一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210417700.1	申请日：	2012.10.26
公开号：	CN102870682A	公开日：	2013.01.16
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12N 5/00申请公布日:20130116\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A01H 4/00申请日:20121026\|\|\|公开
IPC分类号：	A01H4/00	主分类号：	A01H4/00
申请人：	山东省农业科学院蔬菜研究所
发明人：	刘芳; 杨元军; 王培伦; 马伟清; 董道峰; 陈广侠; 马蕾
地址：	250100 山东省济南市历城区工业北路202号
优先权：
专利代理机构：	济南圣达知识产权代理有限公司 37221	代理人：	李健康
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内容摘要

本发明公开了一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，属于农业生物技术领域。它包括以下组分：硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、烟酸、盐酸吡哆醇、甘氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、激动素、玉米素、吲哚乙酸倍力凝。该培养基用于马铃薯双单倍体茎段再生成苗的诱导和培养，试验效果好，出愈率提高了76%，成苗率高达80.5%。大大增加了马铃薯双单倍体茎段的再生率，为其遗传转化体系的建立奠定了基础；并且这种培养方式采用一步成苗法，降低了污染几率。

权利要求书

权利要求书一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，无机物包括浓度范围在165~2108mg/L的大量元素氮、磷、钾、硫、钙、镁，浓度范围在0.025~38mg/L的微量元素；有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸中的一种或其组合；植物激素包括6‑苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、激动素、玉米素、吲哚乙酸中的一种或其组合。所述的大量元素氮、磷、钾、硫、镁、钙，优选的为氮、磷、钾、硫、镁、钙的硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氯化物。所述的微量元素为碘、硼、锰、锌、钠、铜、铁、钼、钴。一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，包括以下组分：（1）无机物大量元素微量元素（2）有机物（3）植物激素（4）蔗糖 25~35g/L；（5）倍力凝 3.5~4.5g/L。如权利要求1或2所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分：（1）无机物大量元素微量元素（2）有机物（3）植物激素（4）蔗糖 30~35g/L；（5）倍力凝 4~5g/L。如权利要求1～3任一项所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分：（1）无机物大量元素微量元素（2）有机物（3）植物激素（4）蔗糖 30g/L；（5）倍力凝 4g/L。如权利要求1～4任一项所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基制备方法，包括下列步骤：按照配方准确称量各组分，所用试剂为分析纯，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5.8~6.0，分装，121℃灭菌15分钟。如权利要求1～4任一项所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基用于马铃薯双单倍体茎段离体再生植株的方法，操作过程如下：1）将双单倍体组培苗切成茎段，去掉含腋芽部分，接种到该成苗培养基上，2）在培养温度20～24℃,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度65~75%的培养室内培养。

说明书

说明书一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基
技术领域
本发明涉及一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的固体培养基，属于农业生物技术领域。
背景技术
马铃薯普通栽培种为同源四倍体，其单倍体也称为双单倍体。四倍体马铃薯产生双单倍体主要有两种途径：一是利用花药培养人工诱导单雄生殖，二是通过二倍体授粉者诱导孤雌生殖。
马铃薯的普通栽培种属于四倍体，遗传背景异常复杂，而马铃薯双单倍体，基因高度纯和，并且位点间的互作减少，简化了遗传比例，便于我们研究基因序列的功能与分布。尤其是近年来随着马铃薯全基因组测序的完成，我们可以利用双单倍体进行更广泛的遗传研究。纯合双单倍体基因型也是鉴定基因功能的优良载体，理论上，外源基因导入后不会受到等位基因的干扰，呈显性遗传。而基因的转化和功能验证均离不开植株再生，高效的离体再生技术成为影响研究进展的重要环节。但是马铃薯双单倍体的生产力、生活力等非加性作用性状比四倍体弱，所以马铃薯双单倍体的离体再生具有一定的难度。因此，本文研究了双单倍体茎段离体诱导再生植株。
CN201110233008.9公开了一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的固体培养基，包括硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸铁、乙二胺四乙酸二纳、烟酸、盐酸吡哆醇、甘氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、6‑苄氨基腺嘌呤、玉米素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素、倍力凝。该培养基用于马铃薯栽培种茎尖的培养，试验效果好，基本无愈伤组织产生，成苗率高。但是，由于马铃薯双单倍体不同于普通栽培种，其生产力、生活力比较弱；另外为了后续基因转化和功能的验证，本实验选用茎段作为外植体，所以该培养基不适用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株。
发明内容
为了构建马铃薯双单倍体的遗传转化体系，深入研究马铃薯全基因组序列中某些基因的功能，本发明对马铃薯双单倍体的茎段再生体系优化系统进行了研究。
本发明技术方案如下：
一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，无机物包括浓度范围在165~2108mg/L的大量元素氮、磷、钾、硫、钙、镁，浓度范围在0.025~38mg/L的微量元素；有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸中的一种或其组合；植物激素包括6‑苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、激动素、玉米素、吲哚乙酸中的一种或其组合。
所述的大量元素氮、磷、钾、硫、镁、钙，优选的为氮、磷、钾、硫、镁、钙的硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氯化物。所述的微量元素为碘、硼、锰、锌、钠、铜、铁、钼、钴。
一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，包括以下组分：
（1）无机物
大量元素

微量元素

（2）有机物

（3）植物激素

（4）蔗糖    25~35g/L；
（5）倍力凝  3.5~4.5g/L。
优选的，该种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分：
（1）无机物
大量元素

微量元素

（2）有机物

（3）植物激素

（4）蔗糖    30~35g/L；
（5）倍力凝  4~5g/L。
本发明进一步技术方案：
该种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分：
（1）无机物
大量元素

微量元素

（2）有机物

（3）植物激素

（4）蔗糖     30g/L；
（5）倍力凝   4g/L。
配制方法：按照配方准确称量各组分，所用试剂为分析纯，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5.8~6.0，分装，121℃灭菌15分钟。
本发明还提供所述培养基用于马铃薯双单倍体茎段离体再生植株的方法，具体操作过程如下：将双单倍体组培苗切成茎段，去掉含腋芽部分，接种到该成苗培养基上，在培养温度22±2℃,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度65~75%的培养室内培养。
本发明将大量元素里的铵态氮和硝态氮、钾离子的水平进行了调节，并增加了四种有机添加物，主要是调节了激素种类和水平，由于选用的培养基各种因素的综合作用，应用该培养基，茎段先脱分化成愈伤，后分化再生成苗，成苗率极高。（见表1、图1、图2），解决了长期困扰马铃薯双单倍体茎段再生率低的关键技术难题，为马铃薯双单倍体基因转化体系的顺利进行奠定了基础。
附图说明
图1CN201110233008.9中的培养基茎段再生成苗；
图2培养基改良后茎段再生成苗（实施例3）。
具体实施方式
实施例1
一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基：
（1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；
（2）有机物：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6‑苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.01mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸2mg/L，玉米素4mg/L；
（4）蔗糖    30g/L；
（5）倍力凝  4g/L。
配制方法：按照配方准确称量各组分，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5.8~6.0，分装，121℃灭菌15分钟。
还可以先将无机物、有机物和植物激素配成母液，再按照配方准确称量其余组分，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5.8~6.0，分装，灭菌。
实施例2
一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基：
（1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾175mg/L，硫酸镁360mg/L，氯化钙430mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；
（2）有机物：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸1mg/L；
（3）植物激素：6‑苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.05mg/L，吲哚乙酸0.5mg/L，玉米素4mg/L；
（4）蔗糖    30g/L；
（5）倍力凝  4g/L。
配置方法：同实施例1。
实施例3
一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基：
（1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；
（2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6‑苄氨基腺嘌呤3mg/L，激动素1mg/L，吲哚乙酸2mg/L，玉米素1mg/，萘乙酸0.4mg/L；
（4）蔗糖    30g/L；
（5）倍力凝  4g/L。
配置方法：同实施例1。
实施例4
一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基：
（1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁380mg/L，氯化钙450mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.5mg/L，硫酸锰16mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；
（2）有机物：水解酪蛋白200mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6‑苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L，玉米素2mg/L；
（4）蔗糖    35g/L；
（5）倍力凝  4g/L。
配制方法：同实施例1。
实施例5
一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基：
（1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.0mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；
（2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，酵母提取物250mg/L，水解乳蛋白200mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6‑苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.01mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸2mg/L，玉米素4mg/L；
（4）蔗糖      30g/L；
（5）倍力凝    4.5g/L。
配置方法：同实施例1。
实施例6
一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基：
（1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾175mg/L，硫酸镁360mg/L，氯化钙430mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；
（2）有机物：水解酪蛋白300mg/L，酵母提取物500mg/L，水解乳蛋白500mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素 0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6‑苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.05mg/L，吲哚乙酸0.5mg/L，玉米素4mg/L；
（4）蔗糖      25g/L；
（5）倍力凝    4g/L。
配置方法：同实施例1。
实施例7
一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基：
（1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；
（2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，酵母提取物100mg/L，水解乳蛋白100mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6‑苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L，玉米素2mg/L；
（4）蔗糖    30g/L；
（5）倍力凝  4.5g/L。
配置方法：同实施例1。
实施例8
一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基：
（1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁380mg/L，氯化钙450mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.5mg/L，硫酸锰16mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；
（2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，酵母取物250mg/L，水解乳蛋白100mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6‑苄氨基腺嘌呤3mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L，玉米素2mg/L；
（4）蔗糖   35g/L；
（5）倍力凝 4g/L。
配置方法：同实施例1。
实施例9
一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基：
（1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.5mg/L，硫酸锰17.5mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；
（2）有机物：水解酪蛋白200mg/L，酵母提取物100mg/L，水解乳蛋白100mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6‑苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L，玉米素2mg/L；
（4）蔗糖    30g/L；
（5）倍力凝  4g/L。
对比例：采用CN201110233008.9公布的配方进行茎段离体再生植株
培养基配方：
（1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二纳37.3mg/L；
（2）有机物：谷氨酰胺250mg/L，水解酪蛋白100mg/L，酵母提取物250mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素：6‑苄氨基腺嘌呤0.2mg/L，吲哚丁酸0.05mg/L，赤霉素0.1mg/L；
（4）蔗糖    30g/L；
（5）倍力凝  4g/L。
实施例和对比例的试验结果见表1.
表1马铃薯双单倍体茎段离体再生植株培养基改良前后成苗率情况比较

注：成苗率为成苗的株数占总接种茎尖数的百分比。
由图1可以看出，本发明的培养基配方对于马铃薯双单倍体茎段离体再生植株具有良好的作用。从表1可以看出，，所有实施例的效果都优于对比例，本发明的优选范围（实施例3、实施例8）更具有突出的效果，成苗率在70%以上。

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1、(10)申请公布号 CN 102870682 A (43)申请公布日 2013.01.16 C N 1 0 2 8 7 0 6 8 2 A *CN102870682A* (21)申请号 201210417700.1 (22)申请日 2012.10.26 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人山东省农业科学院蔬菜研究所地址 250100 山东省济南市历城区工业北路 202号 (72)发明人刘芳杨元军王培伦马伟清董道峰陈广侠马蕾 (74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司 37221 代理人李健康 (54) 发明名称一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株。

2、的培养基 (57) 摘要本发明公开了一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，属于农业生物技术领域。它包括以下组分：硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、烟酸、盐酸吡哆醇、甘氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、激动素、玉米素、吲哚乙酸倍力凝。该培养基用于马铃薯双单倍体茎段再生成苗的诱导和培养，试验效果好，出愈率提高了76%，成苗率高达80.5%。大大增加了马铃薯双单倍体茎段的再生率，为其遗传转化体系的建立奠定了基础；并且这种培养方式采用。

3、一步成苗法，降低了污染几率。 (51)Int.Cl. 权利要求书5页说明书12页附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 5 页说明书 12 页附图 2 页 1/5页 2 1.一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，无机物包括浓度范围在1652108mg/L的大量元素氮、磷、钾、硫、钙、镁，浓度范围在0.02538mg/L的微量元素；有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸中的一种或其组合；植物激素包括 6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、激动。

4、素、玉米素、吲哚乙酸中的一种或其组合。所述的大量元素氮、磷、钾、硫、镁、钙，优选的为氮、磷、钾、硫、镁、钙的硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氯化物。所述的微量元素为碘、硼、锰、锌、钠、铜、铁、钼、钴。 2.一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，包括以下组分：（1）无机物大量元素微量元素（2）有机物权利要求书CN 102870682 A 2/5页 3 （3）植物激素（4）蔗糖 2535g/L；（5）倍力凝 3.54.5g/L。 3.如权利要求1或2所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无。

5、机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分：（1）无机物大量元素微量元素权利要求书CN 102870682 A 3/5页 4 （2）有机物（3）植物激素权利要求书CN 102870682 A 4/5页 5 （4）蔗糖 3035g/L；（5）倍力凝 45g/L。 4.如权利要求13任一项所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分：（1）无机物大量元素微量元素（2）有机物权利要求书CN 102870682 A 5/5页 6 （3）植物激素（4）蔗糖 3。

6、0g/L；（5）倍力凝 4g/L。 5.如权利要求14任一项所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基制备方法，包括下列步骤：按照配方准确称量各组分，所用试剂为分析纯，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5.86.0，分装，121灭菌15分钟。 6.如权利要求14任一项所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基用于马铃薯双单倍体茎段离体再生植株的方法，操作过程如下： 1）将双单倍体组培苗切成茎段，去掉含腋芽部分，接种到该成苗培养基上， 2）在培养温度2024,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度6575%的培养室内培养。权利要求书CN 1028。

7、70682 A 1/12页 7 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基技术领域 0001 本发明涉及一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的固体培养基，属于农业生物技术领域。背景技术 0002 马铃薯普通栽培种为同源四倍体，其单倍体也称为双单倍体。四倍体马铃薯产生双单倍体主要有两种途径：一是利用花药培养人工诱导单雄生殖，二是通过二倍体授粉者诱导孤雌生殖。 0003 马铃薯的普通栽培种属于四倍体，遗传背景异常复杂，而马铃薯双单倍体，基因高度纯和，并且位点间的互作减少，简化了遗传比例，便于我们研究基因序列的功能与分布。尤其是近年来随着马铃薯全基因组测序的完成，我们可以。

8、利用双单倍体进行更广泛的遗传研究。纯合双单倍体基因型也是鉴定基因功能的优良载体，理论上，外源基因导入后不会受到等位基因的干扰，呈显性遗传。而基因的转化和功能验证均离不开植株再生，高效的离体再生技术成为影响研究进展的重要环节。但是马铃薯双单倍体的生产力、生活力等非加性作用性状比四倍体弱，所以马铃薯双单倍体的离体再生具有一定的难度。因此，本文研究了双单倍体茎段离体诱导再生植株。 0004 CN201110233008.9公开了一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的固体培养基，包括硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸铁、乙二胺四。

9、乙酸二纳、烟酸、盐酸吡哆醇、甘氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、6-苄氨基腺嘌呤、玉米素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素、倍力凝。该培养基用于马铃薯栽培种茎尖的培养，试验效果好，基本无愈伤组织产生，成苗率高。但是，由于马铃薯双单倍体不同于普通栽培种，其生产力、生活力比较弱；另外为了后续基因转化和功能的验证，本实验选用茎段作为外植体，所以该培养基不适用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株。发明内容 0005 为了构建马铃薯双单倍体的遗传转化体系，深入研究马铃薯全基因组序列中某些基因的功能，本发明对马铃薯双单倍体的茎段再生体系优化系统进行了研究。 0006 本发明技术方案如。

10、下： 0007 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，无机物包括浓度范围在1652108mg/L的大量元素氮、磷、钾、硫、钙、镁，浓度范围在0.02538mg/L的微量元素；有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸中的一种或其组合；植物激素包括 6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、激动素、玉米素、吲哚乙酸中的一种或其组合。 0008 所述的大量元素氮、磷、钾、硫、镁、钙，优选的为氮、磷、钾、硫、镁、钙的硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氯化物。所述的微量元素为碘、硼、锰、锌、钠、铜、铁、钼、钴。说。

11、明书CN 102870682 A 2/12页 8 0009 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，包括以下组分： 0010 （1）无机物 0011 大量元素 0012 0013 微量元素 0014 0015 （2）有机物 0016 说明书CN 102870682 A 3/12页 9 0017 0018 （3）植物激素 0019 0020 （4）蔗糖 2535g/L； 0021 （5）倍力凝 3.54.5g/L。 0022 优选的，该种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖。

12、、倍力凝；其特征是，包括以下组分： 0023 （1）无机物 0024 大量元素 0025 说明书CN 102870682 A 4/12页 10 0026 微量元素 0027 0028 （2）有机物 0029 说明书CN 102870682 A 10 5/12页 11 0030 （3）植物激素 0031 0032 0033 （4）蔗糖 3035g/L； 0034 （5）倍力凝 45g/L。 0035 本发明进一步技术方案： 0036 该种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分： 0037 （1）无机物 0038。

13、大量元素 0039 说明书CN 102870682 A 11 6/12页 12 0040 微量元素 0041 0042 0043 （2）有机物 0044 说明书CN 102870682 A 12 7/12页 13 0045 （3）植物激素 0046 0047 （4）蔗糖 30g/L； 0048 （5）倍力凝 4g/L。 0049 配制方法：按照配方准确称量各组分，所用试剂为分析纯，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5.86.0，分装，121灭菌15分钟。 0050 本发明还提供所述培养基用于马铃薯双单倍体茎段离体再生植株的方法，具体操作过程如下：将双单倍体组培苗切成茎段，去掉含。

14、腋芽部分，接种到该成苗培养基上，在培养温度222,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度6575%的培养室内培养。 0051 本发明将大量元素里的铵态氮和硝态氮、钾离子的水平进行了调节，并增加了四种有机添加物，主要是调节了激素种类和水平，由于选用的培养基各种因素的综合作用，应用该培养基，茎段先脱分化成愈伤，后分化再生成苗，成苗率极高。（见表1、图1、图2），解决了长期困扰马铃薯双单倍体茎段再生率低的关键技术难题，为马铃薯双单倍体基因转化体系的顺利进行奠定了基础。附图说明 0052 图1CN201110233008.9中的培养基茎段再生成苗； 0053 图2培养基改良后茎段再。

15、生成苗（实施例3）。说明书CN 102870682 A 13 8/12页 14 具体实施方式 0054 实施例1 0055 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0056 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L； 0057 （2）有机物：肌醇100mg/。

16、L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/ L，甘氨酸2mg/L； 0058 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.01mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸 2mg/L，玉米素4mg/L； 0059 （4）蔗糖 30g/L； 0060 （5）倍力凝 4g/L。 0061 配制方法：按照配方准确称量各组分，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至 5.86.0，分装，121灭菌15分钟。 0062 还可以先将无机物、有机物和植物激素配成母液，再按照配方准确称量其余组分，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5.86.0，分装，灭菌。 0063 实施例2 。

17、0064 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0065 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾175mg/L，硫酸镁 360mg/L，氯化钙430mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L； 0066 （2）有机物：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/ L，甘氨酸1mg/L； 0067 （3）植物激。

18、素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.05mg/L，吲哚乙酸0.5mg/L，玉米素4mg/L； 0068 （4）蔗糖 30g/L； 0069 （5）倍力凝 4g/L。 0070 配置方法：同实施例1。 0071 实施例3 0072 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0073 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌 9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg。

19、/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L； 0074 （2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/ L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0075 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤3mg/L，激动素1mg/L，吲哚乙酸2mg/L，玉米素说明书CN 102870682 A 14 9/12页 15 1mg/，萘乙酸0.4mg/L； 0076 （4）蔗糖 30g/L； 0077 （5）倍力凝 4g/L。 0078 配置方法：同实施例1。 0079 实施例4 0080 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱。

20、导再生植株的培养基： 0081 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁 380mg/L，氯化钙450mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.5mg/L，硫酸锰16mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L； 0082 （2）有机物：水解酪蛋白200mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/ L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0083 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤。

21、2mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L，玉米素 2mg/L； 0084 （4）蔗糖 35g/L； 0085 （5）倍力凝 4g/L。 0086 配制方法：同实施例1。 0087 实施例5 0088 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0089 （1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.0mg/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8m。

22、g/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L； 0090 （2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，酵母提取物250mg/L，水解乳蛋白200mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0091 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.01mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸 2mg/L，玉米素4mg/L； 0092 （4）蔗糖 30g/L； 0093 （5）倍力凝 4.5g/L。 0094 配置方法：同实施例1。 0095 实施例6 0096 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 009。

23、7 （1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾175mg/L，硫酸镁 360mg/L，氯化钙430mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L； 0098 （2）有机物：水解酪蛋白300mg/L，酵母提取物500mg/L，水解乳蛋白500mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素 0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0099 （。

24、3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.05mg/L，吲哚乙酸0.5mg/L，玉米说明书CN 102870682 A 15 10/12页 16 素4mg/L； 0100 （4）蔗糖 25g/L； 0101 （5）倍力凝 4g/L。 0102 配置方法：同实施例1。 0103 实施例7 0104 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0105 （1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/ 。

25、L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L； 0106 （2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，酵母提取物100mg/L，水解乳蛋白100mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0107 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L，玉米素 2mg/L； 0108 （4）蔗糖 30g/L； 0109 （5）倍力凝 4.5g/L。 0110 配置方法：同实施例1。 0111。

26、实施例8 0112 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0113 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁 380mg/L，氯化钙450mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.5mg/L，硫酸锰16mg/L，硫酸锌9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L； 0114 （2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，酵母取物250mg/L，水解乳蛋白100mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇。

27、0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0115 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤3mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L，玉米素 2mg/L； 0116 （4）蔗糖 35g/L； 0117 （5）倍力凝 4g/L。 0118 配置方法：同实施例1。 0119 实施例9 0120 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0121 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.5mg/L，硫酸锰17.5mg/L，硫酸锌9.6m。

28、g/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L； 0122 （2）有机物：水解酪蛋白200mg/L，酵母提取物100mg/L，水解乳蛋白100mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0123 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L，玉米说明书CN 102870682 A 16 11/12页 17 素2mg/L； 0124 （4）蔗糖 30g/L； 0125。

29、（5）倍力凝 4g/L。 0126 对比例：采用CN201110233008.9公布的配方进行茎段离体再生植株 0127 培养基配方： 0128 （1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二纳37.3mg/L； 0129 （2）有机物：谷氨酰胺250mg/L，水解酪蛋白100mg/L，酵母提取物25。

30、0mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0130 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L，吲哚丁酸0.05mg/L，赤霉素0.1mg/L； 0131 （4）蔗糖 30g/L； 0132 （5）倍力凝 4g/L。 0133 实施例和对比例的试验结果见表1. 0134 表1马铃薯双单倍体茎段离体再生植株培养基改良前后成苗率情况比较 0135 0136 0137 注：成苗率为成苗的株数占总接种茎尖数的百分比。 0138 由图1可以看出，本发明的培养基配方对于马铃薯双单倍体茎段离体再生植株具有良好的作用。从表1可以看出，所有实施例的效果都优于对比例，本发明的优选范围（实说明书CN 102870682 A 17 12/12页 18 施例3、实施例8）更具有突出的效果，成苗率在70%以上。说明书CN 102870682 A 18 1/2页 19 图1 说明书附图CN 102870682 A 19 2/2页 20 图2 说明书附图CN 102870682 A 20 。

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