一种用于制备诊断5岁以下儿童肺结核的试剂盒及应用.pdf

本发明公开了一种用于制备诊断5岁以下儿童肺结核的试剂盒及应用。通过提取外周血单核细胞中的RNA，分别利用SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示的引物对，使用特异性聚合酶链式反应进行实时定量荧光PCR扩增白介素-9（Interleukin-9，IL-9），测定IL-9的反应Ct数值，通过实时定量PCR反应来检测外周血单核细胞中的IL-9改变，以此利用设定好的试剂盒来判定患儿是否患有肺结核，具有很高的特异性和准确率；而相对于现有技术采用的干扰素-γ释放试验在针对5岁以下儿童肺结核的诊断中未显示出任何诊断意义而言，本发明对该人群患儿提供了一种准确有效的免疫诊断手段。

1.  一种用于制备诊断5岁以下儿童肺结核的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
（1）制备ESAT-6蛋白；
（2）提取外周血单核细胞中的RNA ；
（3）分别利用SEQ IDNO ：1、SEQ ID NO ：2 所示的引物对：
正义引物：TGCAGTGCTAATGTGACCAGTTG；
反义引物：TGGTCTGGTGCAGTTGTCAGA；
（4）使用特异性聚合酶链式反应进行实时定量荧光PCR扩增白介素-9（Interleukin-9，IL-9）；
（5）测定IL-9的反应Ct数值。

2.  一种用于IL-9扩增的引物，其特征在于，所述的引物包含SEQ IDNO ：1、SEQ ID NO ：2 所示的引物对：
正义引物：TGCAGTGCTAATGTGACCAGTTG；
反义引物：TGGTCTGGTGCAGTTGTCAGA。

3.  一种用于制备诊断5岁以下儿童肺结核试剂盒的应用，其特征在于，通过实时定量PCR反应来检测外周血单核细胞中的IL-9改变，以此来判定患儿是否患有肺结核的应用。

一种用于制备诊断5岁以下儿童肺结核的试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体的说，本发明具体涉及用于肺结核诊断的试剂盒的技术领域，更进一步讲，本发明具体涉及一种用于制备诊断5岁以下儿童肺结核的试剂盒的技术领域。
背景技术
在发展中国家，结核的年感染率为2-5%，病死率为8-20%。在一岁以下结核感染的婴儿，终生转化为结核病的比例为50%，对1-2岁的幼儿，比例为20-30%。一般来说，70%的婴幼儿结核为胸腔内结核，23%为结核性脑膜炎，4%为扩散性结核。目前对5岁以下儿童肺结核的诊断主要依靠临床症状，体征，影像学检查，痰培养，以及结核菌素试验。由于婴幼儿免疫功能尚未发育成熟，结核病患儿经常发展为重型结核，像结核性脑膜炎等，而且发病迅速。因此，一种早期，快速，准确的结核病诊断方法将有利于确诊疾病，并快速，正确实施治疗。目前对5岁以下结核病患儿的诊断主要有以下几种方法：
(1) 临床指征：大约60%的结核病患儿是以常见的发烧，咳嗽来医院就诊。并辅助以X光检查。但这些检查均为非特异性的检查，常常难以和其他肺部感染性病灶，比如肺炎相区分。
(2) 痰涂片/培养：痰涂片/培养是诊断儿童肺结核的唯一金标准。但对5岁以下的儿童，痰液收集极为困难，而且培养结果阳性率极低。另外，痰涂片需时过长，常常延误治疗的实施。
(3) 结核菌素试验：是结核诊断中使用时间最长的一种方法。虽然简单，易行，价格低廉，但缺点是病人需二次就诊，结果判读可靠性差，导致特异性低，已逐渐被干扰素释放试验方法取代。
(4) 干扰素-γ释放试验（QuantiFERON-TB或T-SPOT.TB）：该试验基于的原理是，当结核菌感染个体的特异性T细胞受到结核杆菌抗原刺激时，会释放大量的干扰素，测定血中干扰素的浓度即可判断该个体是否受到结核菌感染。虽然该试验已在欧美被广泛的用于成人结核菌感染和结核病诊断，但该试验只能用于诊断个体是否受到结核菌感染，无法区分是结核菌感染的正常个体还是结核菌感染后的患者。在结核高感染区，如中国、印度人群中70-80% 的个体已受到结核菌感染，干扰素-γ释放试验在这些区域的应用便受到了限制，因其无法区分开结核病人和结核菌感染的健康人（Mahomed H et al. 2006）。更何况，干扰素-γ释放试验在儿童结核病诊断中应用的相关报道尚少，而且，研究表明该方法对儿童结核病的诊断效果与结核菌素试验没有区别（Mandalakas AM et al. 2011）。因此有必要提供一种新的针对5岁以下儿童肺结核的诊断方法来克服现有技术中存在的缺陷。
目前，已有数种实验室方法用于结核病的诊断，包括免疫诊断方法，基于培养基、噬菌体的核酸扩增或荧光显色方法检测结核菌，测定尿中脂阿拉伯甘露聚糖浓度等等。但以干扰素-γ释放试验为代表的免疫学诊断方法是唯一经FDA批准并在多个国家广泛使用的诊断方法，表明寻找结核病的免疫诊断方法是一条可行的方向。但是，干扰素-γ释放试验无法区分开成人结核病人和结核菌感染的健康人，其应用在高结核菌负荷区受到了限制，该方法在儿童肺结核诊断方面的应用研究更是匮乏。
发明内容
针对目前国内外未见针对5岁以下儿童肺结核诊断的相关试剂盒，现有技术又无法区分开成人结核病人和结核菌感染的健康人，其应用在高结核菌负荷区受到了限制的技术现状。本发明旨在提供一种用于制备诊断5岁以下儿童肺结核的试剂盒及应用技术方案，用于制备准确诊断5岁以下儿童肺结核，特别是对于结核病高发地区儿童，其开发和应用具有广泛的现实意义和价值。
本发明采用的技术方案：
本发明通过提供一种试剂盒，试剂盒包括提供一种结核分枝杆菌分泌的特异性蛋白质ESAT-6（Early secretory antigenic target 6），将特异性蛋白质ESAT-6与患儿外周血单核细胞共同培养，以激活外周血单核细胞中特异性T细胞，并表达相应的细胞因子。由于只有致病的野生型结核分枝杆菌分泌ESAT-6蛋白，而用于疫苗免疫的BCG菌株及其他非致病性的结核杆菌并不分泌ESAT-6蛋白，因此，正常BCG免疫的个体不会对ESAT-6的刺激产生免疫反应，也不会因被刺激而表达相应的细胞因子。试剂盒包括制备ESAT-6蛋白，提取外周血单核细胞中的RNA，分别利用SEQ IDNO ：1、SEQ ID NO ：2 所示的引物对，使用特异性聚合酶链式反应进行实时定量荧光PCR扩增白介素-9 （Interleukin 9，IL-9），测定IL-9的反应Ct数值，通过实时定量PCR反应来检测外周血单核细胞中IL-9的改变，以此利用设定好的试剂盒来判定患儿是否患有肺结核，具有很高的特异性和准确性；而相对于现有技术采用的干扰素-γ释放试验在针对5岁以下儿童肺结核的诊断中未显示出任何诊断意义而言，本发明对该人群患儿提供了一种准确有效的免疫诊断手段。
本发明具体提供了一种用于制备诊断5岁以下儿童肺结核的试剂盒，所述的试剂盒包括：
（1）制备ESAT-6蛋白。
（2）提取外周血单核细胞中的RNA 。
（3）分别利用SEQ ID NO ：1、SEQ ID NO ：2 所示的引物对。
SEQ ID NO ：1：TGCAGTGCTAATGTGACCAGTTG；
SEQ ID NO ：2：TGGTCTGGTGCAGTTGTCAGA。
（4）使用特异性聚合酶链式反应进行实时定量荧光PCR扩增IL-9。
（5）测定IL-9的反应Ct数值。
同时，本发明提供一种用于IL-9扩增，包含SEQ ID NO ：1、SEQ ID NO ：2 所示的引物对，所述的引物：
SEQ ID NO ：1：TGCAGTGCTAATGTGACCAGTTG；
SEQ ID NO ：2：TGGTCTGGTGCAGTTGTCAGA。
可以扩增 GeneBank 登录号为NM_000590.1（序列591bp，位点150-212）人IL-9的mRNA 特异性核苷酸序列。
进一步，本发明提供一种用于制备诊断5岁以下儿童肺结核试剂盒的应用，通过实时定量PCR反应来检测外周血单核细胞中的IL-9改变来判定患儿是否患有肺结核的应用，具有很高的特异性和准确性。
现有技术知悉，IL-9一直被认为是一种Th2细胞因子，主要由Th2细胞分泌，其功能主要是拮抗Th1细胞因子，如干扰素-γ。最近的研究表明，IL-9也可由多种T细胞亚类分泌，比如Th9细胞，Th17细胞和T调节细胞，并兼有免疫调节功能。因此，IL-9是一种多功能细胞因子。
基于现有技术中针对儿童肺结核尚无有效的免疫诊断方法，儿童肺结核与成人肺结核截然不同。由于婴幼儿的免疫功能尚未完善，在受到结核菌感染时，其免疫反应首先趋于Th2反应，分泌Th2细胞因子，比如IL-4，IL-5，IL-9，IL-13等。同时也诱导了T调节细胞的增加。本领域熟知，由于IL-9既具有Th2细胞因子的功能又兼有免疫调节因子的功能，本发明进一步探索了IL-9在儿童肺结核诊断方面的应用。发现通过测定5岁以下儿童血液中IL-9的变化，可以诊断儿童结核，特别是儿童肺结核。
通过实施本发明具体的技术方案，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。
（1）本发明提供一种用于肺结核诊断的试剂盒，所述试剂盒包含一种结核分枝杆菌分泌的特异性蛋白质ESAT-6，用于激活结核病患儿外周血单核细胞中的特异性T细胞，使其表达相应的细胞因子。应用所包含的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 的一对引物对，并通过特异性聚合酶链式反应，来检测血液中IL-9，用于准确判定5岁以下儿童是否患有肺结核，具有较高的敏感性、特异性和准确性，敏感性达66.67%，特异性达96%和准确率达88.24%。
（2）本发明提供用于肺结核诊断的试剂盒的一对引物对，一对引物对具有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2 所示的序列，并通过特异性聚合酶链式反应，来检测血液中IL-9，以判定5岁以下儿童是否患有肺结核。通过应用提供的试剂盒，针对5岁以下儿童肺结核的免疫诊断应用中，利用分子生物学原理检测血液中IL-9的表达量能够有效诊断5岁以下儿童肺结核并具有较高的敏感性、特异性和准确性，而相对于现有技术常见采用的干扰素-γ释放试验在针对5岁以下儿童肺结核的诊断中未显示出任何诊断意义而言，本发明对该人群患儿提供了一种准确有效的免疫诊断手段。
附图说明
图1显示为干扰素-γ的表达量图。图中显示在结核病人，肺炎病人和正常人之间没有差别，表明干扰素--γ无法区分结核病人和正常人。
图2显示为干扰素-γ的表达量图。图中显示在肺结核病人，肺外结核病人和正常人之间没有差别，表明干扰素-γ也无法区分肺结核病人和肺外结核病人。
图3显示为IL-9的表达量图。图中显示结核病人明显高于肺炎病人和正常人，表明IL-9可以区分结核病人和正常人。
图4显示为IL-9的表达量图。图中显示肺结核病人明显高于正常人，表明IL-9可以区分肺结核病人和正常人。通过肺外结核病人中IL-9的表达量和肺结核病人及正常人相比，无显著性差异，表明IL-9无法区分肺外结核病人和正常人。
图5显示为IL-9的ROC曲线图。图中显示可以有效区分结核病人和正常人（敏感性=82.76%，特异性=64%，准确率=74.07%，AUC=0.7676，95% 可信区间（CI)，0.64–0.89）。
图6显示为IL-9的ROC曲线图。图中显示可以有效区分肺结核病人和肺外结核病人（敏感性=66.67%，特异性=96%，准确率=88.24%，AUC=0.8533，95% 可信区间（CI)，0.67–1）。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指质量百分比。
 　采用的主要仪器设备：Ⅱ级生物安全柜、37℃5%CO₂培养箱、高速／低速离心机、荧光定量PCR仪、Thermo Fisher公司NanoDrop Lite、水浴锅、-80℃低温冰箱等。
主要原辅材料、试剂：ESAT-6蛋白、淋巴细胞分离液、SYBR Green PCR Master mix、逆转录酶、RNase 抑制剂、细胞裂解液（RLT缓冲液）、RPMI-1640（含L-谷氨酰胺）、胎牛血清、青霉素/链霉素、非必需氨基酸，丙酮酸钠等。
本发明中选用的所有试剂、仪器及原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：用于制备诊断5岁以下儿童肺结核的试剂盒
用于制备诊断5岁以下儿童肺结核的试剂盒，该试剂盒包括：
（1）制备ESAT-6蛋白。
（2）提取外周血单核细胞（PBMC）中的RNA 。
（3）分别利用SEQ ID NO ：1、SEQ ID NO ：2 所示的引物对：
SEQ ID NO ：1：TGCAGTGCTAATGTGACCAGTTG；
SEQ ID NO ：2：TGGTCTGGTGCAGTTGTCAGA。
（4）使用特异性聚合酶链式反应进行实时定量荧光PCR扩增IL-9。
（5）测定IL-9的反应Ct数值。
通过上述实施例提供的一对引物对具有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2 所示的序列，并通过特异性聚合酶链式反应来检测血液中IL-9，以判定5岁以下儿童是否患有肺结核。通过应用提供的试剂盒，针对5岁以下儿童肺结核的免疫诊断应用中，利用分子生物学原理检测血液中IL-9的表达量能够有效诊断5岁以下儿童肺结核并具有较高的敏感性、特异性和准确性，而相对于现有技术采用的干扰素-γ释放试验在针对5岁以下儿童肺结核的诊断中未显示出任何诊断意义而言，本发明对该人群患儿提供了一种准确有效的免疫诊断手段。
实施例二：用于制备诊断5岁以下儿童肺结核试剂盒的构建
1. ESAT-6的表达：冻干的重组ESAT-6蛋白由美国ProtevoBio公司提供。用无菌的PBS将ESAT-6稀释至1mg/mL浓度；小体积分装，保存使用。 
2. 外周血单核细胞（PBMC）的分离
（1）用EDTA抗凝采血管采集儿童静脉血注入盛有等体积的 Hank’s液的无菌试管中，混匀。
（2）将血液2倍体积的淋巴细胞分离液注入无菌离心管中，再将稀释好的抗凝血小心沿管壁加至分离液上，应注意保持两者界面清晰。
（3）室温2000 r／min离心20min，管内可分为四层。
（4）采用2mL一次性无菌吸管轻轻吸出乳白色的PBMC，加入另一支已含有20mLHank’s液的离心管中，混匀。
（5）室温下，1500r／min离心10min。
（6）弃上清，重复洗涤一次。加入5mLHank’s液定容计数，1500r／min离心10min。
（7）计数方法：将细胞悬浮液与0.4%台盼蓝按1:1混匀，染色2-3min。于显微镜下计数板计数，放大倍数为40×10。
3. PBMC的培养和刺激
在上述PBMC沉淀中加入2 mL预配好的培养液，吹打混匀，分别吸取1mL（PBMC为1×10⁶/ mL）加入两个细胞培养孔中，其中，一孔加10 μLESAT-6 (1mg /mL)，另一孔不加，置于细胞培养箱中（37℃，5%CO₂）培养24h。培养液的配制方法：90%RPMI-1640（含L-谷氨酰胺）；10%胎牛血清；青霉素（100U/mL）/链霉素（100μg/mL），非必需氨基酸溶液（100×），丙酮酸钠（100mM）。
4.RNA的提取：采用常见的试剂盒Qiagen RNeasy Mini Kit，货号：74104，按照试剂盒说明书操作步骤即可。用此试剂盒可以从1×10⁶PBMC中提取获得约3μgRNA，用Thermo Fisher公司NanoDrop Lite测得RNA纯度为1.89-2.03之间。
5.cDNA的合成：采用常见的试剂盒Roche Transcriptor cDNA Synth. Kit，货号：04896866001。按试剂盒要求取≤1μg RNA，取0.2-1μg RNA进行逆转录效果较好，通过反转录得到同样浓度的cDNA。
6.IL-9的扩增：采用常见的Qiagen公司QuantiFast SYBR Green PCR Kit货号：204056。我们采用这个试剂盒推荐的反应条件，扩增IL-9特异序列，得到的Ct值在20-30之间，是一个理想的反应区域，在技术上是可信的。
实施例三：
本发明的原理是基于应用肺结核分枝杆菌的特异性蛋白，ESAT-6刺激结核病患儿外周血中的特异性T细胞，使其表达和产生细胞因子IL-9。应用实时定量荧光PCR方法测定血液中IL-9的表达量来诊断儿童是否患有结核病。实时定量荧光PCR方法已愈来愈多的用于疾病的分子诊断，具有极高的灵敏性和特异性。干扰素-γ释放试验是经FDA批准的目前唯一用于成人结核菌感染及结核病诊断的免疫诊断方法。因此首先判断是否通过检测干扰素-γ表达量能够诊断5岁以下儿童结核病人。
本发明将正常儿童、肺炎患儿及结核病儿童的PBMC进行分离培养和ESAT-6刺激后，应用实时荧光定量PCR法检测外周血中干扰素-γ的表达量，将不同组之间干扰素-γ表达量进行比较，得出结论见附图1、2；参见附图1所示，相对于正常儿童及肺炎患儿，结核病儿童的干扰素-γ表达量并未显示出任何差异。进一步将结核病儿童分为肺结核和肺外结核，和正常儿童相比，也未发现干扰素-γ表达量有任何差异，参见附图2，表明干扰素-γ表达量在5岁以下的儿童中，无法区分正常儿童和结核病儿童，也无法区分正常儿童和肺结核儿童。
其次，本发明将正常儿童、肺炎患儿及结核病儿童（包括肺结核和肺外结核儿童）的PBMC进行分离培养和ESAT-6刺激后，应用实时荧光定量PCR法检测外周血中IL-9的表达量，将不同组之间IL-9表达量进行比较，得出结论见附图3、4：当测定结核病患儿外周血中特异性T细胞的IL-9表达量时，结核病患儿明显高于正常儿童（p<0.01）和肺炎儿童（p<0.05），提示高表达量的IL-9可以区分肺结核儿童和正常及肺炎儿童，参见附图3。进一步观察肺结核和肺外结核儿童，肺结核儿童仍然较正常儿童显示出较高的IL-9表达量，而肺外结核儿童的IL-9表达量和正常儿童没有区别，表明高IL-9表达量可以区分肺结核儿童和正常儿童，但无法区分肺外结核儿童和正常儿童，参见附图4。
本发明将结核病儿童（包括肺结核和肺外结核儿童）和正常儿童的PBMC进行分离培养和ESAT-6刺激后，应用实时荧光定量PCR检测外周血IL-9的表达量，评估其诊断的敏感性、特异性及准确性，得出结论见附图5、6：ROC曲线分析表明高IL-9表达量可以较好的区分结核病儿童和正常儿童（敏感性=82.76%，特异性=64%，准确率=74.07%，AUC=0.7676，95% 可信区间（CI), 0.64–0.89），参见附图5，但对肺结核儿童的区分率更高（敏感性=66.67%，特异性=96%，准确率=88.24%，AUC=0.8533，95% 可信区间（CI), 0.67–1），参见附图6。
通过上述实验验证本发明提供的试剂盒，用于针对5岁以下儿童肺结核的免疫诊断应用，利用分子生物学原理检测血液中IL-9的表达量能够有效诊断5岁以下儿童肺结核并具有较高的敏感性、特异性和准确性，敏感性达66.67%，特异性达96%和准确率达88.24%，参见附图5、6，而现有技术采用的干扰素-γ释放试验在针对5岁以下儿童肺结核的诊断中未显示出任何诊断意义，参见附图1、2，相对于现有技术未能有效解决5岁以下儿童肺结核免疫诊断的现有技术问题，本发明对该人群患儿提供了一种准确有效的免疫诊断手段。
实施例四：试剂盒Qiagen RNeasy Mini Kit，货号：74104说明步骤
采用Qiagen RNeasy Mini Kit，货号：74104，严格按照试剂盒说明书操作步骤操作。
（1）收集培养24小时的细胞（悬浮的细胞≤5×10⁶个细胞/mL），1500rpm离心10 min，小心吸弃上清液，加入350μL RLT缓冲液，震荡或吹吸混匀。
（2）向细胞裂解物中加入等体积的70%酒精，抽吸混匀。
（3）将上述混合液（约700μL）转移至带有2mL收集管的离心柱中，轻轻盖上盖子，8000g离心1min，丢弃穿通液。
（4）向离心柱中加入700μLRW1缓冲液，轻轻盖上盖子，8000g离心1min，丢弃穿通液。
（5）向离心柱中加入500μLRPE缓冲液，轻轻盖上盖子8000g或10000rpm离心1min，丢弃穿通液。
（6）向离心柱中加入500μL RPE缓冲液，轻轻盖上盖子8000g或10000rpm离心2min，丢弃穿通液。
（7）将离心柱移至一个新的2mL收集管中，以最高转速离心1min，以干燥膜。
（8）将离心柱移至一个无RNA酶的1.5mLEP管中，将30μl无RNA酶水直接加入离心柱的膜上，轻轻盖上盖子，8000g 离心1min，洗脱RNA。
实施例五：试剂盒Roche Transcriptor cDNA Synth. Kit说明步骤
Roche Transcriptor cDNA Synth. Kit，货号：04896866001。
根据RNA浓度，取0.2-1μg RNA进行逆转录效果较好，RNA最多加11μL，加入2μL 随机引物（600μM），65℃水浴10min，置冰上2min，在上述反应液中加入2μL dNTP（10mM）混合液、0.5μL 逆转录酶（20U/μL）、0.5μL RNase 抑制剂（40U /μL）和cDNA 合成buffer（5×）4μL，25℃ 10min，50℃ 60min，85℃ 5min，完成cDNA 制备。
实施例六：试剂盒Qiagen公司QuantiFast SYBR Green PCR Kit说明步骤
Qiagen公司QuantiFast SYBR Green PCR Kit，货号：204056
SYBR 荧光PCR反应体系为20μL，IL-9引物混合液1μL（20mM），2×SYBR Green PCR Master mix 10μL，cDNA1μL，DEPC 水8μL，扩增条件：95℃5min ；95℃10s，60℃30s，40个循环，每个循环最后一步检测荧光，制备融解曲线。
序列表
<110>  吴波，孙荷
<120>  一种用于制备诊断5岁以下儿童肺结核的试剂盒及应用
<130>  2014
<160>  3    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  591
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens IL-9
<400>  1
ccgctgtcaa gatgcttctg gccatggtcc ttacctctgc cctgctcctg tgctccgtgg       60
caggccaggg gtgtccaacc ttggcgggga tcctggacat caacttcctc atcaacaaga    120
tgcaggaaga tccagcttcc aagtgccact gcagtgctaa tgtgaccagt tgtctctgtt      180
tgggcattcc ctctgacaac tgcaccagac catgcttcag tgagagactg tctcagatga     240
ccaataccac catgcaaaca agatacccac tgattttcag tcgggtgaaa aaatcagttg     300
aagtactaaa gaacaacaag tgtccatatt tttcctgtga acagccatgc aaccaaacca     360
cggcaggcaa cgcgctgaca tttctgaaga gtcttctgga aattttccag aaagaaaaga    420
tgagagggat gagaggcaag atatgaagat gaaatattat ttatcctatt tattaaattt       480
aaaaagcttt ctctttaagt tgctacaatt taaaaatcaa gtaagctact ctaaatcagt        540
atcagttgtg attatttgtt taacattgta tgtctttatt ttgaaataaa t                  591
 
<210>  2
<211>  24
<212>  DNA
<213>  SEQ ID NO ：1
<400>  2
tgcagtgcta atgtgaccag ttg   23
 
<210>  3
<211>  21
<212>  DNA
<213>  SEQ ID NO ：2
<400>  3
tggtctggtg cagttgtcag a   21