从山楂中分离纯化寡聚原花色素生产工艺及用途 一.技术领域
本发明属于生化分离纯化技术领域.二.背景技术：1534年冬法国探险者Jacques Cartier和他的船员得了坏血病，经一种印地安人药物anneda治愈，这是一种松树皮制品，其中含抗坏血酸和原基花色素。
寡聚原花色素的科学研究在20世纪初就开始了，最初发现的是花色素的单体，即无色花色甙，1960年Freudenberg和Weinges提出原花色素(Proanthocyanidin)一词，定义为一类从植物中分离并可经热酸处理能产生花色素的物质。寡聚原花色素最初是从松树皮中分离的，近年来美国、欧州、阿根廷、澳大利亚和新西兰等国家，相继从葡萄籽中分离原花色素，开发成保健品或药品，具有抗氧化、抗衰老的作用，因此很受中老年人的欢迎，产品已有专利保护，国内从葡萄籽和松针中提取的类似物质也已有商品。
关于山楂国外报导很少，只有少量有关山楂粗提液的报导。三.发明内容：
1.发明目的本发明的目的是从山楂果中提取寡聚原花色素，制成片剂、胶囊、咀嚼片、口服液等，作为中老年人抗衰老，降血脂的保健食品。原料可提供日用化工、作为抗皱化妆品的重要成分。山楂的滤渣仍可做成食品，综合利用。
2.发明技术方案：已知山楂中含有丰富的寡聚原花色素(Oligmeric Proanthocyanidins，OPC)。OPC是原花色素的2-6聚体，它是化学结构相似的许多单体原花色素聚合组成的混合物，原花色素地种类很多，有十几种，山楂中分离的原花色素主要是原花青定和原翠雀定单元，这些单体原花色素又称无色花色素(Leucoanthocyanidins)，属于黄烷-3，4二醇，黄烷4-醇及培托盖酚黄烷(Peltogynol flavan)等结构，原花青定二聚体从B-1到B-8为单连链型，是由(+)-儿茶素基及(-)-表儿茶素基间以4-8或4-6位C-C键连接构成的。
寡聚原花色素物质是中草药有效成分之一，它是一种强抗氧化剂，其抗氧化作用是Vc的20倍，VE的50倍，有收敛、消炎、收缩微血管和抗菌等多种药理作用。本发明技术方案：山楂洗净捣碎80℃热水淬取，上大孔树脂柱，洗去多糖，寡聚原花色素可用60％乙醇洗脱，再经过SephadexLH-20凝胶柱，重纯化，纯度可达95％以上。
3.发明效果：
寡聚原花色素有下列诸方面功能：
1).清除机体内的自由基：寡聚原花色素是一种强有力的自由基捕获剂，可以清除体内过多的自由基，治疗因自由基引起的疾病，如炎症、心血管病、血循环障碍、关节炎、循环疾病、神经疾病和许多与衰老有关的疾病，具有预防和改善的作用。对自由基所导致的脑和脊髓神经的损伤起保护作用，有益于帕金森氏综合症、早老性痴呆症的预防和治疗。
2).抑制基因突变：抑制基因的自发突变和减少癌变。
3).降低组胺水平、保护血管透性、预防和修复动脉粥样硬化。
4).调节血管的通透性，降低高血压和某些肾病患者、糖尿病患者毛细血管内的阻力，防止手术后水肿等。
5).维护胶原蛋白的结构：寡聚原花色素能与胶原蛋白结合，抑制胶原蛋白酶对胶原蛋白的降解，参与胶原纤维的交联，增加肌肉肌腱韧带的弹性和柔性，称为皮肤维生素，可保持皮肤弹性和光滑，推迟或减少皱纹的出现，具有明显的抗衰老作用。
由于寡聚原花色素的上述多种功能，故国内外对它的研究也越来越多，国外主要从葡萄籽和松树皮中提取纯化，已有商品上市，作为保健品深受中老年人的欢迎，国内有从葡萄籽和松树皮中提取的类似产品上市，考虑到国内有大量的山楂积压，用作为食品销路有限，经检测山楂中含有丰富的寡聚原花色素。本发明就是从山楂果中通过热淬取，凝胶层析，溶剂洗脱等步骤得到纯度90％以上的寡聚原花色素。并证明山楂寡聚原花色素有很强的抗氧化作用和对上皮细胞的氧化损伤有保护的作用、安全、无毒付作用，可作为中老年人抗衰老的保健食品。
本发明取葡萄籽的原花色素和维生素C进行了寡聚原花色素抗自由基的生物学功能试验的比较，结果如下：
a.利用Fenton反应产生羟自由基，山楂寡聚原花色素可阻止羟自由基的产生，测定OD420nm表示羟自由基的含量。不同浓度样品对羟自由基的清除率(100％)
样品浓度 0.1mg/ml 0.5mg/ml 1.0mg/ml山楂原花色素 40.7±2.0 48.9±2.0 59.8±4.8萄籽原花色素 36.0±4.5 41.7±0.9 48.5±6.9
Vc 8.0±1.6 11.4±1.9 29.1±2.0
b.超氧负离子是一种很强的自由基，可使NADH氧化，以NBT(Nitroblue tetrazoliam)和PMS(Phenazine methosulfate)显色，以OD560nm表示超氧负离子的含量。
不同浓度样品对超氧负离子的清除率(100％)样品浓度 0.1mg/ml 0.5mg/ml 1.0mg/ml山楂原花色素 0 24.7±2.5 90.0±8.5葡萄籽原花色素 0 68.3±4.7 92.2±9.3
Vc 0 20.6±1.9 25.5±4.2
c.采用依赖鸡卵黄脂蛋白的脂质过氧化模型，检查原花色素对卵黄悬液中脂质过氧化的抑制作用，表中为OD532nm的测定数据。不同浓度样品对脂质过氧化物的清除率(100％)
样品浓度 0.1mg/ml 0.25mg/ml 0.5mg/ml山楂原花色素 62.9±3.2 85.7±0.2 91.9±0.6葡萄籽原花色素 61.5±0.5 83.7±0.4 90.5±0.4
Vc 11.6±1.7 33.2±1.3 59.8±1.2
d.过氧化氢对上皮细胞有损伤作用，加入样品后，通过MTT法测定存活细胞量，表示原花色素对细胞的保护作用，下表中为用酶联免疫检测仪测定的吸光度，吸光度高表示细胞存活多。
不同浓度样品对细胞氧化损伤的保护作用对 照 1.496±0.090过氧化氢作用后 0.47±0.021样品浓度浓度 0.1mg/ml 0.5mg/ml 1.0mg/ml山楂原花色素 0.530±0.018** 0.573±0.008** 1.057±0.07**葡萄籽原花色素 0.557±0.027** 0.730±0.036** 0.917±0.116**Vc 0.553±0.015** 0.735±0.044** 0.902±0.069**与对照组比较*P＜0.05； **P＜0.01
综合上述试验结果，山楂寡聚原花色素对抗氧化作用和葡萄籽寡聚原花色素的作用相当，对羟自由基的清除作用略高于葡萄籽寡聚原花色素，而所有项目的测定都远高于Vc。四.具体实施方案：
新鲜山楂1.5Kg，洗净捣碎后加3.5L水80℃热淬取3小时，经绸布过滤后，果肉仍可加工成食品，所得滤液十分粘稠，将此滤液通过大孔树脂柱，由于多糖不被吸附，可用水洗去，穿过液用30％乙醇可沉淀得到山楂多糖，柱上的寡聚原花色素可用60％乙醇洗脱，经减压蒸馏去乙醇后，冻干或喷雾干燥约得12.5g，纯度以可达90％左右，进一步纯化可通过Sephadex LH-20凝胶柱，寡聚原花色素可用60％丙酮将之洗脱，经减压蒸馏浓缩后，喷雾干燥可得棕红色粉末5.9g，纯度可达95％以上。
纯度检查：本方法利用原花色素与盐酸-正丁醇的特征颜色反应通过测定原花色素参比标准反应后的光吸收值，制作标准曲线。配制含有30％盐酸的正丁醇液50ml，备用。分别取原花色素参比标准液1mg/ml 25ul、50ul、75ul、100ul，4mg/ml 50ul，加入1.4ml盐酸-正丁醇溶液，加水使总体积到1.5ml摇匀，于沸水中煮30min，冷却，在波长为525nm比色，绘制标准曲线。OPC样品配成1mg/ml，取0.1ml按同法测定525nm光吸收，对照标准曲线分别计算各组的原花色素含量。