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1、10申请公布号CN104293936A43申请公布日20150121CN104293936A21申请号201410509621222申请日20140918C12Q1/6820060171申请人黑龙江八一农垦大学地址163319黑龙江省大庆市八一农垦大学动物科技学院72发明人倪宏波王欣王云光安先全蒋慧婷54发明名称一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途57摘要本发明公开了一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，特异性LAMP引物根据MSP5基因设计3对引物外，内，环引物，正向外引物命名为MSP5F3B，反向外引物命名为MSP5B3B，正向内引物命名。
2、为MSP5FIPB，反向内引物命名为MSP5BIPB，为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物MSP5LFB和反向环引物MSP5LBB，三对的外引物用于PCR检测。在63条件下进行LAMP反应20分钟后，LAMP产物在08琼脂糖凝胶电泳显示呈阶梯状图案。该方法具有高特异性，高灵敏度，时间短且操作简便的特点。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表3页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表3页附图2页10申请公布号CN104293936ACN104293936A1/1页21一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，其特。
3、征在于，特异性LAMP引物根据MSP5基因设计3对引物外，内，环引物，正向外引物命名为MSP5F3B，反向外引物命名为MSP5B3B，正向内引物命名为MSP5FIPB，反向内引物命名为MSP5BIPB，为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物MSP5LFB和反向环引物MSP5LBB，三对的外引物用于PCR检测；MSP5F3BACCTTCTGCTGTTCGTTGMSP5B3BGAGAAGCCATGCCTAACTCMSP5FIPBGTTGAAAGACGCGGAGGCTAAATCGGCGAF1CF2GAGGTTTACMSP5BIPBCCGTCAGTAGCGGCGATTTGTACTTACAGGB1。
4、CB2CTGAGAAGCMSP5LFBTGCCCTCACTTACAACTTCGMSP5LBBCGGCAAGCACATGTTGGTA。2根据权利要求1所述的环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，其特征在于，采用以下步骤完成LAMP反应体系是25L，包括04M外引物，16M内引物，08M环引物，1LDNA样品，硫酸镁1MMDNTPMIX1MM，1MM甜菜碱，25L10THERMOPOLBUFFERLU的BSTDNA聚合酶，加DDH20共25L；混匀后，加入20L油混匀并离心；在PCR管的中下部加入05LSYBRGREENI染料然后轻轻盖上，以防止SYBRGREENI染料降入管。
5、底；将混合物在63下恒温反应20分钟；反应后，在光亮视野下观察到混合物与SYBRGREENI染料在PCR管中的颜色变化，并在紫外线照射下365NM处也可观察到；之后LAMP产物3L用08琼脂糖凝胶电泳分析。权利要求书CN104293936A1/6页3一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途技术领域0001本发明属于生物工程技术领域，涉及一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途。背景技术0002牛边缘无浆体病是一种由边缘无浆体经蜱传播的专性寄生于红细胞内的血液传染疾病，主要引起牛、羊等反刍动物发病，。其特征为高热、贫血、消瘦、黄疸和胆囊肿大并广泛分布于。
6、世界热带和亚热带地区引起奶牛和肉牛产业相当大的经济损失KATHERINEETAL，2010。检测牛边缘无浆体的常见基因包括16SRRNA，热休克蛋白GROEL基因LEWETAL，2003，主要表面蛋白1AMSP1ALEWETAL，2002；MOLADETAL，2004，MSP4MOLADETAL，2004和MSP5MOLADETAL，2004；CORONAETAL，2009。牛边缘无浆体主要表面蛋白MSP5是由633BP单拷贝基因编码高度保守的19KU的蛋白，在免疫印迹试验中通过与单克隆抗体表面蛋白结合，MSP5ANAF16C1证明在已知的无浆体属的几个亚种中是高度保守的VISSERETAL，。
7、1992；ETAL，2012。因此，MSP5可以作为一种有效的诊断抗原。传统的检测边缘无浆体MSP5基因的方法是竞争性酶联免疫吸附法CELISASTRIKETAL，2007；ECHAIDEETAL，1998竞争抑制性酶联免疫吸附法CIELISANIETAL，2011，间接荧光抗体试验IFATOIE，2009，套式PCR法ECHAIDEETAL，1998，实时荧光定量PCRPICOLOTOETAL，2010和半套式PCR测定法SINGHETAL，2012。但是这些方法还有许多缺陷，例如，它们必须在实验室进行并且反应需要很长的时间。自2000年以来，NOTOMI开发出了环介导等温扩增方法LAMP，。
8、在恒温条件6065下，不到1H的时间里进行核酸扩增，具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点。环介导等温扩增技术已经广泛应用于快速检测动物病原病毒、细菌、寄生虫TOMITAETAL，2008。然而，使用LAMP技术诊断牛边缘无浆体病尚未见报道。发明内容0003本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，根据牛边缘无浆体保守基因MSP5设计了引物，评估LAMP技术的检测方法。0004其具体技术方案为0005一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，0006特异性LAMP引物根据MSP5基因设计3对引。
9、物外，内，环引物，正向外引物命名为MSP5F3B，反向外引物命名为MSP5B3B，正向内引物命名为MSP5FIPB，反向内引物命名为MSP5BIPB，为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物MSP5LFB和反向环引物MSP5LBB，三对的外引物用于PCR检测；0007说明书CN104293936A2/6页40008优选地，采用以下步骤完成0009LAMP反应体系是25L，包括04M外引物MSP5F3和MSP5B3，16M内引物MSP5FIP和MSP5BIP，08M环引物MSP5LF和MSP5LB，1LDNA样品，硫酸镁1MMDNTPMIX1MMTAKARABIOINC，JAPAN，1MM甜。
10、菜碱SIGMAALDRICH，STLOUIS，MO，25L10THERMOPOLBUFFERNEWENGLANDBIOLABS，INC，MA1U的BSTDNA聚合酶NEWENGLANDBIOLABS，INC，MA，加DDH2O共25L。混匀后，加入20L油SIGMAALDRICH，STLOUIS，MO混匀并离心。在PCR管的中下部加入05LSYBRGREENI染料SIGMAALDRICHSTLOUIS，MO然后轻轻盖上，以防止SYBRGREENI染料降入管底。将混合物在63下恒温反应20分钟。反应后，在光亮视野下观察到混合物与SYBRGREENI染料在PCR管中的颜色变化，并在紫外线照射下36。
11、5NM处也可观察到。之后LAMP产物3L用08琼脂糖凝胶电泳分析。0010与现有技术相比，本发明的有益效果为0011本发明使用MSP5基因的保守区作为特异性引物的扩增区域用LAMP法来诊断边缘无浆体。与常规PCR扩增方法相比，LAMP法更快速，经济适用于牛边缘无浆体的临床诊断。LAMP不需要特殊的设备和昂贵的试剂，而且该反应可在一个恒定温度的水浴中进行20分钟，并在紫外线照射或通过目视观察颜色的变化来确定LAMP的结果。在特异性方面，LAMP方法显示了与PCR的方法扩增其他四个血源性寄生虫的基因组DNA类似的特异性。在敏感性方面，LAMP法比PCR法灵敏。在LAMP反应溶液中加入20L油以防止。
12、挥发，并防止溶液接触SYBRGREENI染料在PCR管的中部。在反应之前加入SYBRGREENI染料为了避免产生气雾和假阳性。因此LAMP是一种高特异性，高灵敏度，时间短且操作简便，等温条件下快速检测临床样本的方法。附图说明0012图1是引物扩增效果图，其中，图1A为外引物分别进行PCR反应效果图，1和2外引物PCR扩增结果；3阴性对照；图1B为引物和牛边缘无浆体病基因组DNA作为模板应用说明书CN104293936A3/6页5LAMP方法的效果图，1和2LAMP引物扩增结果；3阴性对照；MDL2000MARKER0013图2是电泳分析LAMP反应时间琼脂糖凝胶电泳，16LAMP反应时间分别为。
13、10、20、30、40、50、60MIN；MDL2000MARKER；0014图3是牛边缘无浆体特异性检测结果，图3A牛边缘无浆体和4种血液寄生虫的PCR检测结果；图3B牛边缘无浆体和4种血液寄生虫的LAMP检测结果，16分别为贝氏贝诺孢子虫、锥体虫、弓形虫、双芽巴贝斯虫、阴性对照和牛边缘无浆体MDNAMARKERDL2000；0015图4是牛边缘无浆体敏感性检测结果，图4A牛边缘无浆体的PCR敏感性检测结果；图4B牛边缘无浆体的LAMP敏感性检测结果，19分别为牛边缘无浆体DNA模板的100，101，102108倍稀释，10为阴性对照；MDNAMARKERDL2000。具体实施方式0016下。
14、面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。0017牛边缘无浆体全基因组DNA来自黑龙江八一农垦大学动物科技学院免疫微生物实验室。贝氏贝诺孢子虫，锥体虫，弓形虫和双芽巴贝斯虫的基因组DNA由黑龙江八一农垦大学动物科技学院寄生虫实验室友情提供。0018实施例1牛边缘无浆体病LAMP特异性引物设计0019特异性LAMP引物根据MSP5基因GENBANK登录号M933921已发表序列的基础上采用PRIMEREXPLOERV4软件设计HTTP/PRIMEREXPLORERJP/LAMP400/INDEXHTML三组引物A，B，C。每组包括3对引物外，内，环引物。正向外引物分别命名为MS。
15、P5F3A，MSP5F3B和MSP5F3C。反向外引物分别命名为MSP5B3A，MSP5B3B和MSP5B3C。正向内引物分别命名为MSP5FIPA，MSP5FIPB和MSP5FIPC，反向内引物分别命名为MSP5BIPA，MSP5BIPB和MSP5BIPC。为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物MSP5LFA，MSP5LFB，MSP5LFC和反向环引物MSP5LBA，MSP5LBB，MSP5LBC。三对的外引物用于PCR检测。所有的引物如表1所示。0020表10021说明书CN104293936A4/6页60022说明书CN104293936A5/6页70023实施例2PCR检测002。
16、4所有PCR反应在DNA热循环仪TAKARABIOINC，JAPAN中进行。PCR体系包括1UL外引物MSP5F3和MSP5B3，1LDNA样品，125LPCRMASTERMIX2THERMOSCIENTICFERMENTAS，USA，95LDDH2O中。扩增条件为94预变性5MIN，30个扩增循环变性9450S，退火581MIN，延伸7250S，72延伸10MIN。PCR产物用08琼脂糖凝胶电泳分析。0025实施例3LAMP方法0026LAMP反应体系是25L，包括04M外引物MSP5F3和MSP5B3，16M内引物MSP5FIP和MSP5BIP，08M环引物MSP5LF和MSP5LB，1L。
17、DNA样品，硫酸镁1MMDNTPMIX1MMTAKARABIOINC，JAPAN，1MM甜菜碱SIGMAALDRICH，STLOUIS，MO，25L10THERMOPOLBUFFERNEWENGLANDBIOLABS，INC，MA1U的BSTDNA聚合酶NEWENGLANDBIOLABS，INC，MA，加DDH2O共25L。混匀后，加入20L油SIGMAALDRICH，STLOUIS，MO混匀并离心。在PCR管的中下部加入05LSYBRGREENI染料SIGMAALDRICHSTLOUIS，MO然后轻轻盖上，以防止SYBRGREENI染料降入管底。将混合物在63下恒温反应20分钟。反应后，在光。
18、亮视野下观察到混合物与SYBRGREENI染料在PCR管中的颜色变化，并在紫外线照射下365NM处也可观察到。之后LAMP产物3L用08琼脂糖凝胶电泳分析。0027实施例4LAMP方法反应时间的测定0028通过观察反应产物分别在10，20，30，40，50，60MIN时间点处颜色的变化来确定，然后分别对LAMP产物通过08琼脂糖凝胶电泳分析。0029实施例5LAMP方法的评估0030牛边缘无浆体病也被称为牛边虫病和其他四种寄生虫病都寄生在血液中，因此检测牛边缘无浆体LAMP方法的特异性利用四个血源性寄生虫的DNA进行评估。连续稀释10个DNA101107模板对LAMP检测牛边缘无浆体病的敏感性。
19、与PCR方法相比较。0031结果0032引物的选择0033从三组引物中A，B，C选出用于LAMP检测牛边缘无浆体最适合的引物，首先与外说明书CN104293936A6/6页8引物分别进行PCR。从A，B组的引物能扩增出单一276BP左右的DNA条带，但从C组的引物不能扩增出。此外，由B组扩增出的DNA条带显著比A组的图1A条带更亮。然后，通过三组A，B，C为引物和牛边缘无浆体病基因组DNA作为模板应用LAMP方法。从A，B组的引物能扩增出明显的阶梯状DNA电泳条带，而C组的引物不能图1B。因此，应用B组引物来诊断牛的无浆体病。0034测定LAMP方法的反应时间0035检测在10，20，30，4。
20、0，50和60分钟LAMP法的反应时间图2。LAMP反应后，将SBYRGREENI染料与产品混合；在明亮视野下观察到六个PCR管中颜色从橙色到绿色的变化，在没有DNA样品的阴性对照管中60分钟内都没有此变化。此外，在紫外线照射下，这六个反应产物在不同的反应时间下在365NM处也能看到清晰的绿色荧光，而在阴性对照管中没有此现象。0036牛边缘无浆体病LAMP方法评估结果0037用其他四个血源性寄生虫包括贝氏贝诺孢子虫，锥体虫，弓形虫和双芽巴贝斯虫的基因组DNA通过LAMP和PCR检测进行了特异性分析。从四个血液传播的寄生虫DNA为模板的两种PCR和LAMP法得到阴性结果。但从牛边缘无浆体DNA为。
21、模版的两种PCR和LAMP法得到的是阳性结果图3。牛边缘无浆体LAMP检测的灵敏度是通过10倍连续稀释100108牛边缘无浆体DNA样品为模板与PCR方法进行比较来确定。结果表明牛边缘无浆体LAMP方法比常规PCR法敏感100倍。牛无形体LAMP方法的检测限度是108倍稀释模板DNA图4。0038以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。说明书CN104293936A1/3页900010002序列表CN104293936A2/3页100003序列表CN104293936A103/3页11序列表CN104293936A111/2页12图1图2说明书附图CN104293936A122/2页13图3图4说明书附图CN104293936A13。