于治疗、改善或预防疾病的治疗。
治疗有效量
本文所用有关药物剂量的“治疗有效量”或“治疗有效的”是指提供特定药理反应(为此将药物给予众多需要这类治疗的受试者)的剂量。“治疗有效量”可随例如患者的身体状况、患者的年龄和疾病的严重程度而变化。
阈值表达水平
本文所用短语“阈值表达水平”是指参比表达值。将测量值与相应的阈值表达水平进行比较以确定受试者的预后。
组织样品
本文所用组织样品是采用相关医学领域普通技术人员熟知的方法获自组织活检的组织。本文所用短语“疑似癌性”意指医学领域普通技术人员认为含有癌细胞的癌组织样品。从活组织检查获得样品的方法包括团块(mass)的大致分配(gross apportioning)、显微切割、基于激光的显微切割或其它本领域已知的细胞分离方法。
治疗
本文所用“治疗”或“医治”当涉及保护受试者免受病况时，可指预防、阻止、阻抑或消除该病况。预防病况包括在病况发作前将本文所述组合物给予受试者。阻止病况包括在诱导病况后但在其临床表现前将组合物给予受试者。阻抑病况包括在病况临床表现后将组合物给予受试者，使得病况减轻或防止恶化。消除病况包括在病况临床表现后将组合物给予受试者，使得受试者不再患有该病况。
单位剂型
本文所用“单位剂型”可指适于作为人或动物受试者的单位剂量的物理分散单位。每个单位可含有预定量的本文所述组合物(经计算为足以产生所需作用的量)以及药学上可接受的稀释剂、载体或溶媒。单位剂型的规格可取决于所采用的具体组合物和要达到的作用以及宿主中与组合物有关的药效学。
变体
本文所用的涉及核酸的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列基本相同的核酸；或(iv)与参考核酸、其互补序列或与之基本相同的序列在严格条件下杂交的核酸。
载体
本文所用“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体或整合至宿主基因组的载体。
野生型
本文所用术语“野生型”序列是指编码序列、非编码序列或连接序列(interface sequence)，所述连接序列是执行该序列的天然或正常功能的序列的等位基因形式。野生型序列包括同族序列(cognate sequence)的复等位基因形式，例如野生型序列的复等位基因可编码编码序列编码的蛋白质序列的沉默变化或保守变化。
1D/2D阈值分类器
本文所用“1D/2D阈值分类器”可意指用于将病例或样品(例如癌症样品)分成两种可能类型例如两种癌症类型或两种预后类型(例如良好和差)之一的算法。对于1D阈值分类器，判定基于一个变量和一个预定的阈值；如果变量超过阈值，则将样品指定为一类，如果变量小于阈值，则指定为另一类。2D阈值分类器是根据两个变量的值归类为两种类型之一的算法。可计算评分为两个变量的函数(通常为连续函数)；然后，与1D阈值分类器相似，通过将评分与预定阈值进行比较来做出判定。
2. 微RNA及其加工
编码微RNA (miRNA)的基因可转录，导致miRNA前体(称为pri‑miRNA)的产生。pri‑miRNA可以是包含多个pri‑miRNA的多顺反子RNA的部分。pri‑miRNA可形成带有茎和环的发夹结构。茎可包含错配碱基。
Pri‑miRNA的发夹结构可被Drosha (其是一种RNase III内切核酸酶)识别。Drosha可识别pri‑miRNA中的末端环，并切割约2个螺旋转角到茎中以产生60‑70个核苷酸前体，称为pre‑miRNA。Drosha可切割pri‑miRNA，伴随RNase III内切核酸酶特有的交错切口，产生具有5'磷酸和约2个核苷酸3'突出端的pre‑miRNA茎环。延伸至Drosha切割位点以外的茎(约10个核苷酸)的约1个螺旋转角对有效加工可能是必需的。然后可通过Ran‑GTP和输出受体Ex‑portin‑5主动地将pre‑miRNA从核转运至胞质。
pre‑miRNA可被Dicer (其也是一种RNase III内切核酸酶)识别。Dicer可识别pre‑miRNA的双链茎。Dicer还可识别茎环基部的5'磷酸和3'突出端。Dicer可从茎环基部切下末端环2个螺旋转角，留下另外的5'磷酸和约2个核苷酸3'突出端。所得的可包含错配的siRNA样双链体包含成熟miRNA和相似大小的称为miRNA*的片段。miRNA和miRNA*可来源于pri‑miRNA和pre‑miRNA的相对臂。MiRNA*序列可存在于克隆miRNA文库，但通常频率比miRNA低。
虽然最初作为具有miRNA*的双链种类存在，但miRNA最终可作为单链RNA掺入到核糖核蛋白复合体，称为RNA诱导沉默复合体(RISC)。各种蛋白质都可形成RISC，这可导致以下方面的变化性：对miRNA/miRNA*双链体的特异性、靶基因的结合部位、miRNA的活性(阻抑或活化)、miRNA/miRNA*双链体的哪条链加载入RISC中。
当miRNA:miRNA*双链体的miRNA链加载入RISC时，miRNA*可被除去并降解。加载至RISC的miRNA:miRNA*双链体的链可以是其5'端较不紧密配对的链。在miRNA:miRNA*的两端具有大致相当的5'配对的情况下，miRNA和miRNA*两者可具有基因沉默活性。
RISC可根据miRNA和mRNA之间高水平的互补性，尤其通过miRNA的核苷酸2‑7来鉴定靶核酸。在动物中只报告了一例，其中miRNA及其靶之间的相互作用沿着miRNA的全长。对于mir‑196和Hox B8表明如此，并且进一步表明mir‑196介导Hox B8 mRNA的切割(Yekta等，2004，Science 304‑594)。否则，仅已知植物中的这种相互作用(Bartel和Bartel 2003，Plant Physiol 132‑709)。
已对miRNA及其mRNA靶之间的碱基配对要求进行了许多研究以实现翻译的有效抑制(Bartel 2004，Cell 116‑281的综述)。在哺乳动物细胞中，miRNA的头8个核苷酸可能是重要的(Doench和Sharp 2004 GenesDev 2004‑504)。然而，微RNA的其它部分也可参与mRNA结合。此外，在3’处的充分碱基配对可补偿在5’处的不充分配对(Brennecke等，2005 PLoS 3‑e85)。
在整个基因组上分析miRNA结合的计算研究表明了miRNA 5’处的碱基2‑7在靶结合中的特定作用，但也认识到第一个核苷酸(发现通常为“A”)的作用(Lewis等，2005 Cell 120‑15)。同样地，Krek等人(2005，Nat Genet 37‑495)使用核苷酸1‑7或2‑8来鉴定和证实靶。
mRNA中的靶位点可在5' UTR、3' UTR或在编码区中。引人关注的是，多个miRNA可通过识别相同位点或多个位点来调节相同的mRNA靶。大多数遗传上鉴定的靶中多个miRNA结合部位的存在可表明，多个RISC的协同作用提供最有效的翻译抑制。
miRNA可通过以下两种机制中的任一种指导RISC减量调节基因表达：mRNA切割或翻译阻抑。如果mRNA与miRNA具有某种程度的互补性，则miRNA可指定mRNA的切割。当miRNA引导切割时，切割可介于与miRNA的残基10和11配对的核苷酸之间。或者，如果miRNA与miRNA不具有必要程度的互补性，则miRNA可阻抑翻译。翻译阻抑在动物中可能更普遍，因为动物在miRNA和结合部位之间可具有较低程度的互补性。
应当注意，miRNA和miRNA*的任何配对的5’端和3’端中可存在变化性。该变化性可能由于有关切割部位的Drosha和Dicer的酶促加工的变化性所致。miRNA和miRNA*的5’端和3’端处的变化性还可能由于pri‑miRNA和pre‑miRNA的茎结构的错配所致。茎链的错配可导致一群不同的发夹结构。茎结构的变化性还可导致由Drosha和Dicer切割的产物的变化性。
3. 核酸
本文提供核酸。该核酸包含SEQ ID NO: 1‑124的序列或其变体。变体可以是参考核苷酸序列的互补序列。变体还可以是与参考核苷酸序列或其互补序列基本相同的核苷酸序列。变体还可以是在严格条件下与参考核苷酸序列、其互补序列或与之基本相同的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
核酸的长度可为10‑250个核苷酸。核酸的长度可为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个核苷酸。可使用本文所述合成基因在细胞(体外或体内)中合成或表达核酸。核酸可作为单链分子合成，并与基本互补核酸杂交形成双链体。可采用本领域技术人员熟知的方法，包括美国专利号6,506,559 (其通过引用予以结合)中描述的方法，将核酸以单链或双链形式导入细胞、组织或器官或者能够通过合成基因表达。
表1：与间皮瘤患者生存相关的核酸序列
miR名称miR SEQ ID NO.发夹SEQ ID NO.hsa‑miR‑37812hsa‑miR‑342‑5p34hsa‑miR‑886‑3p56hsa‑miR‑15278hsa‑miR‑130b910hsa‑miR‑140‑3p1112hsa‑miR‑151‑3p1314hsa‑miR‑320a1516hsa‑miR‑21*1718hsa‑miR‑29c*1920hsa‑miR‑4512122hsa‑miR‑212324hsa‑miR‑2242526hsa‑miR‑34a2728hsa‑miR‑29c2920hsa‑miR‑26b3052hsa‑let‑7g3153hsa‑miR‑106b3254hsa‑miR‑1013355,56hsa‑miR‑30e3457hsa‑miR‑29b3558,59hsa‑miR‑92b*3660hsa‑miR‑324‑5p3761hsa‑miR‑181b3862,63hsa‑miR‑4243964hsa‑miR‑254065hsa‑miR‑1494166hsa‑miR‑92a4267,68hsa‑miR‑193b4369hsa‑miR‑92b4460hsa‑miR‑200b4570hsa‑miR‑200a4671hsa‑miR‑148a4772hsa‑miR‑1384873,74hsa‑miR‑27a4975hsa‑miR‑23a5076hsa‑miR‑18a5177
3a. 核酸复合体
核酸还可包含以下的一种或多种：肽、蛋白质、RNA‑DNA杂合体、抗体、抗体片段、Fab片段和适体。
3b. Pri‑miRNA
核酸可包含pri‑miRNA或其变体的序列。pri‑miRNA序列可包含45‑30,000、50‑25,000、100‑20,000、1,000‑1,500或80‑100个核苷酸。Pri‑miRNA的序列可包含本文所示pre‑miRNA、miRNA和miRNA*及其变体。
pri‑miRNA可形成发夹结构。发夹可包含基本互补的第一和第二核酸序列。第一和第二核酸序列可为37‑50个核苷酸。第一和第二核酸序列可被8‑12个核苷酸的第三序列分隔开。发夹结构可具有小于‑25 Kcal/摩尔的自由能，用Vienna算法计算，其默认参数描述于Hofacker等，Monatshefte f. Chemie 125：167‑188 (1994)，其内容结合到本文中。发夹可包含4‑20、8‑12或10个核苷酸的末端环。pri‑miRNA可包含至少19%腺苷核苷酸、至少16%胞嘧啶核苷酸、至少23%胸腺嘧啶核苷酸和至少19%鸟嘌呤核苷酸。
3c. Pre‑miRNA
核酸还可包含pre‑miRNA或其变体的序列。pre‑miRNA序列可包含45‑90、60‑80或60‑70个核苷酸。Pre‑miRNA的序列可包含本文所示miRNA和miRNA*。Pre‑miRNA的序列还可以是不包括pri‑miRNA的5’和3’端的0‑160个核苷酸的pri‑miRNA的序列。Pre‑miRNA的序列可包含SEQ ID NO: 1‑77或其变体的序列。
3d. miRNA
核酸还可包含miRNA (包括miRNA*)或其变体的序列。miRNA序列可包含13‑33、18‑24或21‑23个核苷酸。miRNA还可包含总共至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。miRNA的序列可以是pre‑miRNA的起始13‑33个核苷酸。miRNA的序列还可以是pre‑miRNA的最后13‑33个核苷酸。miRNA的序列可包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29‑51或其变体的序列。
3e. 反‑miRNA
核酸还可包含例如与pri‑miRNA、pre‑miRNA、miRNA或miRNA*结合(例如反义或RNA沉默)，或通过与靶结合部位结合能够阻断miRNA或miRNA*活性的反‑miRNA(anti‑miRNA)的序列。反‑miRNA可包含总共5‑100或10‑60个核苷酸。反‑miRNA还可包含总共至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。反‑miRNA的序列可包含(a)与miRNA的5’基本同一或互补的至少5个核苷酸和与miRNA的5’端靶位点的侧翼区基本上互补的至少5‑12个核苷酸，或(b)与miRNA的3’基本同一或互补的至少5‑12个核苷酸和与miRNA的3’端靶位点的侧翼区基本互补的至少5个核苷酸。
3f. 靶的微RNA结合部位
核酸还可包含靶结合部位或其变体的序列。靶位点序列可包含总共5‑100或10‑60个核苷酸。靶位点序列还可包含总共至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或63个核苷酸。
4. 合成基因
还提供合成基因，其包含与转录和/或翻译调节序列有效连接的本文所述核酸。合成基因可能够改进具有针对本文所述核酸的结合部位的靶基因的表达。可在细胞、组织或器官中改进靶基因的表达。合成基因可通过标准重组技术进行合成或衍生自天然存在的基因。合成基因还可包含位于合成基因序列的转录单元3'端的终止子。合成基因还可包含选择标记。
5. 载体
还提供包含本文所述合成基因的载体。载体可以是表达载体。表达载体可包含额外元件。例如，表达载体可具有2个复制系统，允许其在两种生物中维持，例如在一种宿主细胞中用于表达，在第二种宿主细胞(例如细菌)中用于克隆和扩增。对于整合型表达载体，表达载体可含有与宿主细胞基因组同源的至少一个序列，优选两个位于表达构建体侧翼的同源序列。可通过选择合适的同源序列以包括在载体中，将整合型载体引导至宿主细胞的特定基因座。载体还可包含选择标记基因以供选择转化的宿主细胞。
6. 宿主细胞
还提供包含本文所述载体、合成基因或核酸的宿主细胞。细胞可以是细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞。例如宿主细胞系可以是DG44和DUXB11 (中国仓鼠卵巢系，DHFR‑)、HELA (人宫颈癌)、CVI (猴肾系)、COS (具有SV40 T抗原的CVI的衍生物)、R1610 (中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3 (小鼠成纤维细胞)、HAK (仓鼠肾系)、SP2/O (小鼠骨髓瘤)、P3x63‑Ag3.653 (小鼠骨髓瘤)、BFA‑1c1BPT (牛内皮细胞)、RAJI (人淋巴细胞)和293 (人肾)。宿主细胞系可获自商业服务、美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)或来自已发表的文献。
7. 探针
本文提供探针。探针可包含核酸。探针的长度可为8‑500、10‑100或20‑60个核苷酸。探针的长度还可为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280或300个核苷酸。探针可包含18‑25个核苷酸的核酸。
探针可能够通过一个或多个化学键类型、通常通过互补碱基配对、通常通过氢键形成，而与互补序列的靶核酸结合。根据杂交条件的严格性，探针可结合与探针序列缺乏完全互补性的靶序列。探针可以是单链的或部分单链的和部分双链的。探针的链性受靶序列的结构、组成和性质的支配。探针可直接标记或间接标记。
探针可以是试验探针。试验探针可包含与miRNA、miRNA*、pre‑miRNA或pri‑miRNA互补的核酸序列。
探针还可包含接头。接头的长度可为10‑60个核苷酸。接头的长度可为20‑27个核苷酸。接头可具有足够的长度，以允许探针为45‑60个核苷酸的总长度。接头可能不能够形成稳定的二级结构，或者可能不能够自身折叠，或者可能不能够在探针所含核酸的非接头部分上折叠。接头的序列可能不出现在探针非接头核酸从中衍生的动物基因组中。
8. 反转录
可通过靶RNA的反转录来产生cDNA的靶序列。产生cDNA的方法可反转录多腺苷酸化RNA或备选具有连接的衔接序列的RNA。
RNA可在反转录前与衔接序列连接。连接反应可通过T4 RNA连接酶进行以在RNA的3’端与衔接序列连接。反转录(RT)反应然后可使用包含与衔接序列的3’端互补的序列的引物进行。
可使用包含5’衔接序列的聚(T)引物，将多腺苷酸化RNA用于反转录(RT)反应。聚(T)序列可包含8、9、10、11、12、13或14个连续的胸腺嘧啶。
可使用包含至少15个与靶核酸互补的核酸和5’尾序列的特异性正向引物、与衔接序列的3’端互补的反向引物和包含至少8个与靶核酸互补的核酸的探针，通过实时PCR使RNA的反转录物扩增。探针可与衔接序列的5’端部分互补。
本文描述了扩增靶核酸的方法。扩增可以是通过包括PCR在内的方法。PCR反应的第一循环的退火温度可为56℃、57℃、58℃、59℃或60℃。第一循环可包含1‑10个循环。PCR反应的其余循环可为60℃。其余循环可包含2‑40个循环。退火温度可使PCR更灵敏。PCR可产生可用作较高严格性PCR模板的较长产物。
PCR反应可包含正向引物。正向引物可包含15、16、17、18、19、20或21个与靶核酸相同的核苷酸。
正向引物的3’端可能对靶核酸和亲缘核酸(sibling nucleic acid)之间序列的差异更敏感。
正向引物还可包含5’突出尾。5’尾可提高正向引物的解链温度。5’尾的序列可包含与靶核酸从中分离的动物的基因组不同的序列。5’尾的序列还可以是合成的。5’尾可包含8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸。
PCR反应可包含反向引物。反向引物可与靶核酸互补。反向引物还可包含与衔接序列互补的序列。与衔接序列互补的序列可包含12‑24个核苷酸。
9. 生物芯片
还提供生物芯片。生物芯片可包含固体基质，其包含本文所述的连接探针或众多探针。探针可能够在严格杂交条件下与靶序列杂交。探针可在基质上空间确定的位置上连接。每个靶序列可使用多于一种探针，或为重叠探针或为针对特定靶序列的不同部分的探针。探针可能够与本领域技术人员了解的单一病症相关的靶序列杂交。探针或可先合成，随后与生物芯片连接，或可在生物芯片上直接合成。
固体基质可以是经改性以含有适于探针连接或缔合的离散的各个位置并适于至少一种检测方法的材料。基质材料的代表性实例包括玻璃和经改性的或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸酯、聚苯乙烯以及苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonJ等)、多糖、尼龙或硝化纤维、树脂、二氧化硅或二氧化硅型材料包括硅(silicon)和改性硅、碳、金属、无机玻璃和塑料。在没有明显荧光的情况下，基质便可供进行光学检测。
基质可以是平面的，但是也可使用其它构型的基质。例如，可将探针置于管的内表面用于穿流样品分析(flow‑through sample analysis)以使样品体积减至最小。同样地，基质可以是柔性的，例如软泡沫塑料，包括由特定塑料制成的闭孔泡沫塑料(closed cell foam)。
生物芯片的基质和探针可用化学官能团衍生化用于两者随后的连接。例如，生物芯片可用化学官能团衍生化，化学官能团包括但不限于氨基、羧基、桥氧基或硫醇基。利用这些官能团，探针可用探针上的官能团直接连接或使用接头间接连接。
探针可通过5'端、3'端或通过内部核苷酸与固相支持体连接。
探针还可与固相支持体非共价连接。例如，可制备生物素化寡核苷酸，其可与链霉抗生物素包被的表面共价结合，导致连接。或者，可采用诸如光聚合和光刻术等技术，在表面上合成探针。
10. 诊断学
还提供诊断方法。所述方法包括检测生物样品中的间皮瘤相关核酸的差异表达水平。样品可来源于患者。患者的癌症状态及其组织学类型的诊断可供预后和治疗策略的选择。此外，可通过测定临时表达的癌症相关核酸，对细胞的发育阶段分类。
可以进行标记探针与组织阵列的原位杂交。当比较个体和标准品之间的指纹时，技术人员可根据研究结果做出诊断、预后或预测。还要了解，指示诊断的核酸序列可不同于指示预后的核酸序列，而且细胞或外来体状况的分子概况分析(molecular profiling)可导致反应性情况或不应性情况间的差异，或者可预测结果。
11. 试剂盒
还提供试剂盒，试剂盒可包括本文所述核酸连同以下的任一种或全部：测定试剂、缓冲液、探针和/或引物和无菌盐水或其它药学上可接受的乳剂和混悬剂基质(suspension base)。另外，试剂盒可包括含有用法说明(例如方案)的指导材料，用于实施本文所述方法。
例如，试剂盒可用于靶核酸序列的扩增、检测、鉴定或定量测定。试剂盒可包含聚(T)引物、正向引物、反向引物和探针。
本文所述组合物的任一种都可包括在试剂盒中。在非限制性实例中，试剂盒中包括用于分离miRNA、标记miRNA和/或使用阵列评价miRNA群的试剂。试剂盒还可包括用于产生或合成miRNA探针的试剂。因此，试剂盒可在合适的容器装置中包括用于通过掺入标记的核苷酸或随后标记但尚未标记的核苷酸以标记miRNA的酶。还可包括一种或多种缓冲液，例如反应缓冲液、标记缓冲液、洗涤缓冲液或杂交缓冲液、用于制备miRNA探针的化合物、用于原位杂交的组分和用于分离miRNA的组分。本发明的其它试剂盒可包括用于制备包含miRNA的核酸阵列的组分，因此，可包括例如固相支持体。
提供下面的实施例，以便更全面地说明本发明的一些实施方案。然而，其绝不应解释为对本发明宽范围的限制。
实施例
实施例1：材料与方法
生物样品
在Karmanos Cancer Institute (KCI)，Detroit Michigan (1997‑2005)的IRB批准的组织采购方案(IRB approved tissue procurement protocol)的支持下，获得37个间皮瘤肿瘤样本。在细胞减灭术(cytoreductive surgery)或用于诊断的活组织检查期间，从手术室新获得样本，立即在液氮中速冻，并保存在‑80℃下。所有样本都具有间皮瘤的免疫组织化学证据，其WT1、细胞角蛋白、钙网膜蛋白阳性染色，缺乏CEA和B72.3染色。记录人口统计学资料，包括年龄、性别、病期、间皮瘤组织学、从手术到进展的时间、从手术到死亡的时间，并且最新截止到2008年9月。下表2中详细描述了从中获得样本的患者的人口统计学资料。
表2：患者人口统计学资料

微阵列平台(Microarray platform)
使用mirVANA微RNA分离试剂盒(Ambion)，从样本提取总RNA。将代表微RNA的约900 DNA寡核苷酸探针一式三份点样在包被的微阵列载玻片(Nexterion® Slide E，Schott，Mainz，Germany)上。
通过RNA‑接头p‑rCrU‑Cy/染料(Dharmacon，Lafayette，CO；Cy3或Cy5)与3’端连接，对3‑5 µg的总RNA进行标记。将载玻片与标记的RNA一起在42℃下温育12‑16小时，然后洗涤2次。以10 µm的分辨率对阵列进行扫描，应用SpotReader软件(Niles Scientific，Portola Valley，CA)对图像进行分析。合并微阵列点(Microarray spots)，使信号标准化。
实施例2：结果和分析
37名患者的平均随访期为1.48年。27名死于MPM的患者中，平均生存期为1.09年，而10名存活或删失的患者中，平均随访期为2.54年。11名患者保持无MPM复发达1年，而24名在1年内遭受复发，其中一年内出于其它原因死亡2例。通过其回顾性预后将患者分组，其中对于其进展通过疾病进展的放射照相或组织学证据记录的患者，“预后差”定义为12个月内复发，而“预后良好”定义为复发时间大于或等于12个月。
将微RNA表达水平进行log转化(底2)，然后通过拟合至二次多项式来标准化，然后转化回到线性标度。在两个预后组的至少一个中仅测试了中值信号高于信号背景水平(约300的标准化荧光信号)的微RNA。
采用ranksum比较两个预后组之间每种微RNA的表达水平。表3中呈现了预后组间ranksum p值低于0.05和倍数变化高于1.5的微RNA，分成预后良好组中高表达(增量调节)的微RNA与预后差组中高表达(增量调节)的微RNA。应用Storey计算Q值。
表3：预后良好和预后差(无删失) MPM患者之间的微RNA差异表达。倍数变化是预后良好组和预后差组内微RNA的中值表达(用荧光单位表示)间的比率。

还通过Kaplan‑Meier方法对结果进行了分析，对高于中值miR‑表达的患者和低于中值的miR‑表达的患者进行了比较。如图1所示，在预后良好和预后差的患者之间，hsa‑miR‑130b (SEQ ID NO: 9)、hsa‑miR‑29c* (SEQ ID NO: 19)、hsa‑miR‑224 (SEQ ID NO: 25)和hsa‑miR‑34a (SEQ ID NO: 27)具有显著差异，使得hsa‑miR‑29c* (SEQ ID NO: 19)和hsa‑miR‑34a (SEQ ID NO: 27)每一种的高表达都与预后良好有关，而hsa‑miR‑130b (SEQ ID NO: 9)和hsa‑miR‑224 (SEQ ID NO: 25)每一种的高表达都与预后差有关。
通过计算对应于各表达的微RNA的鉴别指数，和比较其与其它微RNA的评分，进一步检查微RNA表达和预后的关联。根据鉴别指数方法，发现在表达和生存之间hsa‑miR‑29c* (SEQ ID NO: 19)具有最显著的关联。图2中呈现了通过这种微RNA的100,000个随机重新分配所产生的分布直方图。分布几乎是正态的，其平均值为0.501，标准偏差为0.062。利用该分布作为参比，通过其鉴别指数‑评分C在该包络内的相对秩评定，来获得其它表达的微RNA的p值。5种最显著的微RNA示于表4。
表4：利用鉴别指数评分C作为生存鉴别器(discriminator for survival)的微RNA表达。P值基于100,000个排列中的秩评定。q值通过Storey方法计算。
微RNASEQ ID NO:Cp值q值hsa‑miR‑29c*190.7265.00E‑060.0024hsa‑miR‑130b90.3170.0020.0024hsa‑miR‑320a150.3430.0070.1163hsa‑miR‑140‑3p110.6390.0110.3772hsa‑miR‑151‑3p130.3640.0140.3772
从表4中显而易见，hsa‑miR‑29c* (SEQ ID NO: 19)和hsa‑140‑3p (SEQ ID NO: 11)任一个的相对高表达，且C‑评分高于0.5，预示较长的生存期。hsa‑miR‑130b (SEQ ID NO: 9)、hsa‑miR‑320a (SEQ ID NO: 15)和hsa‑151‑3p (SEQ ID NO: 13)任一个的相对高表达，且C‑评分低于0.5，预示较短的生存期。
最后，采用单变量Cox回归确定各个表达的微RNA作为预测物(prognosticator)的重要性。Cox单变量分析表明，对于miR‑29c* (SEQ ID NO: 19)风险降低，exp(β)为0.33，其为显著(p=7∙10‑4)，对于miR‑130b (SEQ ID NO: 9)风险增加( exp(β)2.56；p=1∙10‑4)。
实施例3：qRT‑PCR结果
选择表5所示微RNA用于定量实时PCR (qRT‑PCR)分析。如下采用qRT‑PCR方法，定量微RNA的量：在聚(A)聚合酶(PAP；Takara‑2180A)、MnCl2和ATP存在下，于37℃温育RNA 1小时。然后，使用带有共有序列的oligodT引物，使用SuperScript II RT (Invitrogen，Carlsbad，CA)对总RNA进行反转录。接下来，通过RT‑PCR扩增cDNA；该反应包含微RNA‑特异性正向引物、与特定微RNA序列3’互补的TaqMan探针以及polyA衔接序列的部分、及与oligodT尾的共有3’序列互补的通用反向引物。
测定各微RNA的循环阈值(Ct，探针信号达到阈值的PCR循环)。
表5：用于RT‑PCR的序列


通过微RNA的表达水平，使用比较(81个鲜冻和FFPE样品的)第一和第三三分位数(tertile)的Kaplan‑Meier的logrank p值，鉴定表6所示微RNA。
表6：

通过比较8名长期生存者(到死亡时超过18个月)和11名快速发展者(到死亡时小于12个月)的表达水平的2侧t检验，发现表7所示微RNA显著差异性地表达(p值< 0.05)。所有受试样品为2期患者的鲜冻样品。
表7：

上文具体实施方案的描述将如此充分的揭示本发明的总体性质，使得在无过多实验且不偏离一般构思的情况下，其他人可通过应用现有知识，容易地改变和/或修改这类具体实施方案用于各种应用，因此，这类改变和修改应在并且意欲在所公开实施方案的等价物的含义和范围内理解。虽然结合其具体实施方案对本发明进行了描述，但是显然许多备选方案、改变和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，欲包括落入所附权利要求书的精神和宽泛范围的所有这些备选方案、改变和变化。
应理解的是，详细说明和具体实施例(虽然表示本发明的优选实施方案)仅通过举例说明给出，因为从该详细说明来看，本发明精神和范围内的各种变化和改变对本领域的技术人员而言将变得显而易见。