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幼龄动物胸腺生长因子及其提取分离方法
    本发明涉及从健康的幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)新鲜胸腺中提取具有生物活性的中小分子胸腺蛋白混合物，即胸腺生长因子，其分子量＜60KD；本发明还涉及从健康的幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)胸腺中提取其胸腺生长因子的提取分离方法。

    胸腺是机体的中枢免疫器官，是T细胞发育分化的场所，胸腺中有免疫增强作用的多种激素和免疫抑制作用的因子，这两类功能相对立的因子，共同担负着机体细胞免疫功能的调节作用。因此，分离纯化胸腺中各种因子具有十分重要的临床意义。    

    动物胸腺特别是幼龄动物胸腺生长因子能明显促进成纤维细胞，内皮细胸的增殖，对胃溃疡有明显的促愈合作用，在治疗消化性溃汤方面，可以取得疗程短，愈合率高，复发率低的良好效果，在消化性溃疡治疗及创伤愈合方面具有良好的临床应用、开发前景。

    本发明目的在于应上述临床应用、开发前景的需要，提供一种从幼龄动物胸腺中提取分离出动物胸腺生长因子的提取分离方法及动物胸腺生长因子。

    本发明提供的从幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)胸腺中提取分离动物胸腺生长因子的提取分离方法如下：

    1、提取：

    取健康幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)的新鲜胸腺(离体6小时之内)磨碎成匀浆，经FP2000型分离桂分离(西德产，分子量6万以下)，收集分离外液，浓缩冻干成幼龄动物胸腺生长因子干粉。

    在选材过程中，发现胸腺有包囊或结节、质地粗糙、色泽不正常或有异常气味及离体超过6小时者均不符合选材的质量要求。

    2、分离纯化：

    将上述幼龄动物胸腺生长因子冻干粉(蛋白浓度为15-20mg/ml)的水溶液，使用Pharmacia快速蛋白液相色谱仪(FPLC，LCC-500，P-500泵，MV-7进样器，UV280nm检测系统，0.5AuFs，阴离子交换柱MonoQHR5/5)对其幼龄动物胸腺生长因子冻干粉(蛋白浓度为15-20mg/ml的水溶液)进行纯化，加样量0.5ml/次，NaCl非线性梯度洗脱。洗脱A液：20mmol/L，Tris-Hle，pH8.0。洗脱B液：20mmol/l Teis-Hle，1.0mol/L，NaCl，pH8.0，洗脱速度为：1ml/min，使B液在0-60％之间为线性梯度，运行22min，B液在100％时洗脱5min，整个洗脱在32min完成，在280mm紫外检测进行峰收集，每个峰作为一组份收集，分别收集各洗脱峰，收集的样品用双蒸水透析(18-24h)去盐，低温干燥，最好是真空冷冻干燥。

    在紫外监测系统的监测下，整个洗脱过程共洗脱出和收集到9个组份吸收峰(分别称为W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9)。

    然后将各组份峰进行PAGE凝胶电泳，促细胞增殖活性等项测定。

    GradiFrac^TM柱层析系统分离纯化图谱见图1。

    经GradiFrac^TM纯化后各组份峰与促细胞增殖效应的关系测定：

    (一)SWiss3T3细胞[H³]-TdR掺入法测定各组份活性：

    1、方法：传代SWiss 3T3细胞经0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种到48孔培养板(Costa公司产品)中，每孔接种5×10⁴细胞，20小时后更换无血清培养液(DDED培养液内含15mM HEPES，33.3mM葡萄糖，5mg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，0.02％牛血清白蛋白)，继续培养24小时，加稀释好的不同样品，使每个样品终浓度皆为12.5μg/ml，同时加[³H]-TdR(终浓度为1μCi/ml)，37℃，5％CO₂继续培养，36小时后去掉培养介质，PBS洗二次，加甲醇固定二次，每次10min，水洗3次后，加5％三氯醋酸固定二次，再水洗三次，然后加入0.5N NaoH溶解细胞，点膜后，红外灯下烤下，加入闪烁液，液闪测定。

    2、结果：经GradiFrac^TM纯化后的9个组份峰和提取物原液的活性测定结果见表1、图2。

    表1  SWiss 3T3[H³]-TdR掺入法测定各组份活性结果样品对照      提取原液  W1        W2        W3         W4CPM值(X+SD)1445.7Δ  3684.6**  4041.2**  3103.4**  4833.7**   3795.5**±173.2   ±66.8    ±246.6   ±495.2   ±368.5    ±62.8样品W5         W6       W7        W8        W9CPM值(x+SD)2258.3**  1713.4    1486.3    1228.1    1278.5±17.0    ±147.6   ±108.0   ±233.3   ±327.2N＝3**/Δ表示与对照相比P＜0.01由表1得出：

    1)组份峰1、2、3、4、5均有促进3T3细胞增殖活性，而且W3活性最高。

    2)组份峰6、7、8、9没发现刺激3T3细胞增殖活性。

    从图2得出：1)W3和原样对3T3细胞有明显的促增殖作用，而且与剂量有明显的依赖关系；

    2)W3在5μg/ml就能明显出现促细胞增殖活性，10μg到最高峰；

    3)W3的活力明显高于提取原液，W3的活力比原提取液约高8倍。

    (二)内皮细胞(EC)增殖计数法测定各组份活性。

    1、方法：

    (1)内皮细胞(EC)的制备；取健康产妇分娩后3小时内的脐带，用D-Hanks液反复冲洗脐静脉至无血迹，灌入0.25％胰蛋白酶5ml置37℃水浴内10分钟收集消化液，用5ml含20％小牛血清的1640培养液冲洗脐静脉，收集冲洗液，将消化液及冲洗液合并收入离心管内，1000rpm，离心10分钟，去上清，加入内皮细胞培养液(内含20％小牛血清，200u/ml青霉素，0.2ug/ml链霉素，200ug/mlECGS)稀释沉淀细胞，将细胞接种于玻璃培养瓶内，置5％CO2，37℃细胞培养箱内培养，每2-3天换液一次，直至细胞单层形成，即进行传代培养。

    传代培养时，用D-Hanks液轻洗细胞2-3遍。用0.06％胰蛋白酶在室温消化1-2分钟，弃消化液，加入内皮细胞培养液，并用吸管吹打20-30次，制成细胞悬液。以1∶2∶3比率传代。用于实验的为第2-3代细胞，经VIII因子相关抗原(VIIIR.Ag)的抗体检测，确认为血管内皮细胞后方作为生物效应测定用细胞。

    (2)生物效应测定：每次取24孔塑料细胞培养板，于每个培养孔内(面积2cm²)加2×10⁴个细胞，将各检测样品，按不同浓度10、20、40、80、160、320ug/ml分别加入3孔细胞中平行检测。每份样品设立3孔空白对照(与盐水做对照)将上述细胞置5％CO₂，37℃细胞培养箱内静置培养72小时，收集细胞，台盼蓝染色，计数每孔内活细胞数，计数方法为：置显微镜下每孔随机计数5个高倍视野下的细胞数，取其均值，按下列等式换算成每平厘米培养出的细胞数。

    EC3/cm²＝细胞计数均值/0.19625×100[EC3：内皮细胞数，0.19625为每高倍镜视野(×400)面积，单位mm²]，数据经统计学处理。

    2、结果：

    经GradiFrac^TM系统纯化后各组份样品对EC增殖效应的影响见表2

    表2为10个不同样品对EC增殖效应的影响：样细蛋品胞白  数浓    度          蛋白浓度(ug/ml)10    20    40    80    160   320    W1    W2    W3    W4    W5    W6    W7    W8    W9  粗提原液  对照液13    18*   72Δ     28Δ    20*   1212    18*   28Δ      30Δ    14    1418*   23Δ     32Δ      24Δ    14*   1413    18*   24Δ      32Δ    18*   1612    16    22Δ      28Δ    18*   1613    12    16    16    12    1312    11    13    13    14    1412    12    14    13    16    1312    11    13    14    15    1612    16    18*   28Δ    26Δ      1412☆

    */☆    P＜0.05    Δ/☆    ＜0.01

    表2提示：W1-5均有明显刺激EC增殖活性，而且有剂量依赖关系，W3的活性最高，当蛋白含量在10ug/ml 时就能明显刺激EC生长，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。各组峰之间的活性关系与3T3细胞[H⁸]-TdB掺入法的测定结果相符，但两者之间的灵敏度不同。

    三、不同动物和不同年龄的动物胸腺提取物活性测定比较：

    (一)样品原材料：1、乳猪胸腺 2、乳牛胸腺 3、成年猪胸腺 4、成年牛胸腺 5、乳猪肝细胞提取液

    (二)提取方法：按上述本发明提供的动物胸腺生长因子的提取分离方法分别对(一)中提供的样品原材料进行提取制备其提取物。

    (三)测定方法按3T3细胞[3H]-TdR掺入法，中入量按20ug/ml计算

    (四)测定结果比较见表3

    表3为不同来源的样品促3T3细胞增殖活性测定结果比较：样品     对照    样品1    样品2    样品3    样品4  样品5cpm值    1244☆  4213**   3823**   2108     2210   2336(x±SD)  ±124   ±203    ±215    ±216    ±218  ±213

    **/☆表示样品与对照组比较P＜0.01

    注：样品1——乳猪胸腺提取物；

        样品2——乳牛胸腺提取物；

        样品3——成年胸胸腺提取物；

        样品4——乳猪肝细胞提取液；

        样品5——肝细胞提取液

    由表3得出，在提取工艺、活性测定方法及蛋白含量相同的情况下，观察不同样品的促细胞增殖活性发现，乳牛和乳猪胸腺提取物均有明显的促进3T3细胞增殖作用，而成年猪、成年牛胸腺和乳猪肝细胞提取物均未发现有明显促3T3细胞增殖的活性。说明应用乳猪和乳牛或其它幼龄动物的胸腺作为原料提取促细胞增殖物质，可提得同样的促细胞增殖效果，因为猪与人之间更具同源性故用乳猪胸腺较为合适些。

    四、用PAGEG-SDS凝胶电泳法测定各组份的分子量：

    (一)电泳方法：取30％丙烯酰胺贮存液6.95ml，加分离胶缓冲液4.25ml，水5.61ml，TEMED 0.017ml，10％过硫酸胺，0.17ml制成12％分离胶，再取30％丙烯酰胺0.65ml，浓缩胶缓冲液1.25ml水3.04ml TEMED 0.005ml，10％过硫酸胺0.05ml制成4％浓缩胶，样品加等体积缓冲液煮沸5分钟，冷却后上样30μl，其中一孔加标准分子量Mark(14.4、21.5、31、40、42.7、55、66.2、97.4KD)50MV电泳3小时，考马斯亮兰染色，观察结果。标准品(上海东风生化制药厂低分子量Mark)

    (二)电泳结果，9个组份峰样品经PAGE-SDS凝胶电泳结果见表4和图3

    表4为经GradiFrac^TM系统纯化后的各组份分子量测定结果：标    样 准    品   品   号    (KD)原提取液   W1      W2    W3    W4    W5   W6    W7     14.4     21.5     31.0     40.0     42.7     55.0     66.2     97.4  12.0     12.0  16.0     16.0  23.0                                    23.0  23.0  31.0     31.0                31.0  31.0 31.0  31.0  33.0     33.0    33.0  33.0  40.0     40.0  55.0     55.0                55.0  55.0 55.0  55.0各组份电泳带数目(条)  7        6       1     1     2     2    4     4

    表3 图3结果表明：(1)胸腺原提取液分子量范围约＜60KD，可以明显辩认的电泳带共约7条，分子量分别为12.0，16.0，23.0，31.0，33.0，40.0，55.0KD；(2)W1有6条电泳带，分子量分别为12.0KD，16.0KD，31.0KD，33KD，40.0KD，55KD；W2和W3仅有1条电泳带，分子量均为33.0KD；W4，W5各有2条电泳带，分子量分别为31.0KD和55.0KD；W6和W7各均有3条电泳带，分子量均为23.0KD，31.0KD，55.0KD。(3)该胸腺生长因子是一组分子量在12KD-55KD之间的多组份的混合物。

    五、各活性组份峰的稳定性测定

    (一)样品：组份峰1，组份峰3，组份峰5和分子量60KD以下的原提取液，共4个样品，均置于-20℃低温冰箱和30℃温箱内储存30天，观察活性效应的稳定性.

    (二)活性测定方法按[H⁸]TdR掺入法，W1，W3，W5按20ug/ml，而原提取液按40ug/ml加入作为测试浓度。

    (三)各活性组份峰和混合物提取物在两种不同条件下其活性稳定性测定结果见表5.

    表5为两种不同贮存条件下各组份峰稳定性测定结果：  样品  cpm值XM±SD           -20℃低温条件下贮存30天对照          W1        W3          W5        原提取液  置前  置后1325.7☆    3804.2**  4223.7**    2638.3**    3667.1**±168.3    ±238.6    ±362.3     ±193.2     ±68.31425.7☆   3906.3**   4327.3**    2562.3**    3678.3**±157.3    ±248.3    ±268.3     ±168.3     ±98.2    样品    cpm  值XM±SD         30℃条件下贮存30天对照         W1        W3         W5        混合物    置前    置后1325.2☆   3804.2**   4223.7**  2638.3**   3667.4**±168.3    ±238.6    ±262.3   ±193.2    ±68.31428.2☆   3683.3**   1586.3    1423.3     3557.4**±137.0    ±198.3    ±232.4   ±213.2    ±168.3**/☆  表示与对照组比较P＜0.01

    由表5得出：(1)各活性组份峰水溶液在-20℃低温条件储存30天内稳定。(2)在30℃条件下除原提取液和W1为混合物活性基本稳定不变之外，其它各组份峰均失去活性，说明混合物水溶液在室温条件下储存比较纯样品相对更为稳定，这为该提取物的贮存，运输推广应用提供了基础。    

    上述各项测定表明：

    (一)用超滤法从健康幼龄动物新鲜胸腺中提取的混合物，经GradiFrac^TM柱层析系统纯化，采用紫外监测方法收集到9个组份峰。

    (二)经3T3细胞[H3]-TdR掺入法和EC培养细胞增殖计数法检测活力发现，组份1.组份2，组份3，组份4，组份5均有不同程度促细胞增殖活性，其中组份3促细胞增殖活性最明显，而且有明显的剂量依赖关系，但组份6，组份7，组份8，组份9，均未检出有明显促细胞增殖效应。

    (三)经GradiFrac^TM柱层析系统纯化收集到的9个组份峰，经用PAGE-SDS凝胶电泳测分子量表明：(1)提取原液有7条电泳带，分子量分别为12.0，16.0，23.0，31.0，33.0，40.0，55.0KD，均＜60.0KD；(2)组份1有6条电泳带，分子量分别为12.0，16.0，31.0，33.0，40.0，55.0KD；(3)组份2和组份3各有1条电泳带，分子量均为33.0KD；(4)组份4和组份5各有2条电泳带，分子量均为31.0和55.0KD；(5)组份6，组份7各有3条电泳带，其分子量均为23.0，31.0，55.0ZD。

    (四)从各活性组份峰的稳定性测定表明，各活性组份峰水溶液在-20℃低温条件下贮存30天其活性均较稳定，但在30℃条件下贮存30天，除混合物和W1相对稳定之外，其它活性组份活性丧失，表明单组份或较纯组份的水溶液不利于常温保存，而混合物或多组份水溶性物质适合于常温长期贮存。

    综上所述，本发明提供的方法从幼龄动物胸腺中提取的胸腺生长因子。分子量在33.0KD和55.0KD的组份有明显的促3T3和EC增殖效应，尤其是分子量在33.0KD的组份活性最强，在pH2-8范围相对稳定，混合物和多组份物在常温条件下贮存相对稳定。故生产工艺应以提取分子量33.0和55.0KD为重点，考虑到组份的稳定性和工艺的简便程度，应收集60KD以下的混合物为好。

    本发明是从健康乳猪、乳牛或其它幼龄动物新鲜胸腺中提取具有生物学活性的中小分子胸腺蛋白混合物，(分子量＜60KD)。该混合物即幼龄动物胸腺生长因子能明显促进成纤维细胞，内皮细胞的增殖。对胃溃疡动物模型有明显的促愈合作用。在临床治疗消化性溃疡方面，取得了疗程短，愈合率高，复发率低的良好效果。在消化性溃疡治疗及创伤愈合方面具有良好的临床应用、开发前景。

    纯化后各组份电泳带分布图