人内皮细胞抑制素基因及其表达产物的生产和应用 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及人内皮细胞抑制素基因、含有该基因的载体以及用该载体转化的菌株及其表达产物的生产和应用。
内皮细胞抑制素(Endostatin)是1997年Folkman实验室从鼠血管内皮细胞瘤(Hemangioendothelioma)细胞中分离的一种蛋白质，是胶原蛋白ⅩⅧ(collagen ⅩⅧ)C端的20KD的片段。与血管生成抑制素一样，它能抑制内皮细胞的增殖和新生血管的形成并抑制小鼠Lewis肺癌、T241纤维肉瘤，EOMA血管内皮细胞瘤，B16F10黑色素瘤的原发瘤和转移瘤的生长。与现有的抗癌药物不同，它的作用机理是通过抑制肿瘤新生血管的形成，切断肿瘤的血液供应和营养供给从而抑制肿瘤的转移和生长。由于正常组织的血管内皮细胞是不再分裂增殖的，不受该药物的影响。因而这种抗癌蛋白具有高度的选择性、特异性和极小的毒副作用。由于通过培养血管内皮细胞瘤细胞提取来源有限，成本高，应用基因工程技术生产重组人内皮细胞抑制素就显得十分必要。
本发明的目地包括：1)提供重组人内皮细胞抑制素基因；2)构建含有该基因的载体特别是表达载体；3)提供由该基因转化的微生物菌株；4)提供由这些转化菌株高效表达、生产重组人内皮细胞抑制素的方法；5)表达产物的应用。
本发明的人内皮细胞抑制素基因是以人胶原蛋白ⅩⅧcDNA为模板，经PCR方法扩增而得到的，它相当于人胶原蛋白ⅩⅧ cDNA3’端从终止密码至其上游(5’端)184个密码子共555bp(包括PCR中加的起始密码ATG)的DNA片段，该基因的基本特征如下：
a．序列特征：
长度：555bp
类型：核酸
链数：双链
b．分子类型：DNA
c．来源：克隆自人胶原蛋白ⅩⅧcDNA为模板的PCR产物
d．DNA序列及其编码的氨基酸序列如序列表1(SEQ ID No:1)。
本发明所用作PCR模板的人胶原蛋白ⅩⅧcDNA的DNA序列已在以下文献中公开：
Suk P.Oh et al,Cloning of cDNA and genomic DNA encoding human Type ⅩⅧ collagenand localization of the α1(ⅩⅧ)collagen gene to mouse chromosome 10 and humanchromosome 21,Genomics,(1994)19:494-499。
本发明还构建了含有上述人内皮细胞抑制素基因的载体，特别是含有该基因的大肠杆菌表达载体以及枯草杆菌、毕节酵母、假丝酵母和汉生酵母的表达载体。这些载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的人内皮细胞抑制素基因经酶切后接入相应载体的相应酶切位点之间，生成含人内皮细胞抑制素基因的表达载体。
上述含人内皮细胞抑制素基因的大肠杆菌表达载体优选由本发明合成的人内皮细胞抑制素基因与大肠杆菌表达载体pBV220构建成的重组表达载体，命名为pBVE20。其构建过程如图1所示。
本发明还用上述含有人内皮细胞抑制素基因的相应表达载体分别构建了能高效表达人内皮细胞抑制素的大肠杆菌重组株以及枯草杆菌、毕节酵母、假丝酵母和汉生酵母重组株。
本发明还提供了利用上述大肠杆菌重组株生产人内皮细胞抑制素的方法，该方法是将菌株进行培养发酵并经热诱导使其高效表达人内皮细胞抑制素重组蛋白，再收集菌体，经分离纯化得到重组人内皮细胞抑制素产品。
本发明的上述能表达人内皮细胞抑制素的大肠杆菌重组菌株优选由含有人内皮细胞抑制素基因的表达载体pBVE20转化大肠杆菌DH5α而得到的菌株，命名为Escherichia coliDH5α(pBVE20)，简称E.coli DH5α(pBVE20)。
利用该大肠杆菌重组菌株E.coli DH5α(pBVE20)生产人内皮细胞抑制素的具体方法为：
(1)菌种的培养发酵：将菌种接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中28～30℃,150～200转/分培养过夜，次日转种于相同的培养基中，28～30℃,200～250转/分培养1～4h，升温至42℃继续振摇培养3～4h后收菌；
(2)表达产物的纯化：收集上述培养的菌体，将细胞破碎后离心收集包涵体沉淀，用含Triton X-100和2M尿素的STE溶液反复洗涤沉淀，然后将沉淀溶于8M尿素中，复性并经Heparin-Sepharose亲和层析，经冻干即为纯化的人内皮细胞抑制素。
上述方法中的菌种培养发酵步骤可采用15升发酵罐进行高密度发酵，以提高生产效率和产量。
上述方法制得的重组人内皮细胞抑制素在小鼠实验中表现出对肿瘤生长和转移的强抑制作用，可作为有效成份用于制备新一代的抗癌药物。
本发明的大肠杆菌重组菌株E.coli DH5α(pBVE20)已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏编号：CCTCC M99003，保藏日：1999年2月8日。
由该E.coli DH5α(pBVE20)菌株可扩增、提取得到本发明的重组表达载体pBVE20及人内皮细胞抑制素基因。方法是：
(1)取E.coli DH5α(pBVE20)单菌落接种于LB培养基中，30℃培养过夜，离心收集菌体，用常规的碱裂解法提取质粒pBVE20。
(2)用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶解质粒pBVE20产生两条带，分离提取约560bp的小带即为人内皮细胞抑制素基因。
用上述方法得到的人内皮细胞抑制素基因与适当的载体连接，即可构建出所需的含人内皮细胞抑制素基因的载体。用所构建的表达载体即可转化并构建出相应的能表达重组人内皮细胞抑制素的重组菌株。
本发明的人内皮细胞抑制素基因通过与适当的表达载体连接后可在相应的微生物菌株中高效表达，经分离纯化即可获得高纯度的重组人内皮细胞抑制素。所以，通过本发明可方便地大量生产重组人内皮细胞抑制素，而且成本较低。这将为获得来源稳定、成本便宜的重组人内皮细胞抑制素并用其制备高疗效低毒副作用的新一代抗癌药物提供一条切实可行的途径。
以下通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
图1是重组表达载体pBVE20的构建过程示意图，其中，PR、PL为噬菌体启动子，T1、T2为rmB的转录终止序列。
图2是重组人内皮细胞抑制素基因表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳图谱。其中，1是标准分子量对照，2是未经诱导的DH5α(pBVE20)菌体，3是42℃诱导的含空载体的DH5α(pBV220)菌体，4是42℃诱导表达的DH5α(pBVE20)菌体，N为表达蛋白。
图3是重组人内皮细胞抑制素基因表达产物对小鼠黑色素瘤的抑制作用，其中，A是对照组小鼠，B是试验组小鼠。
实施例1人内皮细胞抑制素基因的合成
根据已发表的人胶原蛋白ⅩⅧcDNA序列，设计合成两段引物：
5’端引物是CCGAATTCATGCACAGCCACCGCGACTTCCA
3’端引物是CCGGATCCGCGGCCGCTACTTGGAAGGCAGTCATGAAGC5’端引物在20个同源碱基前加EcoRⅠ限制酶切位点及起始密码ATG,3’端引物除20个同源碱基外另加NotⅠ及BamHⅠ限制酶切位点。以人胶原蛋白ⅩⅧcDNA为模版，经PCR扩增合成约0.6kb的内皮细胞抑制素基因，反应条件为：第一循环：94℃变性4分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；以后各循环：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共25个循环。将扩增产物克隆到载体pSP72的EcoRⅠ与BamHⅠ之间获得重组质粒pSPE2，进行DNA序列测定，结果如序列表1。该序列与预期的人内皮细胞抑制素基因序列是一致的，表明PCR产物是人内皮细胞抑制素基因。
实施例2含人内皮细胞抑制素的大肠杆菌质粒pBVE20的构建
用限制酶EcoRⅠ与BamHⅠ将人内皮细胞抑制素基因从质粒pSPE2上切下，分离后与经EcoRⅠ及BamHⅠ酶切的载体pBV220连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切鉴定后证明人内皮细胞抑制素基因已克隆至pBV220中，将重组质粒命名为pBVE20。构建过程见图1。
实施例3能高效表达人内皮细胞抑制素的大肠杆菌重组株E.coli DH5α(pBVE20)的构建
用CaCl2法将pBVE20转化E.coli DH5α，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含pBVE20的重组转化子E.coli DH5α(pBVE20)。
实施例4含人内皮细胞抑制素基因的假丝酵母表达载体pUAKE5的构建
用EcoRⅠ,NotⅠ将人内皮细胞抑制素基因从质粒pBVE20上切下，分离纯化后与经EcoRⅠ,NotⅠ酶切后的pUAK8混合，用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，以标准方法提取质粒，用限制酶EcoRⅠ,NotⅠ酶切重组质粒，得到两个片段，其大小分别与pUAK8及人内皮细胞抑制素基因相同，证明人内皮细胞抑制素基因已克隆至pUAK8中，将重组质粒命名为pUAKE5。
实施例5能高效表达人内皮细胞抑制素基因的假丝酵母重组菌株Candida boidinii(pUAKE5)的构建
用LiCl转化法将pUAKE5引入波氏假丝酵母，用含不同浓度的G418的培养基筛选多拷贝整合的重组菌株，检测其表达人内皮细胞抑制素的水平，获得能高效表达人内皮细胞抑制素的的重组菌株Candida boidinii(pUAKE5)。
实施例6含内皮细胞抑制素基因的枯草杆菌工程菌DB1342(pURTQE4)的构建。
用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切质粒pBVE20，电泳分离含人内皮细胞抑制素基因的小片段，接到枯草芽孢杆菌质粒pURTQ4的相应位点上，获得含人内皮细胞抑制素基因的表达质粒pURTQE4。然后用感受态转化法将pURTQE4转入枯草杆菌DB1342，即获得枯草杆菌工程菌DB1342(pURTQE4)。
实施例7含内皮细胞抑制素基因的汉生酵母工程菌的构建
将人内皮细胞抑制素基因从质粒pSPE2上切下，重组进大肠杆菌-汉生酵母质粒pUMH32，获得含内皮细胞抑制素基因的重组质粒pUMHE32，然后用电激转化法将其引入汉生酵母Hansenula polymorpha A16，获得汉生酵母工程菌Hansenula polymorpha A16(pUMHE32)。
实施例8含内皮细胞抑制素基因的毕节酵母工程菌的构建
将人内皮细胞抑制素基因从质粒pSPE2上切下，重组进大肠杆菌-毕节酵母质粒pPU5的相应位点，转化大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切鉴定无误后，将重组质粒命名为pPUE5。用LiCl转化法将pPUE5引入毕节酵母Pichia pastoris，获得毕节酵母工程菌Pichia pastoris(pPUE5)。
实施例9利用大肠杆菌基因工程菌E.coli DH5α(pBVE20)生产重组人内皮细胞抑制素。
(1)菌种的培养发酵
挑取大肠杆菌基因工程菌E.coli DH5α(pBVE20)单菌落接种在含100ug/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，30℃,200转/分振荡培养过夜，次日按10％接种量转种于适当体积的相同培养基中，30℃,250转/分振荡培养1小时，待A600约为0.4时转至45℃水浴中摇动5分钟，使之迅速升温至42℃诱导外源基因表达，在42℃条件下继续振荡培养4小时后收菌。
取少量细胞加2×上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准方法走SDS-PAGE凝胶电泳。结果如图2，经诱导的DH5α(pBVE20)在20kd的位置上出现一条新的蛋白带，未诱导的DH5α(pBVE20)及DH5α(pBV220)不出现此带，证明人内皮细胞抑制素已在DH5α(pBVE20)中诱导表达。
(2)表达的重组人内皮细胞抑制素的纯化
收集高效表达重组人内皮细胞抑制素的菌体，经超声波破碎后离心收集包含体沉淀，用含TritonX-100的STE溶液和含2M尿素的STE溶液反复洗涤沉淀，除去细胞碎片，杂蛋白，核酸等杂质，按每10毫克包含体加2毫升含8M尿素的溶解缓冲液中，室温放置1小时即可溶解。缓缓加入10倍体积的复性液复性。复性蛋白经肝素-Sepharose 4B亲和层析和SP-Sepharose离子交换层析纯化，冻干即为重组人内皮细胞抑制素纯品。
实施例10利用假丝酵母重组菌株Candida boidinii(pUAKE5)生产重组人内皮细胞抑制素
(1)菌种的培养发酵
挑取工程菌Candida boidinii(pUAKE5)单菌落接种于MGM(1.34％YNB,1％甘油，4×10-5％生物素)培养基中30℃振荡培养过夜，次日再转接至新鲜的相同培养基中，30℃继续培养，每隔24小时流加甲醇至终浓度为0.5％,120小时后离心收集上清，用液氮速冻后保存备用。
(2)表达的重组人内皮细胞抑制素的纯化
将冰冻的发酵上清液解冻后，用超滤法浓缩，浓缩液上肝素-Sepharose 4B亲和层析和SP-Sepharose离子交换层析纯化。
实施例11重组人内皮细胞抑制素抑(抗)癌试验
C57B16/J小鼠或裸鼠。20±2g，各20只，背部皮下接种B16黑色素瘤或人肺癌/肝癌细胞悬液(5×106个/mL)。接种10天后待瘤体积达100-200mm3时，试验组分别注射5mg/kg/天人内皮细胞抑制素，对照组注射0.3mL PBS，每24小时给药一次。两周后观察小鼠体重及瘤体积/重量的变化，结果如图3。从结果可见，试验组小鼠的瘤体积明显小于对照组，说明重组人内皮细胞抑制素可高效抑制B16黑色素瘤和肺癌等的生长，可用于制备抗肿瘤药物。
序列表1(SEQ ID No:1)ATG CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG CTC CAC CTG GTT GCG CTC 48Met His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala LeuAAC AGC CCC CTG TCA GGC GGC ATG CGG GGC ATC CGC GGG GCC GAC TTC 96Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp PheCAG TGC TTC CAG CAG GCG CGG GCC GTG GGG CTG GCG GGC ACC TTC CGC 144Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe ArgGCC TTC CTG TCC TCG CGC CTG CAG GAC CTG TAC AGC ATC GTG CGC CGT 192Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg ArgGCC GAC CGC GCA GCC GTG CCC ATC GTC AAC CTC AAG GAC GAG CTG CTG 240Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu LeuTTT CCC AGC TGG GAG GCT CTG TTC TCA GGC TCT GAG GGT CCG CTG AAG 288Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu LysCCC GGG GCA CGC ATC TTC TCC TTT GAC GGC AAG GAC GTC CTG AGG CAC 336Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg HisCCC ACC TGG CCC CAG AAG AGC GTG TGG CAT GGC TCG GAC CCC AAC GGG 384Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn GlyCGC AGG CTG ACC GAG AGC TAC TGT GAG ACG TGG CGG ACG GAG GCT CCC 432Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala ProTCG GCC ACG GGC CAG GCC TCC TCG CTG CTG GGG GGC AGG CTC CTG GGG 480Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu GlyCAG AGT GCC GCG AGC TGC CAT CAC GCC TAC ATC GTG CTC TGC ATT GAG 528Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile GluAAC AGC TTC ATG ACT GCC TCC AAG TAG 555Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys stop