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1、10申请公布号CN104195104A43申请公布日20141210CN104195104A21申请号201410319051022申请日20140704C12N5/07620100171申请人扬州大学地址225009江苏省扬州市文汇东路48号72发明人常国斌陈国宏徐琪马腾吴信生翟飞赵文明74专利代理机构南京苏高专利商标事务所普通合伙32204代理人柏尚春54发明名称一种鸡精液纯化的新方法57摘要一种鸡精液纯化的新方法，通过加入改进的精子培养液1份鸡血清加4份EARLE氏液，经19PERCOLL工作液分离，然后800RPM离心，恒温培养箱培养后可显著提高精子质量，通过利用精子密度与精液其他成分。
2、密度的差异及精子的直线运动的能力，达到纯化精液的目的。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图1页10申请公布号CN104195104ACN104195104A1/1页21一种鸡精液纯化的新方法，其特征在于使用19PERCOLL工作液能有效分离精液中精子，具体步骤如下1采用“按摩法”采集正常产精狼山鸡的精液200500UL，待液化后，即采集后半小时，加入3倍体积的精子培养液，混匀，800RPM离心，弃上清，所述精子培养液为1份鸡血清加4份EARLE氏液；2将经所述精子培养液重悬沉淀后的精液，沿管壁缓慢加到2ML浓。
3、度为19PERCOLL工作液层上，所述19PERCOLL工作液置于5ML的指形管中，800RPM离心20MIN，弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散；3沿管壁再向上述指形管中缓慢加入05ML精子培养液，放入37CO2恒温培养箱中培养40MIN，精子在此期间会上游，吸取上游后的精子培养液，即可获得纯净的精液；纯化前后鸡精子质量比较，具体表现为精子活率、精子密度亿/ML、精子畸形率、受精率以及入孵蛋孵化率在纯化前分别为7973588、195022、3764532、2714789、745327；纯化后分别为9430116、233025、740026、67451046、49851125，表示相同参数之间。
4、差异显著P005；表示差异极显著P001。2一种根据权利要求1所述的一种鸡精液纯化的新方法，其特征在于所述19PERCOLL工作液配制成分和比例如下以重量份计算，19倍体积100PERCOLL储备液、81倍体积1XNACL溶液，所述100PERCOLL储备液液配制成分和比例如下以重量份计算，9倍体积PERCOLL原液购自SIGMA公司、1倍体积10XNACL。3一种根据权利要求1所述的一种家禽精液纯化的新方法，其特征在于所述EARLE氏液配制成分和比例如下以重量份计算，原液甲2份、原液乙1份、双馏水17份，所述原液甲配制成分和比例为，NACL68G、NAHCO322G、KCL4G、葡萄糖10G。
5、、NAH2PO42H2O14G、双蒸馏水1000ML；所述原液乙为，CACL2255G、MGCL26H2O17G、01GL谷氨酰胺、双蒸馏水500ML。权利要求书CN104195104A1/3页3一种鸡精液纯化的新方法技术领域0001本发明涉及动物细胞培养领域具体涉及细胞培养、分离技术。技术背景0002鸡精液由精子和精清组成。精清是曲精细管、附睾和输精管的分泌物，此外还含有透明液。透明液中有提高精子活力、呼吸和葡萄糖消耗因子，促使精子早衰。目前，现代化家禽生产中普遍采用人工授精技术，其极易造成交叉感染、精子高死亡率和降低精液利用率。另外，养鸡业出现繁殖力持续下降，每年商业品种和我国地方品种中淘。
6、汰10左右的弱精子症鸡，这给生产和地方遗传资源保护带来了巨大的损失，如何利用一些弱精子症公鸡，改进其精子质量，最终提高鸡生产和保种效率是本发明的基本目标。本发明以狼山鸡为研究对象，通过利用精子密度与精液其他成分密度的差异及精子的直线运动的能力，达到纯化精液的目的。发明内容0003为克服人工受精造成的交叉感染、精子质量低下高精子死亡率和低利用率等等，提高鸡生产和保种效率，本发明提供了一种新型鸡精液纯化方法，使用19PERCOLL工作液能有效分离精液中精子，具体步骤如下00041采用“按摩法”采集正常产精狼山鸡的精液200500UL，待液化后，即采集后半小时，加入3倍体积的精子培养液，混匀，800。
7、RPM离心，弃上清，所述精子培养液为1份鸡血清加4份EARLE氏液；00052将经所述精子培养液重悬沉淀后的精液，沿管壁缓慢加到2ML浓度为19PERCOLL工作液层上，所述19PERCOLL工作液置于5ML的指形管中，800RPM离心20MIN，弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散；00063沿管壁再向上述指形管中缓慢加入05ML精子培养液，放入37CO2恒温培养箱中培养40MIN，精子在此期间会上游，吸取上游后的精子培养液，即可获得纯净的精液。0007相关试剂配方00081、19PERCOLL工作液0009100PERCOLL储备液9倍体积PERCOLL原液购自SIGMA公司、1倍体积10X。
8、NACL；001019PERCOLL工作液19倍体积100PERCOLL储备液、81倍体积1XNACL溶液；00112、EARLE氏液0012原液甲NACL68G、NAHCO322G、KCL4G、葡萄糖10G、NAH2PO42H2O14G、双蒸馏水1000ML0013原液乙CACL2255G、MGCL26H2O17G、01GL谷氨酰胺、双蒸馏水500ML0014EARLE氏液原液甲2份、原液乙1份、双馏水17份。0015本发明通过利用精子密度与精液其他成分密度的差异及精子的直线运动的能力，说明书CN104195104A2/3页4达到纯化精液的目的。附图说明0016图1纯化前精液涂片；0017图。
9、2纯化后精液涂片。具体实施方式0018下面结合附图对本发明作进一步详细描述0019实施例0020本发明的技术方案是一种新型鸡精液纯化方法，使用19PERCOLL工作液能有效分离精液中精子，具体步骤如下00211采用“按摩法”采集正常产精狼山鸡的精液200500UL，待液化后，即采集后半小时，加入3倍体积的精子培养液，混匀，800RPM离心，弃上清，所述精子培养液为1份鸡血清加4份EARLE氏液；00222将经所述精子培养液重悬沉淀后的精液，沿管壁缓慢加到2ML浓度为19PERCOLL工作液层上，所述19PERCOLL工作液置于5ML的指形管中，800RPM离心20MIN，弃上清，用手指轻弹管底。
10、，使沉淀松散；00233沿管壁再向上述指形管中缓慢加入05ML精子培养液，放入37CO2恒温培养箱中培养40MIN，精子在此期间会上游，吸取上游后的精子培养液，即可获得纯净的精液。0024相关试剂配方00251、19PERCOLL工作液0026100PERCOLL储备液9倍体积PERCOLL原液购自SIGMA公司、1倍体积10XNACL。002719PERCOLL工作液19倍体积100PERCOLL储备液、81倍体积1XNACL溶液。00282、EARLE氏液0029原液甲NACL68G、NAHCO322G、KCL4G、葡萄糖10G、NAH2PO42H2O14G、双蒸馏水1000ML。0030。
11、原液乙CACL2255G、MGCL26H2O17G、01GL谷氨酰胺、双蒸馏水500ML0031EARLE氏液原液甲2份、原液乙1份、双馏水17份。0032纯化后的精液，精子形态清晰，无杂质，精子活力显著提高。具体见表1和附图。0033表1纯化前后鸡精子质量比较0034说明书CN104195104A3/3页50035注表示同列之间差异显著P005；表示差异极显著P0010036相关指标的测定方法00371、精子密度指单位体积内的精液中的精子数。用移液枪吸10L精液与490L的09NACL提前预热至37,此温度下精子活力最高吹打均匀。采用血球计数器法计数，在显微镜下观察400倍，数出血球计数板正。
12、中间和四个角的五个中方格中的精子数。压在计数室边线上的精子计数时计头不计尾、计上不计下、计左不计右。用计数器记录技术室内5个中方格的精子总数。每个样本重复计数3次，每次计数重复3次。精子密度计算1ML内精子数5个中方格中精子总数/5400100050稀释倍数。00382、精子活率指活精子数占单位总精子数的比值。用移液枪吸10L精液与490L的09NACL提前预热至37吹打均匀。用移液枪吸取10L的精液稀释液和10L的台盼蓝染色液于PCR管中，轻轻吹打混匀，静止3分钟后，用血球计数板计数，重复3次。活的精子细胞细胞膜结构完整，不被着色，而死细胞能够被染成蓝色。计算方法精子活率未着色精子数/精子总。
13、数100。00393、精子畸形率指畸形精子占精子总数的比值。畸形精子指头部、体部和尾部的非正常形态的精子头部畸形包括头部过大或过小、顶体异常或空泡；体畸形有体部粗大、折裂、不完整等；尾部畸形包括过短、不规则、断裂或卷曲及多尾等。吸取2L精液加入到09生理盐水预热至37中，充分混匀用枪头吹吸，速度不宜太快，避免精子损伤。用蜡笔将载玻片两侧密封，然后用移液枪吸取20L混合液滴在载玻片上，并用盖玻片推片。用胶头滴管滴34滴无水乙醇，固定精子23MIN。参照快速瑞氏吉姆萨复合染色试剂盒说明书，进行染色，观察并计数，计数重复3次。计算方法精子畸形率畸形精子数/精子总数100。说明书CN104195104A1/1页6图1图2说明书附图CN104195104A。