无内源性基因组DNA的TAQDNA聚合酶的制备方法.pdf

本发明提供一种无内源性基因组DNA的TaqDNA聚合酶的制备方法，利用本方法能够快速获得无宿主基因组DNA的TaqDNA聚合酶，其中包括TaqDNA聚合酶蛋白的表达、细胞的破碎，宿主细胞内源性基因组DNA的去除及TaqDNA聚合酶的制备。本方法简化了纯化程序，提高了纯化效率，降低了制备成本，获得了无内源性核酸的TaqDNA聚合酶，能够用于普通PCR扩增的自制TaqDNA聚合酶。本方法适用于快速制备无内源性基因组DNA的TaqDNA聚合酶，建立了一种简易的纯化技术。

1.  一种无内源性基因组DNA的Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：所述方法包括Taq DNA聚合酶蛋白的表达、细胞的破碎、宿主细胞内源性基因组DNA的去除及Taq DNA聚合酶的制备。

2.  根据权利要求1所述的一种无内源性基因组DNA的Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：Taq DNA聚合酶蛋白的表达：挑取含Taq DNA聚合酶基因的E.coli菌株到4ml LB培养基中；37℃，200rpm摇床过夜培养，取0.1ml此培养物到500ml液体LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养约6.5小时，加人异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为125 mg/L，诱导14 小时；所述LB培养基含有氨苄西林抗生素80mg/L。

3.   根据权利要求1所述的一种无内源性基因组DNA的Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：细胞的破碎：将培养后的菌液用离心机离心收集菌体，5000 rpm/min 离心10 min收集菌体，加入30ml start buffer，超声波细胞粉碎机破碎细胞，程序如下：破碎总时间为300秒，功率为35%，每破碎6秒钟后停止9秒钟；细胞破碎结束后，11000rpm/min 离心10 min收集上清。

4.  根据权利要求3所述的一种无内源性基因组DNA的Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：所述start buffer溶液的配置：pH8.0、20 mM Tris-HCl。

5.  根据权利要求1所述的一种无内源性基因组DNA的Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：宿主细胞内源性基因组DNA的去除及Taq DNA聚合酶的制备：本次实验主要采用AKTA蛋纯化仪纯化DNA聚合酶；所有溶液必须采用双蒸水配置，并用0.45 μm的滤膜过滤，配好的溶液应存储在4°C冰箱中；将HiTrap Q FF阴离子交换柱装到AKTA蛋纯化仪上后用20ml start buffer 平衡阴离子交换柱，用AKTA蛋纯化仪的泵A上样，上样结束后用buffer A洗掉与阴离子交换柱装结合能力较弱的蛋白，再用Buffer B 将Taq DNA聚合酶蛋白洗脱下来，最后用Buffer C洗掉与阴离子交换柱装结合能力较强的蛋白。

6.  根据权利要求5所述的一种无内源性基因组DNA的Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：所述Buffer A溶液的配置：pH8.0、20 mM Tris-HCl, 0.15 mM NaCl ；Buffer B 溶液的配置：pH8.0、20 mM Tris-HCl, 0.25 mM NaCl ；Buffer C 溶液的配置：pH8.0、20 mM Tris-HCl, 1M NaCl。

无内源性基因组DNA的TaqDNA聚合酶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种无内源性基因组DNA的Taq DNA聚合酶的制备方法，属于生物技术领域。
技术背景
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术，它是现代分子生物学最重要的手段之一。其基本原理是根据获诺贝尔1953年生理学奖的DNA双螺旋模型所建立的体细胞复制的机制以及双链DNA在体外可随温度变化发生变性与复性的特点设计。1985年Randll.K.Skaii等利用Klenow DNA聚合酶建立了聚合酶链式反应技术，并将其应用于镰刀形贫血病的基因诊断。它是80年代分子生物学领域的一项革命性突破，被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程碑。此项技术一经问世就因其操作简单、快速、灵敏度高和特异性强等优点迅速在与分子生物学相关的学科得到广泛应用，如分子生物学研究、医学检验、动植物检验、法医鉴定及考古等各个领域。
在PCR过程中，DNA聚合酶起着关键性作用。目前已有100多个DNA聚合酶的相关基因被克隆和测序，Thermus aquaticus是一种水生嗜热菌，从该菌中分离出的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)具有催化以DNA为模板合成DNA的功能，Taq DNA聚合酶是一种极端耐热的DNA聚合酶，在97.5°C 5-6min可保持约50%酶活性，它是第一个被应用于PCR的高热稳定DNA聚合酶，也是活性最高的一种耐热DNA聚合酶，具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切核酸酶活性，同时还存在非模板依赖性活性，因此利用Taq DNA聚合酶可实现PCR产物的直接克隆(T-A法)。由于Taq DNA聚合酶的发现，PCR技术才真正得以推广，并被广泛应用于基因诊断、定点突变、DNA序列测定以及DNA多态性研究等。
随着聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)在分子生物学上的广泛应用，作为PCR技术关键的DNA聚合酶的需求也越来越大。为了提高该蛋白在大肠杆菌中的表达量，简化纯化工艺的尝试一直没有停止，基因工程Taq DNA聚合酶表达载体的构建便利了该酶的纯化。但是，在制备的过程中会有大量的宿主基因组DNA的残留，残留的宿主DNA极大地限制了Taq DNA聚合酶的使用范围，使其无法用于微生物品种的鉴定。同时，传统的制备方法中多步骤、长时间的分离纯化不但提高酶制品的成本，而且不利于酶的活性。因此，研制出一种无内源性基因组DNA的快速Taq DNA聚合酶的制备方法对于Taq DNA聚合酶的生产和使用都具有极大的应用价值。
发明内容：
本发明提供一种无内源性基因组DNA的快速Taq DNA聚合酶的制备方法，获得无宿主基因组DNA的Taq DNA聚合酶，并代替商品化的Taq酶适用于普遍的PCR检测实验。
一种无内源性基因组DNA的快速Taq DNA聚合酶的制备方法，包括Taq DNA聚合酶蛋白的表达、细胞的破碎，宿主细胞内源性基因组DNA的去除及Taq DNA聚合酶的制备。
具体步骤如下：
Taq DNA聚合酶蛋白的表达：挑取含Taq DNA聚合酶基因的E.coli菌株到4ml LB培养基中。37℃，200rpm摇床过夜培养，取0.1ml此培养物到500ml液体LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养约6.5小时，加人异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为125 mg/L，诱导14 小时。所述LB培养基含有氨苄西林抗生素80mg/L。
 细胞的破碎：将培养后的菌液用离心机离心收集菌体，5000 rpm/min 离心10 min收集菌体，加入30ml start buffer，超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司-中国）破碎细胞，程序如下：破碎总时间为300秒，功率为35%，每破碎6秒钟后停止9秒钟。细胞破碎结束后，11000rpm/min 离心10 min收集上清。
 宿主细胞内源性基因组DNA的去除及Taq DNA聚合酶的制备：本次实验主要采用AKTA蛋纯化仪纯化DNA聚合酶。所有溶液必须采用双蒸水配置，并用0.45 μm的滤膜过滤，配好的溶液应存储在4°C冰箱中。将HiTrap Q FF阴离子交换柱装到AKTA蛋纯化仪上后用20ml start buffer 平衡阴离子交换柱，用AKTA蛋纯化仪的Pumb A（泵A）上样，上样结束后用Buffer A洗掉与阴离子交换柱装结合能力较弱的蛋白，再用Buffer B 将Taq DNA聚合酶蛋白洗脱下来，最后用Buffer C洗掉与阴离子交换柱装结合能力较强的蛋白。
start buffer溶液的配置：20 mM Tris-HCl（pH8.0)；
Buffer A溶液的配置：20 mM Tris-HCl, 0.15 mM NaCl （pH8.0)；
Buffer B 溶液的配置：20 mM Tris-HCl, 0.25 mM NaCl （pH8.0)；
Buffer C 溶液的配置：20 mM Tris-HCl, 1M NaCl （pH8.0)。
采用本发明所提供的方法具有突出的特点：
1.   降低了DNA聚合酶的制备成本。
 2.   提高了DNA聚合酶的制备速率。
 3.   能去除DNA聚合酶中残留的宿主基因组DNA。
附图说明
图 1为AKTA蛋白纯化仪UV吸收峰图；波峰1,2,3分别表示用Buffer A洗脱下来的与阴离子交换柱结合能力较若的杂蛋白，用Buffer B 洗脱下来的Taq DNA聚合酶蛋白，用Buffer C 洗脱下来的与阴离子交换柱结合能力较强的杂蛋白。
图2为SDS-PAGE蛋白检测图；泳道1,2,3分别表示Buffer A洗脱下来的与阴离子交换柱结合能力较若的杂蛋白SDS-PAGE蛋白检测图，用Buffer B 洗脱下来的Taq DNA聚合酶蛋白SDS-PAGE蛋白检测图，用buffer C 洗脱下来的与阴离子交换柱结合能力较强的杂蛋白SDS-PAGE蛋白检测图
图3 PCR电泳图，用制备好的Taq DNA聚合酶进行PCR验证，泳道1为内源性DNA检测结果，泳道2为DNA marke，泳道3为阳性对照。
具体实施例
实施例1
本发明提供一种无内源性基因组DNA的快速Taq DNA聚合酶的制备方法，具体步骤如下：
(1)Taq DNA聚合酶蛋白的表达：挑取含Taq DNA聚合酶基因的E..coli菌株到4ml LB(含有Amp抗生素80mg/L)中。37℃，200rpm摇床过夜培养，取0.1ml此培养物到500ml液体LB(含有Amp抗生素80mg/L)中，37℃，200rpm震荡培养约6.5小时，加人IPTG至终浓度为125 mg/L，诱导14 小时。
(2)细胞的破碎：将培养后的菌液用离心机离心收集菌体，5000 rpm/min 离心10 min收集菌体，加入30ml start buffer，超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司-中国）破碎细胞，程序如下：破碎总时间为300秒，功率为35%，每破碎6秒钟后停止9秒钟。细胞破碎结束后，11000rpm/min 离心10 min收集上清。
(3)宿主细胞内源性基因组DNA的去除及Taq DNA聚合酶的制备：本次实验主要采用AKTA蛋纯化仪纯化DNA聚合酶。所有溶液必须采用双蒸水配置，并用0.45 μm的滤膜过滤，配好的溶液应存储在4°C冰箱中。将HiTrap Q FF阴离子交换柱装到AKTA蛋纯化仪上后用20ml start buffer 平衡阴离子交换柱，用AKTA蛋纯化仪的Pumb A（泵A）上样，上样结束后用buffer A洗掉与阴离子交换柱装结合能力较弱的蛋白，再用Buffer B 将Taq DNA聚合酶蛋白洗脱下来，最后用Buffer C洗掉与阴离子交换柱装结合能力较强的蛋白。
 (4)宿主基因组DNA残留的检测：利用16sr DNA基因的扩增检测制备的Taq DNA聚合酶是否有宿主基因的残留，PCR扩增体系如下：rTaq酶 0.3μl，PCR Buffer 2.5μl，DNTP 1μl，引物R 1μl，引物F 1μl，灭菌水19.2μl。同时，设置阳性对照，阳性对照扩增体系如下：rTaq酶 0.3μl，PCR Buffer 2.5μl，DNTP 1μl，引物R 1μl，引物F 1μl，大肠杆菌菌液 1μl，灭菌水18.2μl。PCR扩增程序如下：95°C 5min；95°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，35个循环；72°C 5min。将扩增得到的产物用1%琼脂糖凝胶中电泳检测。其中通过检测阳性对照可以扩增出基因片段，说明该方法所获得的rTaq酶具有扩增活性，宿主基因组DNA残留的检测结果无法扩增出基因片段，说明该方法获得的rTaq酶不含有宿主基因组DNA。
start buffer溶液的配置：20 mM Tris-HCl（pH8.0)
Buffer A溶液的配置：20 mM Tris-HCl，0.15 mM NaCl （pH8.0)
Buffer B 溶液的配置：20 mM Tris-HCl，0.25 mM NaCl （pH8.0)
Buffer C 溶液的配置：20 mM Tris-HCl，1M NaCl （pH8.0)
引物R: 5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；引物F :5’- GGTTACCTTGTTACGACTT -3’。
    土壤微生物基因组DNA检测结果见图1，提取得到的微生物基因组DNA条带清晰明显，无杂带。将所获得的土壤微生物DNA进行16sr DNA基因的扩增，结果见图2,从图中可看出，通过本试剂盒所提出的DNA无需经过进一步纯化便能直接进行16s rDNA扩增。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  福建师范大学
 
<120>  无内源性基因组DNA的Taq DNA聚合酶的制备方法
 
<130>  2
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gagagtttga tcctggctca g                                               21
 
 
<210>  2
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
ggttaccttg ttacgactt                                                  19