一种谷氨酰胺发酵生产工艺 本发明属于氨基酸发酵领域，具体地说涉及一种谷氨酰胺发酵生产工艺。
营养学和医学上的新发现逐渐纠正了人们对于谷氨酰胺的认识，谷氨酰胺现在已被作为一种条件必需性氨基酸看待，谷氨酰胺的产业化将会有极大的经济效益和社会效益。尽管国内外有一些研究小组对其产生作了许多研究工作(微生物学通报，4(5):211-212(1984)；16(2):73-76(1989)；微生物学杂志，6(3):35-37(1986)；工业微生物，21(5):11-17(1988)；食品与发酵工业，No.2:21-25(1992)；发酵科技通讯，19(2):16-18(1990)；Agri.Biol.Chem.，51(8):2089-2094(1987)，日本特许公报昭62-186796；昭63-21379)，但绝大多数研究集中于菌种选育和摇瓶发酵的培养基配方与发酵条件优化，而对规模生产至关重要的发酵罐水平上的工艺优化则没有文献或专利发表，其结果是摇瓶发酵水平在发酵罐规模上不能重现，菌种潜力难以发挥。
本发明针对上述不足，提出一整套优化的谷氨酰胺发酵生产工艺，给出影响谷氨酰胺产生的种种因素的控制方法，从而在发酵罐规模上进一步重现和提高摇瓶发酵的结果，充分发挥菌种潜力。
本发明的发酵生产工艺包括如下顺序的步骤：
(1)发酵菌株的选择：黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)之一。
(2)母斜面制备：将上述发酵菌株接种斜面，29-37℃恒温培养8-20小时，制得母斜面，母斜面冷藏待用。
(3)子斜面：将步骤(2)得到的母斜面接种子斜面，培养方法同步骤(2)。
(4)一级种子培养：将步骤(3)得到的斜面菌苔接种于已灭菌的装有种子培养基的摇瓶中，在29-37℃下摇床培养8-20小时。
(5)二级种子培养：将步骤(4)培养好的一级种子按2％-10％(体积比)接种于已灭菌的装有种子培养基的种子罐开始培养；培养条件：通气量0.5-1.5VVM，罐压0.01-0.05Mpa，温度29-37℃，溶解氧3％-80％饱和度；培养时间6-18小时。
(6)发酵罐发酵：将步骤(5)培养好的种子按2％-10％(体积比)接种于已灭菌的装有发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制条件为：温度29-37℃，通气量0.5-1.5VVM，罐压0.01-0.05MPa，溶解氧0.5％-90％饱和度，pH6.5-7.5，并以消泡剂消泡；发酵8-24小时，补入发酵初始培养基0.5-1.5％(重量体积比)的氯化钾；发酵14-26小时，停止pH控制，使pH自然降低至6.2-6.6，之后控制pH在此范围内，溶解氧在20-80％饱和度之间，并连续流加30-80％(重量体积比)的糖溶液，或者将糖溶液按每次每升发酵液10-30克糖分批补入，控制发酵罐中糖浓度在5-40g/L之间；补加氯化钾之后，每间隔8-24小时补入发酵液总体积0.05％-0.3％(体积比)地玉米浆；发酵50-68小时停止补糖，待糖浓度降低至1-10g/L时发酵结束。
在上述发酵生产工艺过程中，步骤(1)中的黄色短杆菌是黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、AS 1.495、AS 1.582和它们的突变株之一，谷氨酸棒杆菌是指谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13286、ATCC 14751、ATCC 14752、ATCC 13032、AS 1.805、ACCC11067、ACCC 11063、IFFI 10056、IFFI 10054、IFFI 10131、IFFI 10039、IFFI10031、IFFI 10051、IFFI 10052、IFFI 10111和它们的突变株之一，北京棒杆菌是指北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)AS 1.299和其突变株之一，钝齿棒杆菌是指钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS 1.452和其突变株之一。
步骤(2)中保存菌株的时间以不超过一个月为佳。
步骤(6)中溶解氧的控制通过调整搅拌转速、通气量、罐压实现。
步骤(6)中pH通过补入浓度为10％-30％(重量体积比)的氨水调节。
步骤(6)中消泡剂是聚醚类或硅酮类消泡剂之一。
步骤(6)中玉米浆是浓玉米浆或稀玉米浆，浓玉米浆干物质含量为50％-90％(重量比)，稀玉米浆干物质含量为5％-50％(重量比)。
步骤(6)中稀玉米浆的补入量以发酵液总体积的0.10％-0.30％(体积比)更佳；浓玉米浆补入量以发酵液总体积的0.05％-0.15％(体积比)更佳。
步骤(6)中糖溶液是指葡萄糖、淀粉水解糖之一。
发酵罐上采用上述工艺后，发酵水平大大高于摇瓶发酵结果，菌种潜力得到充分发挥，其工艺为大规模生产谷氨酰胺提供了依据。下表展示了摇瓶发酵实验与50升发酵罐发酵实验的效果对比。
表：摇瓶发酵与发酵罐发酵72小时产谷氨酰胺浓度对比(单位：g/L)菌株名称黄色短杆菌ATCC 14067谷氨酸棒杆菌ATCC 14751谷氨酸棒杆菌ATCC 14752北京棒杆菌AS 1.299钝齿棒杆菌AS 1.452 A摇瓶 22.4 13.5 16.2 8.4 11.5 B发酵罐 56 45 35.7 22.2 31.6B比A增高 150.0％ 233.3％ 120.4％ 164.3％ 174.8％
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
使用的培养基包括斜面培养基(葡萄糖0.1，牛肉膏1.0，蛋白胨1.0,NaCl0.5，琼脂2.0)、摇瓶种子培养基(葡萄糖2.0,(NH4)2SO4 1.0,KH2PO4 0.1,K2HPO4·3H2O 0.3,MgSO4·7H2O 0.01，尿素0.2，玉米浆0.1)、发酵培养基(葡萄糖10.0,NH4Cl 4.0,KH2PO4 0.025，脲0.5,K2HPO4·3H2O 0.025,MgSO4·7H2O 0.05，玉米浆液1.0，生物素5μg/L，维生素B1 20μg/L,ZnSO4 5mg/L,FeSO4 5mg/L)，以上未说明单位的成分均为重量体积百分比。
将黄色短杆菌ATCC14067菌株于31℃下恒温培养10小时后制得母斜面，放置于4℃冰箱中保存15天。从母斜面转接子斜面，于31℃培养10小时后，分别接一环培养物于两只已灭菌的各装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，31℃往复式摇床培养，往复频率110次，振幅5.8厘米。培养15小时后，按5％体积比接种于已灭菌的装有2升种子培养基的二级种子罐并开始培养，培养过程中通气量1.0VVM，罐压0.03-0.035Mpa，温度31℃，调节搅拌转速控制溶解氧在30％-50％之间。培养时间13小时后，将此培养液按5％的体积比接种于已灭菌的装有40升发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制发酵温度31℃，通气量1.0VVM，罐压0.035-0.040MPa，以25％重量体积比氨水控制pH6.9-7.1，以聚氧乙烯氧丙烯甘油(又称泡敌)消泡剂消泡，并通过调整搅拌转速控制溶解氧处于20％-30％饱和度之间；发酵13小时，一次性补入已灭菌的浓度为30％(重量体积比)的氯化钾溶液1.35升；发酵18小时，停止补入氨水，使pH自然降低至6.40，之后继续以25％氨水控制pH在6.35-6.45范围内，溶解氧在35-50％饱和度之间，并连续流加70％重量体积比的葡萄糖溶液，控制发酵罐中糖浓度在10-15g/L之间。在发酵至34小时和50小时，分别补入已灭菌的浓玉米浆40ml。发酵64小时停止补糖，72小时结束发酵，此时，培养基中残糖浓度2g/L,L-谷氨酰胺浓度56g/L。
实施例2
所用各种培养基配方同实施例1。
将谷氨酸棒杆菌ATCC13286菌株于29℃下恒温培养20小时后制得母斜面，放置于4℃冰箱中保存3天。从母斜面转接子斜面，于29℃培养20小时后，分别接一环培养物于两只已灭菌的各装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，29℃摇床培养，往复频率110次，振幅5.8厘米，培养20小时后，按2％体积比接种于已灭菌的装有2升种子培养基的二级种子罐并开始培养，培养过程中通气量1.5VVM，罐压0.01-0.03Mpa，温度29℃，调节搅拌转速控制溶解氧在40％-90％饱和度之间。培养时间18小时后，将此培养液按2％的体积比接种于已灭菌的装有40升发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制发酵温度29℃，通气量1.5VVM，罐压0.01-0.03MPa，以29％重量体积比氨水控制pH7.2-7.5，以泡敌消泡剂消泡，并通过调整搅拌转速控制溶解氧处于30％-80％饱和度之间；发酵24小时，一次性补入已灭菌的浓度为20％(重量体积比)的氯化钾溶液3.0升；发酵26小时，停止补入氨水，使pH自然降低至6.45，之后继续以29％氨水控制pH在6.5-6.6范围内，溶解氧在40-80％饱和度之间，并连续流加80％重量体积比的葡萄糖溶液，控制发酵罐中糖浓度在24-40g/L之间。在发酵至32小时、42小时、54小时，分别补入已灭菌的稀玉米浆40ml。发酵68小时停止补糖，80小时结束发酵，此时，培养基中残糖浓度1g/L,L-谷氨酰胺浓度42g/L。
实施例3
所用各种培养基配方同实施例1。
将北京棒杆菌AS 1.299菌株于37℃下恒温培养8小时后制得母斜面，放置于4℃冰箱中保存30天。从母斜面转接子斜面，于37℃培养8小时后，分别接一环培养物于两只已灭菌的各装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，37℃摇床培养，往复频率110次，振幅5.8厘米，培养8小时后，按10％体积比接种于已灭菌的装有2升种子培养基的二级种子罐并开始培养，培养过程中通气量0.5VVM，罐压0.04-0.05Mpa，温度37℃，调节搅拌转速控制溶解氧在3％-40％之间。培养时间8小时后，将此培养液按10％的体积比接种于已灭菌的装有40升发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制发酵温度34℃，通气量0.5VVM，罐压0.04-0.05MPa，以10％氨水(重量体积比)控制pH6.5-6.9，以硅酮消泡乳剂消泡，并通过调整搅拌转速控制溶解氧处于0.5％-40％饱和度之间；发酵8小时，一次性补入已灭菌的浓度为30％(重量体积比)的氯化钾溶液0.66升；发酵14小时，停止补入氨水，使pH自然降低至6.2，之后继续以10％(重量体积比)氨水控制pH在6.2-6.3范围内，溶解氧在20-40％饱和度之间，并将已灭菌的浓度为40％(重量体积比)的淀粉液化糖溶液按每次2升分批补入，于发酵22小时、34小时、50小时各补一次。在发酵至30小时和54小时，分别补入已灭菌的稀玉米浆40ml。64小时结束发酵，此时，培养基中残糖浓度10g/L,L-谷氨酰胺浓度19g/L。