一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102870682 A (43)申请公布日 2013.01.16 C N 1 0 2 8 7 0 6 8 2 A *CN102870682A* (21)申请号 201210417700.1 (22)申请日 2012.10.26 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人山东省农业科学院蔬菜研究所 地址 250100 山东省济南市历城区工业北路 202号 (72)发明人刘芳 杨元军 王培伦 马伟清 董道峰 陈广侠 马蕾 (74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人李健康 (54) 发明名称 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生 植株

2、的培养基 (57) 摘要 本发明公开了一种用于马铃薯双单倍体茎段 离体诱导再生植株的培养基，属于农业生物技术 领域。它包括以下组分：硝酸钾、硝酸铵、磷酸二 氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸 锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸亚铁、乙二胺四 乙酸二钠、烟酸、盐酸吡哆醇、甘氨酸、谷氨酰胺、 水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、6-苄氨基腺嘌 呤、萘乙酸、激动素、玉米素、吲哚乙酸倍力凝。该 培养基用于马铃薯双单倍体茎段再生成苗的诱 导和培养，试验效果好，出愈率提高了76%，成苗 率高达80.5%。大大增加了马铃薯双单倍体茎段 的再生率，为其遗传转化体系的建立奠定了基础； 并且这种培养方式采用

3、一步成苗法，降低了污染 几率。 (51)Int.Cl. 权利要求书5页 说明书12页 附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 5 页 说明书 12 页 附图 2 页 1/5页 2 1.一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、 植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，无机物包括浓度范围在1652108mg/L的大量元素氮、 磷、钾、硫、钙、镁，浓度范围在0.02538mg/L的微量元素；有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋 白、酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸中的一种或其组合；植物激素包括 6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、激动

4、素、玉米素、吲哚乙酸中的一种或其组合。 所述的大量元素氮、磷、钾、硫、镁、钙，优选的为氮、磷、钾、硫、镁、钙的硝酸盐、磷酸盐、 硫酸盐、氯化物。所述的微量元素为碘、硼、锰、锌、钠、铜、铁、钼、钴。 2.一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、植 物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，包括以下组分： （1）无机物 大量元素 微量元素 （2）有机物 权 利 要 求 书CN 102870682 A 2/5页 3 （3）植物激素 （4）蔗糖 2535g/L； （5）倍力凝 3.54.5g/L。 3.如权利要求1或2所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包 括无

5、机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分： （1）无机物 大量元素 微量元素 权 利 要 求 书CN 102870682 A 3/5页 4 （2）有机物 （3）植物激素 权 利 要 求 书CN 102870682 A 4/5页 5 （4）蔗糖 3035g/L； （5）倍力凝 45g/L。 4.如权利要求13任一项所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养 基，包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分： （1）无机物 大量元素 微量元素 （2）有机物 权 利 要 求 书CN 102870682 A 5/5页 6 （3）植物激素 （4）蔗糖 3

6、0g/L； （5）倍力凝 4g/L。 5.如权利要求14任一项所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养 基制备方法，包括下列步骤：按照配方准确称量各组分，所用试剂为分析纯，加去离子水充 分溶解，定容，调整pH至5.86.0，分装，121灭菌15分钟。 6.如权利要求14任一项所述的用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养 基用于马铃薯双单倍体茎段离体再生植株的方法，操作过程如下： 1）将双单倍体组培苗切成茎段，去掉含腋芽部分，接种到该成苗培养基上， 2）在培养温度2024,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度6575%的培养 室内培养。 权 利 要 求 书CN 1028

7、70682 A 1/12页 7 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基 技术领域 0001 本发明涉及一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的固体培养基，属于 农业生物技术领域。 背景技术 0002 马铃薯普通栽培种为同源四倍体，其单倍体也称为双单倍体。四倍体马铃薯产生 双单倍体主要有两种途径：一是利用花药培养人工诱导单雄生殖，二是通过二倍体授粉者 诱导孤雌生殖。 0003 马铃薯的普通栽培种属于四倍体，遗传背景异常复杂，而马铃薯双单倍体，基因高 度纯和，并且位点间的互作减少，简化了遗传比例，便于我们研究基因序列的功能与分布。 尤其是近年来随着马铃薯全基因组测序的完成，我们可以

8、利用双单倍体进行更广泛的遗传 研究。纯合双单倍体基因型也是鉴定基因功能的优良载体，理论上，外源基因导入后不会受 到等位基因的干扰，呈显性遗传。而基因的转化和功能验证均离不开植株再生，高效的离体 再生技术成为影响研究进展的重要环节。但是马铃薯双单倍体的生产力、生活力等非加性 作用性状比四倍体弱，所以马铃薯双单倍体的离体再生具有一定的难度。因此，本文研究了 双单倍体茎段离体诱导再生植株。 0004 CN201110233008.9公开了一种用于马铃薯茎尖无愈伤成苗的固体培养基，包括硝 酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、 氯化钴、硫酸铁、乙二胺四

9、乙酸二纳、 烟酸、盐酸吡哆醇、甘氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵 母提取物、蔗糖、6-苄氨基腺嘌呤、玉米素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素、倍力凝。该培养基 用于马铃薯栽培种茎尖的培养，试验效果好，基本无愈伤组织产生，成苗率高。但是，由于马 铃薯双单倍体不同于普通栽培种，其生产力、生活力比较弱；另外为了后续基因转化和功能 的验证，本实验选用茎段作为外植体，所以该培养基不适用于马铃薯双单倍体茎段离体诱 导再生植株。 发明内容 0005 为了构建马铃薯双单倍体的遗传转化体系，深入研究马铃薯全基因组序列中某些 基因的功能，本发明对马铃薯双单倍体的茎段再生体系优化系统进行了研究。 0006 本发明技术方案如

10、下： 0007 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、 植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，无机物包括浓度范围在1652108mg/L的大量元素氮、 磷、钾、硫、钙、镁，浓度范围在0.02538mg/L的微量元素；有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋 白、酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸中的一种或其组合；植物激素包括 6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、激动素、玉米素、吲哚乙酸中的一种或其组合。 0008 所述的大量元素氮、磷、钾、硫、镁、钙，优选的为氮、磷、钾、硫、镁、钙的硝酸盐、磷 酸盐、硫酸盐、氯化物。所述的微量元素为碘、硼、锰、锌、钠、铜、铁、钼、钴。 说

11、 明 书CN 102870682 A 2/12页 8 0009 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、 植物激素、蔗糖和倍力凝；其特征是，包括以下组分： 0010 （1）无机物 0011 大量元素 0012 0013 微量元素 0014 0015 （2）有机物 0016 说 明 书CN 102870682 A 3/12页 9 0017 0018 （3）植物激素 0019 0020 （4）蔗糖 2535g/L； 0021 （5）倍力凝 3.54.5g/L。 0022 优选的，该种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、 有机物、植物激素、蔗糖

12、、倍力凝；其特征是，包括以下组分： 0023 （1）无机物 0024 大量元素 0025 说 明 书CN 102870682 A 4/12页 10 0026 微量元素 0027 0028 （2）有机物 0029 说 明 书CN 102870682 A 10 5/12页 11 0030 （3）植物激素 0031 0032 0033 （4）蔗糖 3035g/L； 0034 （5）倍力凝 45g/L。 0035 本发明进一步技术方案： 0036 该种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基，包括无机物、有机物、 植物激素、蔗糖、倍力凝；其特征是，包括以下组分： 0037 （1）无机物 0038

13、 大量元素 0039 说 明 书CN 102870682 A 11 6/12页 12 0040 微量元素 0041 0042 0043 （2）有机物 0044 说 明 书CN 102870682 A 12 7/12页 13 0045 （3）植物激素 0046 0047 （4）蔗糖 30g/L； 0048 （5）倍力凝 4g/L。 0049 配制方法：按照配方准确称量各组分，所用试剂为分析纯，加去离子水充分溶解， 定容，调整pH至5.86.0，分装，121灭菌15分钟。 0050 本发明还提供所述培养基用于马铃薯双单倍体茎段离体再生植株的方法，具体操 作过程如下：将双单倍体组培苗切成茎段，去掉含

14、腋芽部分，接种到该成苗培养基上，在培 养温度222,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度6575%的培养室内培养。 0051 本发明将大量元素里的铵态氮和硝态氮、钾离子的水平进行了调节，并增加了四 种有机添加物，主要是调节了激素种类和水平，由于选用的培养基各种因素的综合作用，应 用该培养基，茎段先脱分化成愈伤，后分化再生成苗，成苗率极高。（见表1、图1、图2），解决 了长期困扰马铃薯双单倍体茎段再生率低的关键技术难题，为马铃薯双单倍体基因转化体 系的顺利进行奠定了基础。 附图说明 0052 图1CN201110233008.9中的培养基茎段再生成苗； 0053 图2培养基改良后茎段再

15、生成苗（实施例3）。 说 明 书CN 102870682 A 13 8/12页 14 具体实施方式 0054 实施例1 0055 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0056 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙 酸二钠37.3mg/L； 0057 （2）有机物：肌醇100mg/

16、L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/ L，甘氨酸2mg/L； 0058 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.01mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸 2mg/L，玉米素4mg/L； 0059 （4）蔗糖 30g/L； 0060 （5）倍力凝 4g/L。 0061 配制方法：按照配方准确称量各组分，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至 5.86.0，分装，121灭菌15分钟。 0062 还可以先将无机物、有机物和植物激素配成母液，再按照配方准确称量其余组分， 加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5.86.0，分装，灭菌。 0063 实施例2

17、0064 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0065 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾175mg/L，硫酸镁 360mg/L，氯化钙430mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙 酸二钠37.3mg/L； 0066 （2）有机物：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/ L，甘氨酸1mg/L； 0067 （3）植物激

18、素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.05mg/L，吲哚乙酸0.5mg/L，玉米 素4mg/L； 0068 （4）蔗糖 30g/L； 0069 （5）倍力凝 4g/L。 0070 配置方法：同实施例1。 0071 实施例3 0072 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0073 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸 锰16.9mg/L，硫酸锌 9.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg

19、/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二 胺四乙酸二钠37.3mg/L； 0074 （2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/ L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0075 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤3mg/L，激动素1mg/L，吲哚乙酸2mg/L，玉米素 说 明 书CN 102870682 A 14 9/12页 15 1mg/，萘乙酸0.4mg/L； 0076 （4）蔗糖 30g/L； 0077 （5）倍力凝 4g/L。 0078 配置方法：同实施例1。 0079 实施例4 0080 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱

20、导再生植株的培养基： 0081 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁 380mg/L，氯化钙450mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.5mg/L，硫酸锰16mg/L，硫酸锌9.6mg/L， 钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸 二钠37.3mg/L； 0082 （2）有机物：水解酪蛋白200mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/ L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0083 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤

21、2mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L，玉米素 2mg/L； 0084 （4）蔗糖 35g/L； 0085 （5）倍力凝 4g/L。 0086 配制方法：同实施例1。 0087 实施例5 0088 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0089 （1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.0mg/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8m

22、g/L，乙二胺四乙 酸二钠37.3mg/L； 0090 （2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，酵母提取物250mg/L，水解乳蛋白200mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0091 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.01mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸 2mg/L，玉米素4mg/L； 0092 （4）蔗糖 30g/L； 0093 （5）倍力凝 4.5g/L。 0094 配置方法：同实施例1。 0095 实施例6 0096 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 009

23、7 （1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾175mg/L，硫酸镁 360mg/L，氯化钙430mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙 酸二钠37.3mg/L； 0098 （2）有机物：水解酪蛋白300mg/L，酵母提取物500mg/L，水解乳蛋白500mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素 0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0099 （

24、3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.05mg/L，吲哚乙酸0.5mg/L，玉米 说 明 书CN 102870682 A 15 10/12页 16 素4mg/L； 0100 （4）蔗糖 25g/L； 0101 （5）倍力凝 4g/L。 0102 配置方法：同实施例1。 0103 实施例7 0104 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0105 （1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/

25、L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙 酸二钠37.3mg/L； 0106 （2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，酵母提取物100mg/L，水解乳蛋白100mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0107 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L，玉米素 2mg/L； 0108 （4）蔗糖 30g/L； 0109 （5）倍力凝 4.5g/L。 0110 配置方法：同实施例1。 0111

26、 实施例8 0112 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0113 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾165mg/L，硫酸镁 380mg/L，氯化钙450mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.5mg/L，硫酸锰16mg/L，硫酸锌9.6mg/L， 钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸 二钠37.3mg/L； 0114 （2）有机物：水解酪蛋白100mg/L，酵母取物250mg/L，水解乳蛋白100mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇

27、0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0115 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤3mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L，玉米素 2mg/L； 0116 （4）蔗糖 35g/L； 0117 （5）倍力凝 4g/L。 0118 配置方法：同实施例1。 0119 实施例9 0120 一种用于马铃薯双单倍体茎段离体诱导再生植株的培养基： 0121 （1）无机物：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1600mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.5mg/L，硫酸锰17.5mg/L，硫酸锌9.6m

28、g/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙 酸二钠37.3mg/L； 0122 （2）有机物：水解酪蛋白200mg/L，酵母提取物100mg/L，水解乳蛋白100mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0123 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤2mg/L，萘乙酸0.25mg/L，激动素0.5mg/L， 玉米 说 明 书CN 102870682 A 16 11/12页 17 素2mg/L； 0124 （4）蔗糖 30g/L； 0125

29、 （5）倍力凝 4g/L。 0126 对比例：采用CN201110233008.9公布的配方进行茎段离体再生植株 0127 培养基配方： 0128 （1）无机物：硝酸钾2108mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁 370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.0mg/L，硫酸锰16.9mg/L，硫酸锌9.6mg/ L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸 二纳37.3mg/L； 0129 （2）有机物：谷氨酰胺250mg/L，水解酪蛋白100mg/L，酵母提取物25

30、0mg/L，肌醇 100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L； 0130 （3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L，吲哚丁酸0.05mg/L，赤霉素0.1mg/L； 0131 （4）蔗糖 30g/L； 0132 （5）倍力凝 4g/L。 0133 实施例和对比例的试验结果见表1. 0134 表1马铃薯双单倍体茎段离体再生植株培养基改良前后成苗率情况比较 0135 0136 0137 注：成苗率为成苗的株数占总接种茎尖数的百分比。 0138 由图1可以看出，本发明的培养基配方对于马铃薯双单倍体茎段离体再生植株具 有良好的作用。从表1可以看出，所有实施例的效果都优于对比例，本发明的优选范围（实 说 明 书CN 102870682 A 17 12/12页 18 施例3、实施例8）更具有突出的效果，成苗率在70%以上。 说 明 书CN 102870682 A 18 1/2页 19 图1 说 明 书 附 图CN 102870682 A 19 2/2页 20 图2 说 明 书 附 图CN 102870682 A 20