利用酵母菌转化制备木糖醇的方法 本发明涉及木糖醇的制备方法
木糖醇是一种甜度与蔗糖相当的天然甜味剂。由于它在人体代谢中不依赖胰岛素并有抗龋齿作用，因此是糖尿病与牙病患者理想的蔗糖替代物。它存在于一些水果和蔬菜中，由于含量太低，提取很不经济。目前主要用木糖催化加氢的方法制备(Wisnik，J.etal：Ind.Eng.Chem.Prod.Res.Dev.，3：232-236，1974)。但这种方法需要用纯木糖为原料，因此工艺复杂，成本很高，限制了木糖醇的大量应用。
为了用廉价的原料如木质素、半纤维素水解物来生产木糖醇，已有不少研究涉及利用微生物发酵的制备方法(Roberto，L.C.etal：BioresourseTechnol.36：271-275，1991)由于这些水解物中含有抑制微生物生长的物质，因此发酵这些水解物制备木糖醇的产率不高，即使进行了预处理也提高不大(Dominguez，J.M.etal：Appl.Biochem.Biotechnol.57/58：49-56，1996)。
木质素和半纤维素水解物的主要成份是木糖，从木糖到木糖醇的生化反应是：
许多微生物细胞有木糖还原酶，因此可以通过发酵得到木糖醇。为了避免水解物中一些成份对细胞生长的抑制，也可以用细胞转化的方法制备木糖醇，但还必须考虑辅酶的问题，一般需要两种微生物细胞，并且反应条件也十分复杂，难以实际应用(Nshio，M.etal：J.Ferment.Bioengin.67：356-360，1989)。
本发明是选育了一株具有独立转化木糖为木糖醇能力的酵母菌(异常汉逊酵母Hansenula anomala)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册的编号为CGMCC0274。微生物菌种保藏管理，细胞培养后，用游离细胞或固定化细胞都可以转化木糖或木质素、半纤维素水解物为木糖醇。将保存在斜面培养基(2％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，2％琼脂，自然pH)上的酵母菌接于液体培养基(木糖0.1-5.0％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，pH4.8)中，在24-37℃振荡培养，培养时间可控制在8-96小时之间，以24-48小时为最佳，然后冷冻离心收集、洗涤细胞。直接使用或将细胞固定化，与木糖溶液反应。反应温度范围可以为18-58℃，以25-40℃最佳；反应时间可以控制在12-200小时之间，最佳反应时间为24-120小时。反应液中木糖转化为木糖醇，转化率60-70％。由于细胞已经培养好，因此在以木质素、半纤维素水解物为底物时，不存在抑制生长的问题，产率较高。并且转化反应的系统比发酵培养基简单得多，因此产物的分离纯化也相对简单。固定化细胞还能反复使用多次，可进一步节省培养细胞的费用并简化了工艺。这是一种可以利用廉价原料生产木糖醇的有实际意义的制备方法。
实施例1：游离细胞转化木糖为木糖醇(1).将所用酵母菌接一环于液体摇瓶培养基中(D-木糖1％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，pH4.8，20ml培养基/250ml摇瓶)在温度为30℃、220rpm培养36小时后离心收集菌体(BECKMAN GS-15R，F0630，8000rpm，10℃，10min)用生理盐水10ml洗涤菌体2次，离心取菌体。(2).用200ml蒸馏水悬浮菌体，将菌悬液转入250ml三角瓶，称取2gD-木糖置于上述三角瓶中，用纱布封住瓶口，于旋转摇床上进行转化(转化温度在18℃-58℃，但30℃转化效果最好，220rpm)，96小时后取样用TCL检测样品，并以D-木糖和木糖醇为标样，结果D-木糖完全转化为木糖醇。测定反应液中木糖醇的含量并计算反应转化率为70％。实施例2：游离细胞转化木屑水解物
(1).将所用酵母菌接一环于液体摇瓶培养基中(D-木糖1％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，pH4.8，20ml培养基/250ml摇瓶)在温度为30℃、220rpm培养36小时后离心收集菌体(BECKMAN GS-15R，F0630，8000rpm，10℃，10min)用生理盐水10ml洗涤菌体2次，离心取菌体。
(2).称取50g木屑，加2％硫酸溶液至500ml体积，80℃水浴保温12小时进行水解。用CaOH中和水解物至pH＝6.0，待CaSO4充分析出后抽滤除去沉淀，得木屑水解液，其中D-木糖含量约为0.7％。
(3).取上述水解液30ml悬浮本例(1)所述的菌体转入250ml三角瓶中，纱布封口，于摇床上进行转化(30℃，220rpm)，48小时后取样，用TCL分析，已转化完全，只有木糖醇地斑点，测定反应液中木糖醇含量并计算反应转化率为60％。实施例3：固定化细胞转化D-木糖为木糖醇
(1).将所用酵母菌接一环于液体摇瓶培养基中(D-木糖1％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，pH4.8，20ml培养基/250ml摇瓶，共计四瓶)在温度为30℃、220rpm培养36小时后离心收集菌体(BECKMAN GS-15R，F0630，8000rpm，10℃，10min)用生理盐水10ml洗涤菌体2次，离心取菌体。
(2).称6g海藻酸钠，加94ml蒸馏水加热使其溶解，待用。
(3).用7.0ml蒸馏水悬浮菌体，加7.0ml溶液(2)(冷至40℃)，充分混匀。将此液体吸入注射器中呈滴状滴入2％CaCl2液体中固化。滴完后将装有CaCl2的烧杯置于冰箱中继续固化10小时。用砂芯漏斗将固定化细胞颗粒滤出，用蒸馏水洗涤3次，得固定化细胞。
(4).于250ml三角瓶中称取2gD-木糖，加20ml蒸馏水，将本例(3)所述的固定化细胞转入三角瓶中，纱布封口，于摇床上转化(30℃220rpm)，120小时后用TCL检测已转化完全。测定反应液中木糖醇含量并计算反应转化率68％。实施例4：固定化细胞转化木屑水解物
(1).如实施例3(1)，(2)，(3)得固定化细胞。
(2).如实施例2(2)得木屑水解液。
(3).于250ml三角瓶中加30ml水解液，与固定化细胞混合后，用纱布封口，在摇床转化(30℃，220rpm)，48小时后用TCL检测，已转化完全。测定反应液中木糖醇含量并计算反应转化率为59％。