发光蛋白基因载体的构建与发光基因免疫诊断试剂 本发明涉及一类自动发光蛋白基因表达载体的构建，其表达产物可用于快速方便地检测乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)。
绿色荧光蛋白(GFP)是从海洋无脊椎动物分离的，能够发射绿色荧光的特殊蛋白质。最初从多管水母属(Aequoria Victoria)分离出光蛋白，GFP最大吸收波长为395nm，在475nm还有一个肩峰，最大发射波长为509nm。Prasher测定全部GFP基因序列，GFP基因编码238个氨基酸，构成生色基团的三个氨基酸Ser，Try，Gly位于65-67位。1994年Chafie[Science，263(1994)802]在大肠杆菌细胞中表达了能发射绿色荧光的GFP，Heim[Nature373(1995)663]采用定点突变技术获得了GFP突变体克隆，将65位丝氨酸(S)变为苏氨酸(T)，获得了发光能力更强的突变基因。检测GFP只需要一定波长的光激发，不受底物的限制。
乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是严重威胁人类健康的两种肝脏类病毒，是诱导肝脏发生癌症的主要病因之一。众所周知，目前对HBV感染的诊断，大多是依据RIA和ELISA检测其血清标志物；对HCV的确诊，主要有两种方法，即检测抗-HCV抗体及检测HCV cDNA。目前常用的这些方法工作量大，时间长，程序多，条件难以控制，灵敏度低；而特导性强，灵敏度高的PCR又因所需特殊的仪器和设备，检测试剂价格昂贵，很难在基层推广应用。
本发明的目的是构建绿色荧光蛋白(GFP)基因与肝炎病毒抗原的基因融合体，该融合体在大肠肝菌中表达的蛋白质既有肝炎病毒的抗原，又能发射易于检测的绿色荧光。
本发明的另一个目的是利用表达的具有绿色荧光的肝炎病毒抗原快速检测肝炎病毒，该方法灵敏度高，操作简单快速，适于普查，可广泛应用于各基层医院。
根据本发明，上述基因融合体为能表达GFPwt-Core融合蛋白的质粒pGC-220和/或能表达GFP-HBeAg融合蛋白的质粒pS65TP-He。
质粒pGC-220地构建过程是：
1.用EcoRI单酶消化含GFP基因的pGFP10.1质粒，回收1kb的GFP CDNA片段，在该片段的702bp处用Pvu II再次酶切，回收0.7kb的GFP EcoR I-Pvu II大片段，克隆到pGEM 3zf(-)DNA的EcoR I-Sma I位点，得到pG-1质粒。
2.从pG-1质粒上回收0.7kb的GFP EcoR I-BamH I片段，从含有HCV Core区基因的NC质粒上回收HCV Core基因的BamH I-Hind III片段，两个片段再与经EcoR I-Hind III双酶消化的pGEM3zf(-)连接，构建成带有共同编码框的GFP-Core嵌合基因的克隆载体pGC-2。
3.用EcoR I-Pst I双酶消化pGC-2质粒，回收1.2Kb的GFP-Core嵌合基因，定向插入到表达质粒pBV220的双启动子PRPL下游MCS(载体的多克隆位点)的EcoR I-Pst I位点处，使GFP-Core融合基因处于PRPL启动子控制之下。
质粒pS65TP-He的构建过程是：
1.将突变型GFP S65T基因的BamH I片段插入到质粒pRSET-B的BamHI位点上，使GFPS65T基因处于T7启动子控制之下，形成载体pS65T，用Pvu II消化pS65T DNA，从GFP基因3’末端切去12个氨基酸的编码区，回收大片段自我连接成环后转入大肠杆菌BL21，用酶切鉴定法筛选阳性重组体pS65TP。
2.用Hind III完全消化pS65TP DNA，再加EcoR I部分消化，回收保留有GFP基因的Hind III-EcoR I大片段，用EcoR I、Hind III双酶消化质粒pGHe DNA，回收0.45kb的HBV e基因小片段，用T4DNA连接酶将这两个片段连接，筛选得GFP-HBeAg融合蛋白表达载体pS65TP-He。
质粒pGC-220转入大肠杆菌，热诱导后收集菌体，过SDS-PAGE，用考马斯蓝染色，在40KD的位置上可见GFP-Core融合蛋白表达带，Wester blot和Dot-ELISA测定，此蛋白可与人的阳性血清和免疫兔血清HCV-1，HCV-2，HCV-3起反应，具备三个抗原决定簇活性；诱导后的菌体细胞涂片荧光显微镜观察可见细胞发射绿色荧光。
质粒pS65TP-He转入大肠杆菌，IPTG诱导，常规破碎离心，取上清液过Ni-NTA层析柱，再洗脱并用PBS透析，SDS-PAGE和ELISA检测蛋白质，在52KD处可见GFP-HBeAg融合蛋白，在荧光显微镜下可见荧光，并可用目测法来检测血清中的HBV抗体。
本发明构建的载体在大肠杆菌中表达了GFPWt或GFPS65T与人肝炎病毒基因的融合蛋白，既有抗原性，又能发射荧光。所构建质粒pGC-220表达的蛋白质仍具有HCV-Core抗原的三个免疫活性部位和发射荧光特性，提高了检测的灵敏度；质粒pS65TH-He表达的蛋白质同样具有HBeAg的抗原性，并保持了GFP的荧光特性，用GFP标记抗原灵敏度提高，用GFP作标记物的直接、特异的抗原抗体反应可以避免由于二抗、类风湿因子等的干扰所带来的非特异性，并避免了传统标记物技术中需要的分离，纯化，化学计算等过程。
以下所述实施例详细说明了本发明。
实施例1.用EcoRI单酶消化含GFP基因的pGFP10.1质粒，回收1kb的GFPcDNA片段，在702bp处用Pvu II再次酶切，回收0.7kb的大片段，去掉GFP cDNA3’末端编码12个氨基酸的序列及非编码区，保留GFP的生色基团编码区(217-226pb)及绝大部分编码区，将此0.7kb的GFP EcoR I-Pvu II大片段克隆到pGEM3zf(-)DNA的EcoR I-Sma I位点，得到pG-1质粒，再从pG-1质粒上回收0.7kb的GFP EcoR I-BamH I片段，从含有HCV Core区基因NC质粒上回收HCV Core基因的BamH I-Hind III片段，两个片段再与经EcoR I-Hind III双酶消化的pGEM3zf(-)连接，构建成带有共同编码框的GFP-Core嵌合基因的克隆载体pGC-2。用EcoR I-Pst I双酶消化pGC-2质粒，回收1.21kb的GFP-Core嵌合基因，定向插入到表达质粒pBV220的双启动子PRPL下游MCS(载体的多克隆位点)的EcoR I-Pst I位点处，使GFP-Core融合基因处于PRPL双启动子控制之下，将pGC-220表达载体转化大肠杆菌DH5a菌株，热诱导5hr，收集菌体直接溶于Laenmli样品缓冲液中，取液进行12％SDS-PAGE，用考马斯亮蓝染色，可见GFP-Core融合蛋白表达带，Western blot和Dot-ELISA结果表明，此蛋白可与人的阳性血清和免疫兔血清HCV-1，HCV-2，HCV-3起反应，GFP与Core蛋白的融合不影响Core蛋白的抗原性。
实施例2.将突变型GFP S65T基因的BamH I处于T7启动子控制之下，形成载体pS65T，用Pvu II消化pS65T DNA，从GFP基因3’末端切去12个氨基酸的编码区，回收大片段自我连接成环后转入大肠杆菌BL21；用酶切鉴定法筛选阳性重组体pS65TP，用Hind III完全消化pS65TP DNA，再加EcoR I部分消化，回收保留有GFP基因的Hind III-EcoR I大片段，用EcoR I、Hind III双酶消化质粒pGHe DNA，回收0.45Kb的HBV e基因小片段，用T4DNA连接酶将这两个片段连接，用酶切法筛选得GFP-HBeAg融合蛋白表达载体pS65TP-He。质粒pS65TP-He转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，IPTG诱导5hr，常规破碎离心，取上清液过Ni-NTA层析柱，再洗脱并用PBS透析，SDS-PAGE和ELISA检测蛋白质，在52KD处可见GFP-HBeAg融合蛋白，在荧光显微镜下可见荧光。并可用目测法来检测血清中的HBV抗体。