核酸的检测方法.pdf

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1、10申请公布号CN104136611A43申请公布日20141105CN104136611A21申请号201380011166722申请日20130227201204005120120227JPC12N15/09200601C12Q1/6820060171申请人东丽株式会社地址日本东京都72发明人上田洋二中村史夫74专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理人曽祯段承恩54发明名称核酸的检测方法57摘要公开了在不使用核酸扩增和/或增感技术、通过夹心杂交来检测目标核酸的情况下，也可以高灵敏度地检测目标核酸的核酸的检测方法。目标核酸的检测方法包括使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针以及固定。

2、于支持体的捕捉探针依次或同时接触，使捕捉探针与目标核酸或其片段化处理物杂交，并且使目标核酸或其片段化处理物与多种检测探针杂交，由此介由捕捉探针和目标核酸或其片段化处理物而使多种检测探针结合于支持体的工序；接着检测结合于支持体的多种检测探针的工序。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014082786PCT国际申请的申请数据PCT/JP2013/0550852013022787PCT国际申请的公布数据WO2013/129457JA2013090651INTCL权利要求书1页说明书29页序列表16页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书29页序列表。

3、16页附图6页10申请公布号CN104136611ACN104136611A1/1页21目标核酸的检测方法，包括使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针以及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触，使所述捕捉探针与所述目标核酸或其片段化处理物杂交，并且使所述目标核酸或其片段化处理物与所述多种检测探针杂交，由此介由所述捕捉探针和所述目标核酸或其片段化处理物而使所述多种检测探针结合于所述支持体的工序；和检测结合于支持体的所述多种检测探针的工序。2根据权利要求1所述的方法，所述使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针以及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触的工序如下依次进行使所述目标核酸或其片段化处理物。

4、与多种检测探针杂交，接着使与所述多种检测探针杂交了的所述目标核酸或其片段化处理物与所述捕捉探针杂交。3根据权利要求1或2所述的方法，与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物的核酸长度的众数在100个碱基1500个碱基的范围。4根据权利要求13的任一项所述的方法，在与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物中离捕捉探针结合位置的距离为1500个碱基的范围内，使多种检测探针杂交。5根据权利要求13的任一项所述的方法，在与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物中离捕捉探针结合位置的距离为该目标核酸或其片段化处理物的核酸长度的众数以下的范围内，使多种检测探针杂交。6根据权利要求1。

5、5的任一项所述的方法，使目标核酸的片段化处理物与所述捕捉探针杂交，所述目标核酸的片段化处理物是以核酸长度的众数包含在100个碱基1500个碱基的范围内的方式将目标核酸进行片段化处理而得到。7根据权利要求16的任一项所述的方法，与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物，是没有经过利用核酸扩增法的扩增的目标核酸或其片段化处理物。8根据权利要求17的任一项所述的方法，将包含所述目标核酸的来源于动物的样本供于所述检测方法，该检测方法还包含以存在于动物基因组中的至少1种重复序列作为内标进行检测的工序，该重复序列包含于动物基因组片段中。9根据权利要求8所述的方法，还包含将所述动物基因组进行片段化的。

6、工序，所述重复序列包含于被片段化后的动物基因组中。10根据权利要求8或9所述的方法，所述动物是人。11根据权利要求810的任一项所述的方法，所述重复序列是短分散型核内重复序列。12根据权利要求11所述的方法，所述短分散型核内重复序列是ALU序列。权利要求书CN104136611A1/29页3核酸的检测方法技术领域0001本发明涉及核酸的检测方法。背景技术0002各种生物的遗传信息分析的研究已经开始，关于以人类基因为首的大量基因及其碱基序列、还有由基因序列所编码的蛋白质和由这些蛋白质二次加工成的糖链的信息正在迅速被阐明。对于序列被阐明的基因、蛋白质、糖链等高分子体的功能，可以通过各种方法来调查。。

7、作为主要的方法，对于核酸，可以利用RNA印迹NORTHERNBLOTING、或者DNA印迹SOUTHERNBLOTING这样的各种核酸/核酸间的互补性来调查各种基因与其生物体功能表达的关系。对于蛋白质，可以利用以蛋白质印迹WESTERNBLOTING为代表的蛋白质/蛋白质间的反应来调查蛋白质的功能和表达。0003作为核酸检测方法之一，已知夹心杂交法。夹心杂交法使用被固定于过滤器上的捕捉探针。捕捉探针与目标核酸的第1部分互补。在一个阶段中，使结合于过滤器的捕捉探针暴露于应对于目标核酸序列进行调查的样品，进一步暴露于与目标核酸的第2部分互补的带有标记的检测探针，但前述的第2部分与第1探针所互补的目。

8、标部分不同即，与它们不重复专利文献1、2、非专利文献1。该方法解除了在过滤器上固定化样品所需的工夫，另外可以选择第1探针使其适合支持体。0004现有技术文献0005专利文献0006专利文献1美国专利第4,486,539号0007专利文献2日本特开平775600号公报0008专利文献3日本特表平9507121号公报0009专利文献4WO99/477050010非专利文献0011非专利文献1SINIKKAPARKKINENETAL,JOURNALOFMEDICALVIROLOGY202792881986发明内容0012发明要解决的课题0013夹心杂交法一般在事先使用PCR法等核酸扩增技术将样本扩增。

9、之后进行检测。通过扩增目标核酸而检测灵敏度被增强，但另一方面，由于混入的杂质DNA也被扩增，因而不仅产生假阳性的担心，而且在同时检测多种基因时，需要相应于基因数的引物组，其品质管理需要大量的劳力。0014另一方面，也研究了多种不通过PCR法扩增目标核酸而进行检测的方法。下工夫研究了使目标核酸与捕捉探针杂交后，以标记体或者标签序列为基础，收入大量的发光体、或者荧光体等的增感技术，但是需要特殊的酶和/或复杂的反应、或特殊的支持体平面光说明书CN104136611A2/29页4波导等和/或特殊的发光体提供能够通过瞬时性激发发光来检测的信号的标识专利文献4。0015本发明的目的是，提供即使在不使用核酸。

10、扩增和/或增感技术而通过夹心杂交来检测目标核酸的情况下，也能够高灵敏度地检测目标核酸的核酸的检测方法。0016用于解决课题的方法0017本申请发明者们进行了深入研究，结果发现，在夹心杂交中，通过使与目标核酸的不同区域分别杂交的多种检测探针同时杂交，即使不使用核酸扩增和/或增感技术也可以高灵敏度地检测目标核酸，从而完成了本发明。0018即，本发明提供以下111。00191目标核酸的检测方法，包括0020使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针以及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触，使所述捕捉探针与所述目标核酸或其片段化处理物杂交，并且使所述目标核酸或其片段化处理物与所述多种检测探针杂交，由此介。

11、由所述捕捉探针和所述目标核酸或其片段化处理物而使所述多种检测探针结合于所述支持体的工序；和0021检测结合于支持体的所述多种检测探针的工序。00222根据1所述的方法，所述使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针以及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触的工序如下依次进行使所述目标核酸或其片段化处理物与多种检测探针杂交，接着使与所述多种检测探针杂交了的所述目标核酸或其片段化处理物与所述捕捉探针杂交。00233根据1或2所述的方法，与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物的核酸长度的众数在100个碱基1500个碱基的范围。00244根据13的任一项所述的方法，在与所述捕捉探针杂交的所述目标。

12、核酸或其片段化处理物中离捕捉探针结合位置的距离为1500个碱基的范围内，使多种检测探针杂交。00255根据13的任一项所述的所述的方法，在与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物中离捕捉探针结合位置的距离为该目标核酸或其片段化处理物的核酸长度的众数以下的范围内，使多种检测探针杂交。00266根据15的任一项所述的方法，使目标核酸的片段化处理物与所述捕捉探针杂交，所述目标核酸的片段化处理物是以核酸长度的众数包含在100个碱基1500个碱基的范围内的方式将目标核酸进行片段化处理而得到。00277根据16的任一项所述的方法，与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物，是没有经过利用核酸。

13、扩增法的扩增的目标核酸或其片段化处理物。00288根据17的任一项所述的方法，将包含所述目标核酸的来源于动物的样本供于所述检测方法，该检测方法还包含以存在于动物基因组中的至少1种重复序列作为内标进行检测的工序，该重复序列包含于动物基因组片段中。00299根据8所述的方法，还包含将所述动物基因组进行片段化的工序，所述重复序列包含于被片段化后的动物基因组中。003010根据8或9所述的方法，所述重复序列是短分散型核内重复序列。003111根据权利要求10所述的方法，所述短分散型核内重复序列是ALU序列。说明书CN104136611A3/29页50032发明的效果0033根据本发明，即使不使用PCR。

14、法这样的核酸扩增、或增感技术，也可以高灵敏度地进行核酸检测。附图说明0034图1是用于说明本发明的方法的原理的概念图。0035图2是显示核酸长度分析的例子的图。0036图3是显示实施例1中的捕捉探针和检测探针的位置的概念图。0037图4是显示实施例2中的捕捉探针和检测探针的位置的概念图。0038图5是突变分析中的夹心杂交的概念图。0039图6是显示实施例3和实施例4中的、KRAS突变捕捉探针和检测探针的位置的概念图。0040图7是显示实施例3和实施例4中的、EGFR突变捕捉探针和检测探针的位置的概念图。0041图8是显示作为内标使用来源于人的样本中所含的人基因组中的ALU序列来进行本发明的方法。

15、的实施方式的模式图。具体实施方式0042作为供于本发明的检测方法的目标核酸，可列举例如，病原菌和/或病毒等的基因、遗传病的病原基因等及其一部分等，但不限于这些。另外，作为包含这些目标核酸的样本，可列举血液、血清、血浆、尿、便、脑脊液、唾液、粘液、各种组织液等体液、和/或各种组织、石蜡包埋样本FFPE及其切片、各种饮食物以及它们的稀释物等，但不限于这些。另外，成为被检物质的目标核酸可以是从血液和/或细胞通过常规方法提取的样本核酸，也可以使用从样本提取的DNA和/或RNA等。作为DNA，可以使用染色体DNA，病毒DNA，细菌、霉等的DNA，将RNA进行逆转录而得的CDNA，作为它们的一部分的片段等。

16、，但不限于这些。作为RNA，可以使用信使RNA，核糖体RNA，小RNASMALLRNA和/或作为它们的一部分的片段等，但不限于这些。另外，化学合成的DNA、或者RNA等也可以作为目标核酸使用。0043样本核酸有时还包含除了作为测定对象的目标核酸以外的核酸成分非目标核酸。这些非目标核酸既可以考虑与目标核酸的性状的差而除去，也可以不除去地作为被检物质使用。0044目标核酸也可以是以该目标核酸作为模板通过PCR等核酸扩增法进行扩增而得的，可以大幅提高测定灵敏度。在以核酸扩增产物作为目标核酸的情况下，通过在用荧光物质等进行了标记的核苷三磷酸的存在下进行扩增，可以将扩增核酸进行标记。本来，通过本发明的方。

17、法，即使不使用核酸扩增法也可以以充分的灵敏度进行目标核酸的检测，而且如果使用核酸扩增法则产生假阳性的问题和/或操作花费工夫等问题，因此，本发明在应用于未经过利用核酸扩增法的扩增的目标核酸或其片段化处理物的情况下特别发挥威力。0045本发明的方法可以在区别目标核酸的有无、病毒的基因型、细菌的种和株、霉的种和株等的检测、SNP单碱基多态性的检测、信使RNA的检测、MIRNA的检测、CGH、拷贝数变化、基因组DNA序列的缺失重复融合、或者转录产物的缺失重复融合的检测中使说明书CN104136611A4/29页6用。另外，通过测定来自检测探针的信号强度，还可以应用于目标核酸的定量。此外，如果进行目标核。

18、酸的定量，则必然要进行目标核酸的检测，因此本发明的“检测方法”也包含伴随定量的情况。0046本发明的方法中可以直接应用目标核酸，也可以应用目标核酸的片段化处理物。本来，在目标核酸较长的情况1500个碱基以上、特别是4000个碱基以上的情况下，优选应用通过片段化处理而片段化成如后述那样适当的长度而得的片段化处理物。片段化处理物不需要从产生的核酸片段中选择特定的核酸片段，可以将片段化处理物直接供于本发明的方法，从而可以提高检测灵敏度。0047作为为了片段化而将目标核酸切断的方法，可以使用照射超声波而切断的方法、用酶切断的方法、用限制性酶切断的方法、使用雾化器的方法、用酸和/或碱切断的方法等。在用超。

19、声波切断的方法的情况下，可以通过控制照射于目标核酸的超声波的输出强度和照射时间来切断成所期望的长度。0048处理后的目标核酸可以使用以下所述的电泳法等分析方法来分析片段化的程度。如果分析的结果是超声波处理不充分，则可以进一步实施超声波处理，进行处理直至得到所期望的条件的目标核酸。作为超声波处理装置的例子，可以例示社、东湘电气、超声波式匀浆器社、VP050等。社S220通过设定DUTYFACTOR、PEAKINCIDENTPOWER,CYCLESPERBURST,TIME的4个参数，可以切断至所期望的长度。在想要使核酸长度的众数为400个碱基时，可以将DUTYFACTOR设定为10、PEAKIN。

20、CIDENTPOWER设定为140,CYCLESPERBURST设定为200,TIME设定为55。想要切断成其他长度时，按照社的推荐设定即可。0049作为用酶切断的方法，可以使用DSDNASHEARASE双链DNA剪切酶，社和/或限制性酶等，通过加温时间的加减来获得所期望的长度的核酸片段。作为一例，在使用DSDNASHEARASE时，按照制造商推荐的加温时间即可。例如，想要使核酸长度的众数为300个碱基时，在37孵育40分钟即可。对于其他的DNA切断方法，也同样可以通过加减处理的条件来控制切断片段的长度。0050片段化处理后的目标核酸可以以核酸长度的众数为指标进行评价。核酸长度的众数是指对片段。

21、化后的核酸使用琼脂糖凝胶电泳和/或生物分析仪社、DNA7500KIT、RNA6000NANOKIT这样的电泳法得到的峰顶值。将电泳的结果用电泳图谱表示，以波形最高的位置为峰顶，将从峰顶落下的垂线与X轴的交点的值定义为核酸长度的众数。核酸长度的分析方法可以参照日本特许4619202等。在通过琼脂糖凝胶电泳进行分析的情况下，可以使DNALADDER梯状条带社型号3415A等同时泳动，以其迁移率为指标，测定切断片段的峰顶。图2A是LADDER标志物与切断的核酸的琼脂糖凝胶电泳图像。将该图像使用像NIHIMAGENIH这样的图像处理软件，用波形表示亮度。此时，对于每个LADDER标志物求出距离电泳的原。

22、点的距离。在切断的核酸的情况下，求出至峰顶、即亮度最高的部分的距离。以从LADDER标志物得到的距离为基础，得到如图2C所述那样的标准曲线和回归方程。通过在回归方程中代入距离Y，可以求出切断的目标核酸的众数。如以上进行分析，则图2中使用的切断的目标核酸的核酸长度的众数为158个碱基。0051波形的形状可以是怎样都可以，与宽阔的相比，锋利的产生更好的结果。说明书CN104136611A5/29页70052通过上述的各种方法，可以获得具有所期望的核酸长度的众数的切断片段。核酸长度的众数的优选范围为100个碱基1500个碱基之间。更优选的范围为250个碱基500个碱基。0053即使在使用混入了非目标。

23、核酸的被检物质的情况下，也可以与上述同样地实施片段化处理，评价核酸长度的众数。0054支持体可以使用载玻片和/或膜、珠等。对支持体的材质不特别限定，可列举玻璃、陶瓷、硅等无机材料、聚对苯二甲酸乙二醇酯、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、硅胶等聚合物等。这样，通过本发明，可以使用一直以来在本领域常用的支持体，不需要使用像平面光波导那样的特殊支持体。从成本方面和/或避免复杂性的观点出发，支持体优选不是平面光波导。0055捕捉探针是指能够直接与受试样品所含的目标核酸地选择性地结合的物质。在本发明的目标核酸的检测方法中，具体可以使用DNA、RNA、PNA、LNA锁核酸，LOCKEDNU。

24、CLEICACID等的核酸衍生物。这里衍生物在核酸的情况下，是指被荧光基团等标识化的衍生物、包含修饰核苷酸例如受到包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基团的核苷酸和碱基的再构成、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子的替换等的核苷酸等的衍生物等化学修饰衍生物。0056具有特定碱基序列的单链核酸与具有与该碱基序列或其一部分互补的碱基序列的单链核酸选择性地杂交而结合，因此相当于本发明中所说的捕捉探针。本发明中使用捕捉探针可以是市售的，另外，也可以是从活细胞等得到的。作为捕捉探针，特别优选的是核酸。该核酸中，被称为寡核酸的长度为200个碱基以下的核酸可以用合成仪容易地人工合成。0057。

25、捕捉探针可以含有与目标核酸序列互补的序列，也可以选择任何区域。优选与以下所述的检测探针的序列不重复。另外，还可以使用与目标核酸的不同区域杂交的多种捕捉探针。本来，通过本发明的方法，即使捕捉探针为1种也会得到能够满意的检测灵敏度，因此捕捉探针对各目标核酸为1种因为单纯而优选。0058在目标核酸是双链DNA的情况下，可以选择与沃森链正义链、克里克链反义链的任一链互补的序列作为捕捉探针。以下所述的检测探针与捕捉探针优选选择相同链的序列。0059在区别检测样本核酸所含的不同目标核酸时，例如，区别检测感染患者的病毒的型等时，优选从可以在样本核酸中含有核酸序列的中，选择特异性高的序列区域。即，是指作为捕捉。

26、探针选择的序列在样本核酸所含的全部序列中除了该区域以外没有同源性高的序列。0060关于能够在单碱基多态性的检测中使用的捕捉探针的设计，可以使用专利文献3所提出的方法。具体地，将怀疑突变的碱基配置于捕捉探针的中央，在其前后附加10个碱基，制成全长21个碱基的捕捉探针。将在怀疑突变的碱基部分配置了A的捕捉探针、在怀疑突变的碱基部分配置了T的捕捉探针、在怀疑突变的碱基部分配置了G的捕捉探针、和在怀疑突变的碱基部分配置了C的捕捉探针作为捕捉探针组使用图5。进而，在检测多种SNP的情况下，更优选选择在捕捉探针组间TM值接近那样的序列。可以使用如下方法利用用于调整捕捉探针序列的长度的LNA等人工核酸。说明。

27、书CN104136611A6/29页80061同源性可以通过以初始设定使用该领域常用的同源性检索程序例如，BLAST、FASTA等来确定。另外，在其他情况下，同源性可以使用该领域公知的任意算法、例如，NEEDLEMAN等1970JMOLBIOL48444453、MYERS和MILLERCABIOS，1988，41117的算法等来确定。NEEDLEMAN等的算法被编入GCG软件包可以在WWWGCGCOM获得的GAP程序中，同源性可以通过使用例如BLOSUM62MATRIX或PAM250MATRIX、以及GAPWEIGHT16、14、12、10、8、6或4、和LENGTHWEIGHT1、2、3、4。

28、、5或6的任一者来确定。另外，MYERS和MILLER的算法被编入作为GCG序列比对软件包的一部分的ALIGN程序中。0062检测探针是指能够直接与受试样品所含的目标核酸结合的物质。在本发明的目标核酸的检测方法中，具体可以使用DNA、RNA、PNA、LNA锁核酸，LOCKEDNUCLEICACID等的核酸衍生物。这里衍生物在核酸的情况下，是指通过荧光基团等标识化的衍生物、包含修饰核苷酸例如受到包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基团的核苷酸和碱基的再构成、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子的替换等的核苷酸等的衍生物等的化学修饰衍生物。0063具有特定碱基序列的单链核酸可以与具。

29、有与该碱基序列或其一部分互补的碱基序列的单链核酸选择性地杂交而结合，因此相当于本发明中所说的检测探针。本发明中使用的检测探针可以是市售的，另外，也可以是从活细胞等中获得的。作为检测探针，特别优选的是核酸。该核酸中，被称为寡核酸的长度为200个碱基以下的核酸可以用合成仪容易地人工合成。0064在目标核酸是双链DNA的情况下，可以选择与沃森链、克里克链的任一链互补的的序列作为检测探针。上述的捕捉探针与检测探针优选选择相同链的序列。0065检测探针包含与目标核酸序列互补的序列即可，可以选择任意区域。但是，优选与上述的捕捉探针的序列不重复。进一步优选选择距离捕捉探针设计位置1500个碱基以内的范围的序。

30、列。0066检测探针的序列期望与捕捉探针同源性低，优选同源性为80以下，但可以考虑杂交时的严格度来确定。0067已知杂交时的严格度是温度、盐浓度、探针的链长、探针的核苷酸序列的GC含量和杂交缓冲液中的离液剂的浓度的函数。作为严格条件，可以使用例如，SAMBROOK,JETAL1998MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL2NDED,COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,NEWYORK所记载的条件等。严格的温度条件为约30以上。作为其他的条件，是杂交时间、洗涤剂例如，SDS的浓度、和载体DNA的存在与否等，通过组合这些条件，可以设定各种严格度。

31、。本领域技术人员可以适宜确定为了检测所期望的目标核酸而准备的捕捉探针、和用于获得作为检测探针的功能的条件。0068在检测样本核酸所含的多种目标核酸的情况下，可以使用在检测对象的目标核酸的间同源性为100的序列作为共同检测探针。在共同检测探针在检测对象的目标核酸的间同源性不是100的情况下，也可以使用简并序列。关于简并序列可以参考“实验本当PCR”、1999年、中山广树编、株秀润社发行、121页125页。0069检测探针可以结合标记体。在检测探针是核酸的情况下，可以在5末端或3末说明书CN104136611A7/29页9端的任一端、或两端结合标记体。另外，也可以在检测探针内部导入标记体。标记体的。

32、结合可以使用化学反应、酶反应等。优选使用化学反应使其反应。进一步优选在化学合成检测探针时，在末端结合标记体。也可以在检测探针的内部结合标记体。标记体的结合可以使用化学反应，可以用合成仪插入生物素标记。可以插入生物素TEG、生物素ON、生物素DT等HTTPS/WWWOPERONJP/INDEXPHP。0070在本发明中，作为可以使用的标记体，可以使用蛋白质结合性物质、荧光色素、磷光色素、放射线同位素等在标记中使用的公知物质。优选的是蛋白质结合性物质。作为蛋白质结合性物质的例子可列举生物素。生物素可以与亲和素或者链霉亲和素结合。可以使用在亲和素或者链霉亲和素上结合了荧光色素的物质、结合了碱性磷酸酶。

33、和/或辣根过氧化物酶等酶的物质。在使用碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶的情况下，添加各自的底物，底物与酶反应的结果产生发光反应。发光反应使用酶标仪和/或CCD相机等来检测。0071此外，这样通过本发明，可以使用一直以来在本领域常用的标记，不需要使用像提供能够通过瞬时性激发发光来检测的信号的标识那样的特殊标记。从成本方面和/或避免复杂性的观点出发，标记优选不是提供能够通过瞬时性激发发光来检测的信号的标识。0072作为标记体可以使用测定简便、信号容易检测的荧光色素。具体可列举菁菁2、氨基甲基香豆素、萤光素、吲哚碳菁菁3、菁35、四甲基罗丹明、罗丹明红、德克萨斯红、吲哚碳菁菁5、菁55、菁7、牡蛎、B。

34、ODIPY系色素、藻红蛋白等公知的荧光色素。0073另外，作为标记体可以使用具有发光性的半导体微粒。作为这样的半导体微粒，可列举例如硒化镉CDSE、碲化镉CDTE、铟镓磷INGAP、黄铜矿系微粒、硅SI等。荧光色素的检测可以用荧光显微镜和/或荧光扫描仪等来进行。0074检测到的信号与周围噪声进行比较。具体地，将从固定有捕捉探针的位置得到的信号值、与从除此以外的位置得到的信号值进行比较，将前者的数值高的情况作为检测到。0075作为在支持体固定化捕捉探针的方法，已知在支持体上面部合成寡DNA的方法、将预先合成好的寡DNA向支持体上面部滴加并进行固定的方法。前者的方法有RONALD等的方法美国专利第。

35、5705610号说明书、MICHEL等的方法美国专利第6142266号说明书、FRANCESCO等的方法美国专利第7037659号说明书。这些方法中在DNA合成反应时使用有机溶剂，因此担载体期望是对有机溶剂有耐性的材质。例如，可以使用利用日本特表平10503841号公报所记载的方法制作的有凹凸结构的玻璃担载体。特别是在FRANCESCO等的方法中从担载体的背面照射光，控制DNA合成，因此担载体优选是具有透光性的材质。后者的方法可使用广田等日本特许第3922454号的方法和/或玻璃毛细管。作为玻璃毛细管的一例，可以使用自制的玻璃毛细管和/或微量移液器株社制；MP005等市售制品，但不限于这些方法。

36、。0076关于从活细胞制备DNA或RNA可以通过公知的方法来进行，例如DNA的提取可以通过BLIN等的方法BLIN等，NUCLEICACIDSRES323031976等来进行，另外，RNA的提取可以通过FAVALORO等的方法FAVALORO等,METHODSENZYMOL657181980等来进行。作为固定化的核酸，进一步可以使用链状或环状的质粒DNA和/或染色体DNA、将它们通过限制性酶切断或化学地切断而得的DNA片段、在试管内通过酶等合成的DNA、或化学合成的寡核苷酸等。说明书CN104136611A8/29页100077因为本发明的方法是夹心杂交，所以基本的操作本身与公知的夹心杂交相同。

37、。即，使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触，使所述捕捉探针与所述目标核酸或其片段化处理物杂交，并且使所述目标核酸或其片段化处理物与所述多种检测探针，由此介由所述捕捉探针和所述目标核酸或其片段化处理物而使所述多种检测探针结合于所述支持体，接着，检测结合于支持体的所述多种检测探针。使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触的工序，1既可以首先使目标核酸或其片段化处理物、与多种检测探针接触而杂交，接着使与多种检测探针杂交了的目标核酸或其片段化处理物与固定化于支持体上的捕捉探针接触而杂交；2也可以相反地，首先使目标核酸或其片。

38、段化处理物、与固定化于支持体上的捕捉探针接触而杂交，接着使与捕捉探针杂交了的目标核酸或其片段化处理物与多种检测探针接触而杂交；3还可以使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针及固定于支持体的捕捉探针同时接触而使所述捕捉探针与所述目标核酸或其片段化处理物杂交，并且使所述目标核酸或其片段化处理物与所述多种检测探针杂交。其中，多数情况下下通过上述1的方法使其依次接触的方法检测灵敏度较高，因此优选。0078各杂交工序可以与现有完全同样地进行。反应温度和时间可根据杂交的核酸的链长来适宜选择，在核酸的杂交的情况下，通常为3070左右、1分钟十几小时，在免疫反应的情况下，通常为室温40左右、1分钟几小时左右。

39、。0079使用图1来说明本发明的概念。作为例子，使用全长有3000个碱基的目标核酸进行检测。0080捕捉探针可以在目标核酸的任何部分设计，在该例子中，使用从目标核酸的起始到第2200个碱基2230个碱基作为捕捉探针的结合序列。检测探针在距离捕捉探针结合的区域为1500个碱基的范围所包含的区域中设计4条。各检测探针和序列区域如下。检测探针1第2000个碱基第2019个碱基、检测探针2第2100个碱基第2119个碱基、检测探针3第2319个碱基第2330个碱基、检测探针4第2419个碱基第2430个碱基。0081离捕捉探针的距离，在目标核酸序列上配置捕捉探针结合位置和检测探针结合位置，以最远的碱基。

40、作为端部数出其间的碱基数。使用图1B的例子来说明。检测探针2第2100个碱基第2119个碱基、与捕捉探针第2200个碱基2230个碱基的距离，由于以最远的碱基的位置作为端部来数，因而距离为131个碱基。检测探针3第2319个碱基第2330个碱基、与捕捉探针第2200个碱基2230个碱基的距离，由于以最远的碱基的位置作为端部来数，因而距离为131个碱基。这样计算，检测探针1，4与捕捉探针的距离均为231个碱基。0082接着将目标核酸以核酸的众数为250个碱基的方式切断。使该目标核酸、检测探针1，2，3，4及捕捉探针杂交的模式图是图1A、图1B、图1C。0083目标核酸在任意位置被切断，因而像图1。

41、那样产生各种结合方式。0084图1A显示目标核酸在第2231个碱基以后被切断而得的片段的杂交方式。目标核酸可以结合检测探针1和检测探针2。0085图1B显示目标核酸在第2100个碱基之前、和第2330个碱基之后被切断而得的片段的杂交方式。目标核酸可以结合检测探针2、检测探针3。说明书CN104136611A109/29页110086图1C显示目标核酸在第2200个碱基之前、和第2430个碱基之后被切断而得的片段的杂交方式。目标核酸可以结合检测探针3、检测探针4。0087准备多条检测探针，进而将目标核酸以核酸长度的众数为250个碱基的方式切断，从而可以以图1的任一方式进行检测。0088另一方面，。

42、在仅准备1条检测探针的情况下，在任一情况下都不能检测。例如，如果仅有1条检测探针，则图1B、图1C的情况下不能检测，因而检测灵敏度降低。0089另外，在核酸长度的众数为150个碱基的情况下，能够与结合于捕捉探针的目标核酸结合的检测探针是检测探针2和检测探针3。因此，检测灵敏度降低。0090此外，在图1中，显示了在捕捉探针的两侧设计检测探针的例示，但检测探针也可以仅在捕捉探针的3末端侧、或者仅在5末端侧。0091一般地，在本发明这样的核酸的检测方法中，为了确认检测方法本身是否正确地进行，还同时检测内标。即，在通过检测方法检测不到目标核酸的情况下，不能判别是被检样品中不存在目标核酸，还是检测方法没。

43、有正确地进行。因此，使用在被检样品中普遍存在的核酸区域作为内标，如果该内标被检测到，则判断检测方法正确地进行，如果内标未被检测到，则判定检测方法没有正确地进行。在被检样品来源于人的情况下，作为内标一般使用肌动蛋白和/或球蛋白。在本发明的方法中，可以与现有的方法同样地，使用肌动蛋白基因和/或球蛋白基因作为内标，特别是在通过PCR等扩增目标核酸或其片段化处理物的情况下，可以没问题地使用与现有的方法同样的内标。0092然而，本发明的检测方如上所述，是发挥即使不进行核酸扩增法也能以充分的灵敏度检测目标核酸这样的优异效果的方法。在不进行核酸扩增法的情况下，肌动蛋白基因和/或球蛋白基因在基因组中仅有1拷贝。

44、，因此灵敏度不充，可能虽然检测方法正确地进行，也检测不到内标。0093为了克服该问题，在本发明的优选实施方式中，将包含所述目标核酸的来源于人等动物的样本供于所述检测方法，以存在于动物基因组中的至少1种重复序列作为内标进行扩增。该重复序列包含在动物基因组片段中。动物基因组片段可以是通过动物基因组的片段化处理而产生的，也可以是自然产生的片段。基因组片段的优选长度与上述的目标核酸或其片段化处理物的优选长度是同样的。作为动物，优选人；狗、猫等宠物；猪、牛、马、绵羊、山羊等家畜；猴、小鼠、大鼠等实验动物等哺乳动物，特别优选人，但也可以是其中存在重复序列的其他动物。作为重复序列，优选反转录转座子、特别是短。

45、分散型核内重复序列SHORTINTERSPERSEDNUCLEARSEQUENCE,SINE，尤其优选在人基因组中存在100万拷贝的ALU序列。ALU序列本身是周知的序列，其碱基序列也是周知的序列号47。0094将用于说明当目标核酸是病毒DNA、将包含人基因组的来源于人的样本供于检测方法时的本发明的方法的原理的概念图示于图8。在图8所示的方法中，作为内标使用人ALU序列。将捕捉ALU序列的人ALU序列捕捉探针固定化于支持体，使检测被捕捉到的人DNA的多种人ALU序列检测用探针与被捕捉到的人ALU序列杂交，从而检测被捕捉到的人ALU序列。这里，人ALU序列等动物DNA的检测可以与上述的目标核酸或。

46、其片段化处理物的检测方法同样地进行，优选的条件也与上述同样。0095实施例10096作为区别检测感染患者的病毒的型的例子，通过人乳头瘤病毒检测的实施例更详说明书CN104136611A1110/29页12细地说明本发明。当然，本发明不限于下述实施例。0097人乳头瘤病毒作为宫颈癌的原因病毒已知。人乳头瘤病毒存在100种以上的型，其中作为造成宫颈癌的恶性度的高的型存在13种。在宫颈癌的预防医学中，知晓受试者感染了哪种型的病毒在考虑治疗方针上成为重要信息。人乳头瘤病毒的型判别通过宫颈部的粘液进行。已知杂交捕捉法、PCR法等。通过将本发明应用于人乳头瘤病毒的检测，可以高灵敏度地特定受试者所感染的病毒。

47、的型。0098捕捉探针、检测探针的设计0099人乳头瘤病毒的型判别的研究早就在进行，捕捉探针可以灵活运用其研究成果。这里，作为一例使用文献JCLINMICROBIOL,1995P901905所报告的捕捉探针序列表1。该文献中，是如下构造以能够使用人乳头瘤病毒的L1基因区域的序列来判别型的方式设计了捕捉探针，使用型中共同的PCR引物MY11、MY09来扩增对象序列，然后使其与固定了与各型特异性地结合的捕捉探针的过滤器杂交，进行检测。因此，捕捉探针的设计位置在任一型中都位于与L1基因几乎相同的区域。在本发明中，着眼于捕捉探针的位置和共同引物的序列，通过使用共同引物作为共同的检测探针，从而使离捕捉探。

48、针的距离在型间几乎相同图3、表2。具有上述序列的捕捉探针由社合成在5末端加入了氨基修饰的合成DNA。检测探针由社合成在3末端和5末端进行了生物素标记的合成DNA。0100表10101名序列号探针序列53PROBE6序列号1ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAAPROBE11序列号2ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAAPROBE16序列号3GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAPROBE18序列号4TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAPROBE31序列号5TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGT。

49、GATACPROBE33序列号6TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTACPROBE34序列号7TACACAATCCACAAGTACAAATGCACCATAPROBE35序列号8GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGAPROBE39序列号9TCTACCTCTATAGAGTCTTCCATACCTTCTPROBE40序列号10GCTGCCACACAGTCCCCCACACCAACCCCAPROBE42序列号11CTGCAACATCTGGTGATACATATACAGCTG说明书CN104136611A1211/29页13PROBE43序列号12TCTACTGACCCTACTGTGCCCAGTACATATPROBE44序列号13GCCACTACACAGTCCCCTCCGTCTACATATPROBE45序列号14ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACATATGACPROBE51序列号15AGCACTGCCACTGCTGCGGT。