RNA 合成－用于反向合成 RNA 的亚磷酰胺， 以及在 3’ - 末端 合成 RNA 的配体、 发色团和修饰物的方便引入中的应用 相关申请
本申请要求于 2008 年 9 月 6 日提交的第 61/191,065 号美国临时申请的权益。上 述申请所教导的全部内容引入本文作为参考。
发明领域 本发明涉及新 RNA 单体亚磷酰胺的合成， 以及相应的适用于 RNA 寡核苷酸在 5’ → 3’ 反向上合成的新方法的固体载体。本方法导致非常清洁的寡核苷酸的合成， 并使得 能在 3’ - 末端清洁地且有效地引入不同的修饰， 从而产生高纯度治疗级的 RNA 寡核苷酸。
发明背景
确定序列的 RNA 在 3’ → 5’ 方向上的合成现在是成熟的， 并当前用于多种治疗级 RNA 适体、 tRNA、 siRNA 和生物上有活性的 RNA 的合成和开发中。本方法使用具有合适的 N- 保护基的核苷 ： 一般是 5’ - 保护基， 最常见的是二甲氧基三苯基， 即 DMT 基团 ； 2’ - 保护
基， 其中最常见的是叔丁基二甲基甲硅烷基醚 ； 以及， 3’ - 亚磷酰胺， 其中最常见的是氰乙 基二异丙基 ( 组分 1)。随后将该组分与带有适当的 N- 保护基的核苷， 结合到固体载体上 的核苷的 2’ 或 3’ 琥珀酸酯偶联 ( 组分 2)。在活化剂的存在下， 在溶液相中也实现了组分 1 和 5’ -OH- 正 - 保护的 -2’ ， 3’ - 保护的 - 核苷 ( 组分 3) 的偶联， 所述活化剂导致二聚和 寡聚核苷酸的形成， 随后氧化 (3’ → 5’ 方向的合成 )， 也导致了具有 3’ -5’ - 核苷酸间连接 体的保护二聚核苷的形成， Ogilvie， K.K.， Can.J.Chem.， 58， 2686， 1980( 方案 1)。
然而， 据我们所知， 尚未实现在反向 (5’ -3’ 方向 ) 上的 RNA 合成。
已经广泛地开发了组分 1 的 2’ - 甲硅烷基醚， 并且发现其具有不同寻常的稳定 性。广泛地研究了甲硅烷基醚的溶剂分解作用， 并已知大 (bulky) 的烷基甲硅烷基醚具有 高度的稳定性 ； Bazani， B 和 Chvalowski， V Chemistry of Organosilicon compounds， 第 1 卷， Academic Press， New York， 1965。随后， Ogilvie 及其同事关于将 2’ - 羟基保护 基用于寡核苷酸的合成完成了大量的研究工作 (Ogilvie， K.K.， Sadana， K.L， Thompson， E.A.， Quilliam， M.A.， and Westmore， J.B TetrahedronLe Letters， 15， 2861-2864， 1974 ； Ogilvie， K.K.， Beaucage， S.L， Entwistle， D.W.， Thompson， E.A.， Quilliam， M.A.， and Westmore， J.B.J.Carbohydrate Nucleosides Nucleotides， 3， 197-227， 1976 ； Ogilvie， K.K.Proceedings of the 5th International Round Table on Nucleosides， Nucleotides and Their Biological Applications， Rideout， J.L.， Henry， D.W.， 和 Beacham L.M.， III， eds.， Academic， London， 第 209-256 页， 1983)。
这些研究随后导致对于溶液相和固相的寡核苷酸合成都适用的方法， 以及对具 有 tRNA 的尺寸和性质的 RNA 分子的首次化学合成的持续发展 (Usman， N.， Ogilvie， K.K.， Jiang， M.-Y.， and Cedergren， R.J.J.Am.Chem.Soc.109， 7845-7854， 1987 ； Ogilvie， K.K.， Usman， N.， Nicoghosian， K， and Cedergren， R.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 85， 5764-5768， 1988 ； Bratty， J.， Wu， T.， Nicoghosian， K.， Ogilvie， K.K.， Perrault， J.-P.， Keith，G.and Cedergren， R.， FEBS Lett.269， 60-64， 1990)。在随后的优秀出版物中对本文献进 行综述 ： Gait， M.J.， Pritchard， C.and Slim， G.， Oligonucleotide and Their Analogs ： A Practical Approach(Gait， M.J.， ed.)， Oxford University Press Oxford， England， 第 25-48 页， 1991。最近在 RNA 合成中采用的保护基为 ： 双 (2- 乙酰氧乙基 - 氧 ) 甲基 (ACE)， Scaringe， S.A.， Wincott， F.E.， Caruthers， M.H.， J.Am.Chem.Soc.， 120 ： 11820-11821， 1998 ； 三异丙基甲硅烷基氧甲基 (TOM)Pitsch， S.， Weiss， P.A.， Jenny， L.， Stutz， A.， Wu， X.， Helv.Chim.Acta.84， 3773-3795， 2001 以 及 叔 丁 基 二 硫 代 甲 基 (DTM)( 结 构 1)， Semenyuk， A.， Foldesi， A.， Johansson， T.， Estmer-Nilsson， C.， Blomgren， P.， Brannvall， M.， Kirsebom， L.A.， Kwiatkowski， M.， J.Am.Che m.Soc.， 128 ： 12356-12357， 2006， 以上都已 被引入。然而， 这些方法中没有一个可以从反向 (5’ → 3’ 方向 ) 进行 RNA 的合成 ； 因此它 们缺少在 RNA 分子的 3’ - 末端方便且充分地引入多种配体和发色团的能力， 这些通过反向 合成都可以实现。
为了体现 siRNA 的活性， 将阿拉伯糖、 2’ - 脱氧 -2’ - 氟 -β-D_ 阿拉伯糖核酸 (FANA ； 结构 2)) 和 2’ - 脱氧 -4’ - 硫 -2’ - 氟 -β-D_ 阿拉伯糖核酸 (4’ - 硫 -FANA ； 结构 3) 修饰进序列中来合成化学修饰的 RNA， Dowler， T.， Bergeron， D.， Tedeschi， Anna-Lisa， Paquet， L.， Ferrari， N.， Damha， M.J.， Nucl.Acids Res.，34， 1669-1675， 2006。在几种已 经开发了其化学性质的新的 2’ - 保护基中， 2’ - 保护的 -2- 氰乙氧基甲基 (CEM)( 结构 4) 显示出用于制备非常长的 RNA， 然而其也是以传统的即 3’ → 5’ 方向进行 RNA 合成。并且， 通过这些方法产生的 RNA 的质量仍待考察。
期待进行 RNA 的化学合成， 因为其避免了如 T7RNA 聚合酶体外转录进行之类的合 成在规模上的不足和限制， Helm， M.， Brule， H.， Giege， R.， Florence， C.， RNA， 5： 618-621， 1999。RNA 的化学合成对于 RNA 结构和功能 的研究而言是期待的， 并且可以选择性地实现 多种有用的修饰， 如位点特异性地引入官能团 ； 即二硫化物的交联作为 RNA 三级结构的探 针， Maglott， E.J.， Glick， G.D.， Nucl.Acids Res.， 26 ： 1301-1308， 1999。
长的 RNA 的合成对于如 tRNA 之类的生物活性分子而言是非常重要的， 并且这样的 合成已经实现了 ； Persson， T.， Kutzke， U.， Busch， S.， Held， R.， Harmann， R.K.， Bioorgan. Med.Chem.， 9： 51-56， 2001 ； Oglvie， K.K.， Usman， N.， Nicoghosian， K.， Cedrgren， R.J.， Proc.Natl.Acad.Sci.， USA， 85 ： 5764-5768， 1988 ； Bratty， J.， Wu， T.， Nicoghosian， K.，
Ogilvie， K.K.， Perreault， J.-P.， Keith， G.， Cedergren， R.J.， F.E.B.S.Lett.， 269 ： 60-64， 1990 ； Gasparutto， D.， Livache， T.， Bazin， H.， Duplaa， A.M.， Guy， A.， Khorlin， A.， Molko， D.， Roget， A.， Teoule， R.， Nucl.Acids.Res.， 20 ： 5159-5166， 1992 ； Goodwin， J.T.， Stanick， W.A.， Glick， G.D.， J.Org.Chem.， 59 ： 7941-7943， 1994。然而， 在这一段中提到的 技术没有一个预期从反向 (5’ → 3’ 方向 ) 进行 RNA 的合成， 因此在 3’ - 末端实用地且方便 地引入多种基团仍然是难以进行的。
本发明人在使用我们的反向 RNA amidite 进行自动寡聚合成中， 观察到每个步骤 有较高的偶联效率， 从而在达到较高纯度以及生成非常长的寡聚物中具有较强的能力。他 们还证明了本发明的方法生成的寡核苷酸没有 M+1 种类， 所述的 M+1 种类是近似的杂质， 在 HPLC 分析或纯化或凝胶纯化中， 其成为想要的峰的侧峰。
已经将在核苷的 2’ - 羟基上的叔丁基二甲基甲硅烷基保护基选用于制备 3’ - 亚磷 酰胺以及用于将它们用在寡核苷酸的合成中的基团， 所述基团表现出很容易迁移到 3’ -羟 基位置。就这一点有充分且详细的记载 (Ogilvie， K.K.， 和 Entwistle， D.W.Carbohydrate Res.， 89， 203-210， 1981 ； Wu， T.， 和 Ogilvie， K.K.J.Org.Chem.， 55， 4717-4734， 1990)。这样 的迁移使得想要的亚磷酰胺合成复杂化， 而因此需要使用有效的纯化方法， 从而明显将相 应的异构体再溶解并防止对最终的单体的任何污染。 本发明涉及高纯度的 RNA 的合成， 具体地涉及在合成 RNA 的 3’ - 末端引入所选择 的基团。这样的 RNA 在治疗、 诊断、 药物设计和细胞环境中选择性抑制 RNA 序列、 在阻断细 胞内不同种类的 RNA 的功能中具有广泛的应用。
使用基于核酸的分子， 在 mRNA 水平上使基因表达沉默是有吸引力的方法。在这 当中， 已经证明 RNA 干扰 (RNAi) 方法已经成为提供选择性的 基因抑制的巨大潜能， 并在 控制和管理不同生化和药理过程的应用中显示巨大预示的有效方法。按照 Fire， A.， Xu， S.， Montgomery M.K.， Kostas， S.A.， Driver， S.E.， and Mello， C.C， Nature， 391， 806-811， 1998， Fire 等人的研究显示， 在 Caenorhabditis elegan 中的 RNA 干扰是由 21 和 22 个核 苷的 RNA 序列介导的。这进一步被确认为通过小双链 RNA 来特异性抑制基因表达的一般 现象， 所述小双链 RNA 由 21 和 22 个核苷的 RNA 来介导， Genes Dev.， 15， 188-200， 2001。 Capie， N.J.， Parrish， S.， Imani， F.， Fire， A.， 并且 Morgan， R.A. 同时确认了由小的双 链 (ds)RNA 在无脊椎动物及类似地在脊椎动物中抑制基因特异性表达的这种现象。随 后， 大量的研究证实了上述研究并确立了将 RNAi 作为强有力的工具在选择性的以及非常 特异性的基因抑制和调节中的应用 ； Nishikura， K.， Cell， 107， 415-418， 2001 ； Nykanen， A.， Haley， B.， Zamore， P.D.， Cell， 107， 309-321， 2001 ； Tuschl， T.， Nat.Biotechnol.， 20， 446-448， 2002 ； Mittal， V.， Nature Rev.， 5， 355-365， 2004 ； Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 99， 6047-6052， 2002 ； Donze， O.&Picard， D.， Nucl.Acids.Res.， 30， e46， 2002 ； Sui， G.， Soohoo， C.， Affar el， B.， Gay， F.， Shi， Y.， Forrester， W.c.， 和 Shi， Y.， Proc.Natl.Acad.Sci. USA， 99， 5515-5520， 2002 ； Paddison， P.J.， Caudy， A.A.， Bernstein， E.， Hannon， G.J. ； 以及 Conklin， D.S.， Genes Dev.， 16， 948-959， 2002.
除了天然的双链 (ds)RNA 序列之外， 化学修饰的 RNA 为 siRNA 的活性而利用进入 序列中的 2’ - 脱氧 -2’ - 氟 -β-D- 阿拉伯糖核酸 (FANA) 来在哺乳动物细胞中显示了类 似的或者增强的 RNA 干扰， Dowler， T.， Bergeron， D.， Tedeschi， Anna-Lisa， Paquet， L.，
Ferrari， N.， Damha， M.J.， Nucl.Acids Res.， 34， 1669-1675， 2006.
为了改进 siRNA 的性质， 探究了其它各种修饰， 所述修饰包括在骨架化学物上的 改变， 2’ - 糖修饰以及核苷碱基的修饰， 其中最近对一些进行了综述 ； Nawrot， B， 和 Sipa， K.， Curr.Top.Med.Chem.， 6， 913-925 ， 2006 ； Manoharan ， M.Curr.Opin.Chem.Biol. ， 8， 570-579， 2004。siRNA 的 PS 修饰是很受允许的， 尽管一些报道指出这增加了毒性并在 一定程度上减少了效力 ； Harborth， J.， Elbasir， S.M.， Vandenburgh， K.， Manninga， H.， Scaringe， S.A.， Weber， K.， Tuschl， T.， Antisense Nucleic Acid Drug Dev.， 13， 83-105， 2003。在这当中， 还有 2’ - 氧甲基修饰， 尽管其保持了 A 类型 ( 类似 RNA) 的螺旋， 并根据 序列中该修饰的数量显示出其保持或者减少 siRNA 的活性， Chiu， Y.L， Rana， T.M.， RNA， 9， 1034-1048， 2003。还显示了可以在识别链中进行大范围的 2’ - 氧甲基修饰， 而不损失 siRNA 活性， Kraynack， B.A.， Baker， B.F.， RNA， 12， 163-176， 2006。
尤其当撤去 siRNA 序列的中间区时， 也将双环的锁核酸 (LNA) 引入到 siRNA 序列 中， 所述锁氨酸赋予高结合亲和性， Braash， D.A.， Jensen， S.， Liu， Y.， Kaur， K.， Arar， K.， White， M.A.， and Corey， D.R.， Biochemistry， 42， 7967-7995， 2003。类似地， 近期报道了 阿卓糖修饰的寡核苷酸 (ANA)。阿卓糖提供刚性的构型， 并显示出以特异性的方式与 RNA 形成非常稳定的二聚物， 并进一步地显示出保持 A(RNA 型 ) 的构型。与未修饰的对照相 比， 尤其当所述修饰接近有义链或者反义链的 3’ - 末端的时候， 靶向 MDR1 基因 ANA 修饰的 siRNA 显示出增强的效力， Fisher， M.， Abramov， M.， Aerschot， A.V.， Xu， D.， Juliano， R.L.， Herdewijn， P.， Nucl.Acids Res.， 35， 1064-1074， 2007。 在发生有效的 RNA 干扰 (RNAi) 的不同要求中， 有多个的观点和结果得到了确认。 因此 RNA 在识别靶的区域内不得不是双链的 (ds)。对于化学上的要求而言， 除了 5’ - 末端 转化为三磷酸酯的能力之外， 发现 A、 C、 G 的修饰完全地与干扰活性相兼容。在得到的双链 中， RNA 骨架的修饰如 2’ - 氟、 2’ - 氨基脲嘧啶、 2’ - 脱氧胸苷、 和 2’ - 脱氧胞啶显示出使 修饰的 RNA 稳定化。在核苷碱基的修饰中， 很容易将 5- 溴脲嘧啶、 4- 硫脲嘧啶、 5- 碘脲嘧 啶、 5-(3- 氨基烯丙基 )- 脲嘧啶、 次黄嘌呤核苷引入 RNA 干扰复合物 (RNAi&RISC 复合物 ) 中。类似地， 可以将肌苷来取代鸟苷。
已显示的是， 结合了胆固醇的 siRNA 可以递送到细胞中， 并使基因表达沉默。此 外， 已显示的是， 结合脂类的 siRNA、 拜耳酸和长链脂肪酸显示可以在体内介导 siRNA 到细 胞中的摄取并使基因表达沉默。在组织中有效且选择地摄取 siRNA 偶联物取决于其与脂蛋 白颗粒、 脂蛋白 / 受体相互作用的最大关联， 以及由跨膜蛋白所介导的摄取。已显示的是， 高密度脂蛋白显示出介导 siRNA 到肝脏、 下消化道、 肾脏以及含有类固醇的器官中的递送。 此外， LDL 显示出将 siRNA 主要地导向肝脏， 并且 LDL 受体被包含在 siRNA 的递送中。这 些结果显示通过合适的递送系统摄取 siRNA 大有前途， 这一点可以在治疗的开发中进行研 究。(Article by Marcus Stoffel， OTS， 2007， 第 64 页 .)
已经提出可以设计具有化学修饰的 siRNA， 用于保护不受核酸酶降解、 避免炎 症、 减少脱靶基因沉默， 并从而改进对于靶基因的效力。对于治疗上的开发而言， 能使细 胞摄取增强的递送载体或者脂类和其它亲脂性分子是必需的。当前这样的 siRNA 开发用 于人类靶点验证， 妨碍疾病的通路以及为药 物开发开创新的前沿。Alan Sachs， Merck， Oligonucleotide Therapeutics Conference(OTS)， 第 80 页， 2007。
siRNA 的有义链 3’ - 末端可以修饰， 并且其显示出耐受修饰， 如在多个关键的出版 物中所详述的， 在此端配体的附着是最合适的 ( 图 1&2) ； siRNA 在 RNAi 中起作用 ； 化学修 饰， Ya-Lin Chiu 和 Tariq Rana， RNA， 9， 1034-1048， 2003 ； M.Manoharan， Curr.Opin.Chem. Biol， 6， 570-579， 2004 ； Nawrot， B. 和 Sipa， K.， Curr.Top.Med.Chem.， 6， 913-925， 2006 ； Scaringe， S.， Marshall， W.S.， Khvorova， A.， Naty.Biotechnol.， 22， 326-30， 2004。
图示 (1).(siRNA 双螺旋 )图示 (2).( 与反义链互补的 m-RNA)
考虑了亲脂性或者疏水性基团的引入、 siRNA 递送的增强以及靶的优化已通过生 物结合来解决并实现 ( 图示 1)。一般地， 优选地在有义链的 3’ - 末端， 且偶尔在反义链的 3’ - 末端上进行该结合。为了开发有效的疗法， 设计抵抗核酸酶的 siRNA 已经成为近期研 究和开发的迫切主题。因此如 2- 硫尿苷、 假尿苷、 二氢尿苷之类的碱修饰显示出对 RNA 分 子的构型以及相关的生物活性的影响 ； Sipa， K.， Sochacka， E.， Kazmierczak-Baranska， J.， Maszewska， M.， Janicka， M.， Nowak， G.， Nawrot， B.， RNA， 13， 1301-1316， 2007。显示的 是， 2’ - 修饰的 RNA’ ， 尤其是 2’ - 氟对核酸酶具有强大的抵抗力， 并且在体内有生物活性， J.M.， McCaffrey， A.P.， Tanner， A.K.， Huang， Z.， Kay， M.A.， and Sullenger， B.A.， RNA， 10，
766-771， 2004。2’ - 氧 - 烷基修饰， 如 2’ - 氧甲基以及 2’ -O-MOE， Prakash， S.， Allerson， CV.R.， Dande， P.， Vickers， T.A.， Siofi， T.A.，Jarres， R.， Baker， B.F.， Swayze， E.E.， Griffey， R.H.， 和 Bhat， B.， J.Med.Chem.， 48， 4247， 4253， 2005。同一作者使用 4’ - 硫修 饰的糖核苷与 2’ - 氧烷基修饰相结合， 改进 siRNA 的性质以及增强了 RNAi， Dande， P.， Prakas， T.P.， Sioufi， N.， Gaus， H.， Jarres， R.， Berdeja， A.， Swayne， E.E.， Griffey， R.H.， Bhat， B.K， J.Med.Chem.， 49， 1624-1634， 2006。将核苷酸间的磷酸酯用 siRNA 的硫 代磷酸酯和硼烷磷酸酯取代显示出在体内应用的前景， Li， Z.Y.， Mao， H.， Kallick， D.A.， and Gorenstein， D.G.， Biochem.Biophys.Res.Comm.， 329， 1026-1030， 2005 ； Hall， A.H.S.， Wan， J.， Shaughnessy， E.E.， Ramsay Shaw， B.， Alexander， K.A.， Nucl.Acids Res.， 32， 5991-6000， 2004。
siRNA 分子、 生物 RNA 分子， 适体和合成的 DMNA 分子的生物结合除了在体内的稳定 性外和核苷的合适的修饰之外， 还需要是对细胞膜通透性而言的关键特征 ： 不充分的跨膜 细胞摄取限制 siRNA， 其他的单链 RNA 或者甚至不同的 DNA 分子的应用。 因此， 结合至 siRNA 的 3’ - 末端的胆固醇显示出在体内改善的细胞运输以及在治疗上使基因沉默， Soutschek， J.， Akine， A.， Bramlage， B.， Charisse， K.， Constein， R.， Donoghue， M.， Elbasir， S.， Geickk， A.， Hadwiger， P.， Harborth， J.， Nature， 432， 173-0178， 2004。
在不同的偶联物中， 除胆固醇之外， 已经开发的有 ：(a) 天然的和合成的蛋白质转导功能域 (PTD)， 也称作细胞渗透肽 (CPP) 或者膜渗 透肽 (MPP)， 其为短的氨基酸序列， 能与细胞质膜相互作用。MPP-siRNA 偶联物的摄取迅速 地发生。这样的肽能够优选地结合至标准链的 3’ 。
(b) 其它多阳离子分子可以结合至 RNA 的有义链或者反义链的 3’ - 末端。
(c) 已经将 PEG( 聚乙二醇 - 寡核苷酸偶联物 ) 用于不同的复合物中， 在靶细胞的 摄取后具有显著的基因沉默效果， Oishi， M.， Nagasaki， Y.， Itaka， K.， Nishiyama， N.， and Kataoka， K.， J.Am.Chem.Soc.， 127， 1624-1625， 2005。
(d) 已经将适体用于 siRNA 位点特异性的递送中。由于适体对于其靶具有高的亲 和性， 其与 siRNA 的偶联物是出色的递送系统， 这导致靶基因表达的有效抑制， Chu， T.C.， Twu， K.Y.， Ellington， A.D.and Levy， M.， Nucl.Acids Res.， 34(10)， e73， 2006。这些分子 也可以连接于 siRNA 或者生物活性寡核苷酸的 3’ - 末端。
(e) 可以通过本发明得到位于 3’ - 末端的不同脂类偶联物， 并且其可以 用于将寡 核苷酸充分地内在化。脂类的部分可以由羟基官能团组成从而合成亚磷酰胺。类似地， 所 述脂类部分可以在末端具有羧基官能团。后者可以利用 DCC( 二环己基碳二亚胺 ) 或类似 的偶联剂偶联到具有间隔基团的 3’ - 氨基基团， 通过最后向羧基部分加入反向合成的寡聚 核苷的氨基连接体如 C-6 氨基连接体来合成。
Paula， De.D.， Bentley， M.V.L.B.， Mahao， R.L.， RNA， 13， 431-456， 2007 中简洁地 综述了这一研究。
另一类与 siRNA 紧密相关的 RNA 是微小 RNA， 一般地称作 miRNA。这些是一大 类在基因调节中起到重要作用的非编码 RNA， Bartel， D.P.Cell， 116， 281-297， 2004 ； He， L.， Hannon， G.J.Nat.Rev.Genet， 5： 522-531， 2004 ； Lagos-Quintana， M.， Rauhut， R.， Lendeckel， W.， Tuschl， T.， Science， 204 ： 853-858， 2001。在人类基因组中， 至少有 1000 个 miRNA 分散在整个基因组中。 其中大量这些微小 RNA 向下调节大量的靶 mRNA， J.M.， Nature， 433 ： 769-773， 2005。miRNA 的不同组合可以涉及哺乳动物细胞的靶基因的调节中。siRNA 显示出能够作为 miRNA 起作用 ； Krek， A.， Grun， D.， Poy， M.N.， Wolf， R.， Rosenberg， L.， Epstein， E.J.， MacMenamin， P.， da Piedade， I.， Gunsalus， K.C.， Stoffel， M.， Nat.Genet.， 37 ： 495-500， 2005 ； Doench， J.G.， Petersen， C.P.， Sharp， P.A.， Genes Dev.， 17 ： 438-442， 2003。miRNA 在治疗上， 以及在基因调节中具有很大的潜力， Hammond， S.M.， Trends Mol. Med.12 ： 99-101， 2006。 为了弄清 miRNA 的路径， 它们在发育和疾病中， 尤其关注的是在癌症 中扮演的角色而进行了大量的努力。开发了用于治疗和诊断的 miRNA 的靶。通过微阵列、 PCR 和信息学鉴定了大量的 miRNA， 并确定了其作用。根据 siRNA 的需要， 为了 RNA 和生物 偶联物的稳定性以及更好的细胞摄取， 设计用于靶向 miRNA 的 RNA 的合成也要求 RNA 合成 和其他的修饰。本发明中展望的反向合成能够极大地加速该研究和开发的步调。
多种治疗级的 RNA 和 siRNA 的合成需要在寡核苷酸的 3’ - 末端进行修饰或者标 记。在 siRNA 的情况下， 通常在有义链的 3’ - 末端进行。对于需要脂类长链配体或者发色 团的的 3’ - 末端修饰的 RNA 的合成而言， 使用 3’ → 5’ 合成方法学是有挑战的， 需要相应的 固体载体且通常生成低偶联率及较低纯度的最终寡聚核苷， 一般而言， 这是由于大量的含 有想要的疏水性修饰的末端截取序列。
本发明人通过开发用于 RNA 在 5’ → 3’ 方向上的合成的反向 RNA 单体 亚磷酰胺克服了这一难题。这一安排使得能进行非常干净的寡聚核苷合成， 从而使得在 3’ - 末端干 净而又有效地引入不同修饰。为了增强稳定性并诱发另外的想要的生物化学性质， 这一技 术可以利用过去已经开发出的 2’ -5’ - 连接的 DNA( 结构 5) 和 RNA( 结构 6)。
为了有效地递送 RNA 并提高寡核苷酸的细胞浓度， 通常合成含有脂类的寡核苷 酸， 因为含有脂类的合成核苷酸增强多种合成的核苷酸药物的摄取， 所述核苷酸药物如 AZT。希望脂核酸减少寡聚核苷酸的亲水性。类似地， 如胆固醇的疏水性分子可以结合于 LDL 颗粒和脂蛋白， 并激活包含这些蛋白质的递送过程， 从而转运寡核苷酸。脂核酸也显示 出改进寡核苷酸的效力。Shea， R.G.， Marsters， J.C.， Bischofberger， N.， Nucleic Acids Res.， 18， 3777， 1990 ； Letsinger， R.L.， Zhang， G.， Sun， D.K.， Ikeuchi， T.， Sarin， P.S.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86， 6553， 1989 ； Oberhauser， B.， 和 Wagner， E.， Nucleic Acids Res.， 20， 533， 1992 ； Saison， -Behmoaras， T.， Tocque， B.， Rey， I.， Chassignol， M.， Thuong， N.T.， Helene， C.The EMBO Journal， 10， 1111， 1991 ； Reed， M.W.， Adams， A.D.， Nelson， J.S.， MeyeR.B.， Jr.， Bioconjugate Chem.， 2， 217， 1991 ； Polushin， N.N.， Cohen， J.， J.Nucleic Acids Res.， 22， 5492， 1994 ； Vu， H.， Murphy， M.， Riegel， Joyce， M.， Jayaraman， K.， Nucleosides & Nucleotides， 12， 853， 1993 ； Marasco， Jr.， Angelino， N.J.， Paul， B.， Dolnick， B.J.， Tetrahedron Lett.， 35， 3029， 1994。在这些研究中， 一系列疏水性基团的 Tm， 所述疏水性基团如金刚烷 ( 结构 7)， 二十烯酸 ( 结构 8)， 和胆固醇在 3’ - 末端结合至 寡聚脱氧核苷酸序列， 并使序列与互补的 RNA 序列杂化 ； 发现所述 Tm 未受影响， 这说明了 这些基团不与寡聚杂化性质相互作用 ； Manoharan， M.， Tivel， K.L.， Andrade， L.K.， Cook， P.D.， Tetrahedron Lett.， 36， 1995 ； Manoharan， M.， Tivel， K.L.， Cook， P.D.，Tetrahedron Lett.， 36， 3651-3654， 1995 ； Gerlt， J.A.Nucleases， 第 2 版， Linn， S.M.， Lloyd， R.S.， Roberts， R.J.， Eds.Cold Spring Harbor Laboratory Press， 第 10 页， 1993。
除了前述的脂类分子之外， 作为具有良好前景的是短链和长链的聚乙二醇 (PEG) 的其它分子 Bonora， G.M.， Burcovich， B.， Veronese， F.M.， Plyasunova， O.， Pokrovsky， A.and Zarytova， V.， XII International Round Table Conference， Nucleosides， Nucleotides and their Biological Applications， La Jolla， CA， Sept.， 15-19， PPI 89， 1996。为了有效地递送合成的 RNA 和 DNA 分子， 将 PEG 结合到不同的寡核苷酸上显示出非 常有利的性质。 PEG- 寡聚物通过阻碍快速的降解来显示良好的酶稳定性。 热溶化的行为未 受影响， 从而仍然保留了形成双链的性质。
本发明人制备反向 RNA 亚磷酰胺的方法需要选择性地引入 5’ 的酯， 如 5’ 苯甲酰 基、 乙酰基、 乙酰丙烯基或者取代的 5’ - 苯甲酰基 - 正 - 保护的核苷。随后需要在 2’ 位置 引入合适的保护基， 如 2’ -tBD 甲硅烷基或者 2’ -TOM( 三异丙基甲硅烷基甲氧醚 ； TOM)。在 他们的方案中， 他们表示合成了所选择的分子， 从而实现了这一目的。
为了生成靶化合物， 结构 (16a-e)， 所需要的关键中间体是 2’ - 甲硅烷基醚 -5’ -O 乙酰化的 -N- 保护的核苷化合物 (23a-e)。为此， 所需要的第一中间体是 5’ - 乙酰化 的 -N- 保护的核苷化合物 (22a-e)。据我们所知， 化合物 (21a-e) 是未经报道的。在过去使 用过的中间体中报道用于 RNA 合成的， 结构 11、 12 和 13。具有 5’ 乙酸酯的不同的 2’ 和 3’ 乙酸酯， 即 5’ 苯甲酰基保护的核苷 ； Reese， B.E.， Jarman， M.， Reese， C.B.， Tetrahedron， 24， 639， 1968 ； Neilson， T.， Werstiuk， E.S.， Can.J.Chem.49， 493， 1971 ； Neilon， T.， Wastrodowski， E.V.， Werstiuk， E.S.， Can.J.Chem.， 51， 1068， 1973 ； Eckstein， F.， Cramer， F.， Chem.Ber.， 98， 995， 1965 ； Zemlicka， J.， Chladek， S.， Tet.Lett.， 3057， 1965， Amarnath， V.& Broom， A.D.， Chemical Reviews， 77， 183-219， 1977。本发明， 然而需要游离的 2’ 和 3’ 羟基基团， 如在结构 (22a-e) 中的。
在本发明中， 进行了比较性的 RNA 合成和纯化， 其通过传统的方 (3’ → 5’ ) 和反向 (5’ → 3’ )。观察到 ： RNA 的高纯度， 光滑的 3’ - 结合 - 胆固醇， HEG 和 PEG( 聚乙二醇 ) 以 及证明在反向 RNA 的合成中不存在 M+1。
合成方案的细节在方案 (2) 中详述。2’ ， 3’ - 异亚丙基官能团用于保护正 - 保护 的核苷的 2’ ， 3’ 羟基基团。大量优选的正 - 保护基显示于示意图 (2) 中。随后保护 5’ 羟 基基团， 优选地使用苯甲酰基团， 从而获除得一般结构 21 的化合物。随后， 选择性地在本领 域公知的温和酸性条件下去异丙烯基团。这一步骤生成的具有通式 22 的化合物。随后与 TBDM 氯硅烷 ( 叔丁基二甲基氯硅烷 ) 的反应生成具有通式 23 的单甲硅烷基化合物。本发 明人观察到， 在此过程中形成 3’ -TBDMS 基团， 即结构 24 的化合物不是优选的。在大多数的 情况下， 他们通过化学和分析方法观察到了结构确定为 23 的干净产物。
在前述方法的各个步骤中， 通过结晶或者柱层析进行纯化。随后与二甲氧基三苯 甲基氯 (DMT- 氯 ) 在吡啶中的反应生成通式结构 26 的 3’ -DMT-2’ -TBDMS- 正 - 保护的核 苷。这些化合物各个都通过柱层析纯化。
尽管他们使用了 TBDMS 来制备 2’ -TBDMS 酯， 其它的甲硅烷基醚也可以用于这个步 骤中。认真进行的水 / 甲醇的 NaOH 水解生成具有游离的 5’ - 羟基基团的化合物， 通常为结 构 27。
选择性的使用含水或者甲醇的碱去除 5’ - 苯甲酰基在本领域中是公知的。化合物 3’ -DMT-2’ -TBDMS- 正 - 保护的核苷 ( 结构 27) 通过硅胶柱层析进行纯化。经纯化的化合 物 ( 结构 27) 随后使用磷酸化试剂进行磷酸化， 所述磷酸化试剂如正， 正 - 二异丙基氨基氰 乙基磷酰胺氯或者 2- 氰乙基、 正， 正， 正， 正 - 四异丙基苯膦从而得到相应的亚磷酰胺。两 种磷酸化试剂， 正， 正 - 二异丙基氨 基氰乙基磷酰胺氯或者 2- 氰乙基、 正， 正， 正， 正 - 四异 1 丙基苯膦都是在市场上可得到的 ， 并且磷酸化生成相应的亚磷酰胺的方法在本领域中是 公知的。
发明概述
本发明提供了下述结构 (14) 所示的新 RNA 单体亚磷酰胺。所开发的合成路线使 得能够获得希望的不存在不想要的异构体污染的亚磷酰胺。
在本发明中的 RNA 亚磷酰胺单体包括核苷中的 3’ -DMT 基团， 携带 5’ - 氰乙基亚 磷酰胺 (CED) 以及在核糖部分 ( 结构 14) 的 2’ - 位上携带多种甲氧基或者甲硅烷基保护 基。固体载体具有保护的 RNA 核苷， 所述核苷包含 3’ -DMT 基团， 并且 5’ - 末端结合到固体 载体 ( 结构 15)。
所述 RNA 亚磷酰胺能够用于反向 5’ → 3’ 上的寡聚核苷酸的合成。在实验中进行 了大量的 RNA 合成， 传统的 (3’ → 5’ ) 和反向的 (5’ → 3’ )。
在 RNA 寡聚物的 3’ - 末端的修饰或者标记可以通过在合成结束时使用相应的亚 磷酰胺或者活泼酯来结合， 并不需要特别的固体载体。 此外， 本发明的方案得到非常干净的 3’ - 标记的寡聚核苷， 并不需要昂贵的分离方法。
通过反向 (5’ → 3’ ) 的 RNA 合成， 稳定地获得了高纯度水平的 RNA， 得到了如胆固 醇、 HEG( 六甘醇 ) 和 PEG( 聚乙二醇 ) 的光滑的 3’ - 连接体， 不存在 M+1 的寡聚核苷杂质。
附图的简要说明
前述的部分通过随后本发明实施例和实施方案来更具体地描述， 如在所附的图中 图示的， 其中在不同部分中同样的引用文字指同样的部分。附图了说明本发明的实施方案 之外， 不必然地改变其范围或者对其进行强调。
图 1.N4- 苯甲酰基 -2’ O-TBDMS-3’ -O-DMT- 腺苷 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚 磷酰胺 (16a) 的 HPLC 色谱图， 纯度为 98.6％。 4
图 2.N - 苯甲酰基 -2’ O-TBDMS-3’ -O-DMT- 腺苷 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚 31 磷酰胺 (16a) 的 NMR P 谱图， 在 149.465ppm & 149.307ppm 有尖锐的双峰 ； δ： 0.158， 纯 度为 98.6％。
图 3.N4- 乙酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 胞嘧啶 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚 磷酰胺 (16c) 的 HPLC 色谱图， 纯度为 96.9％。
图 4.N4- 乙酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 胞啶 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚 31 磷酰胺 (16c) 的 NMR P 谱图， 在 149.447ppm & 149.197ppp 有尖锐的双峰 ； δ： 0.250， 纯 度为 100％。
图 5.N2- 异丁酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 鸟苷 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚 磷酰胺 (16d) 的 HPLC 色谱图， 纯度为 98.3％。
图 6.N2- 异丁酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 鸟苷 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚 31 磷酰胺 (16d) 的 NMR P 谱， 在 149.731ppm & 149.048ppm 有尖锐的双峰， δ： 0.683， 纯度
为 100％。
图 6a. 化合物 (16d) 的质谱 ； N2- 异丁酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT 鸟苷 -5’ -氰 乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚磷酰胺 ； 在 969.4 观察到正离子质量， 计算为 970.18。 2
图 6b. 化合物 (16d) 的质谱 ； N - 异丁酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 鸟苷 -5’ -氰 乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚磷酰胺 ； 在 993.0 观察到正离子质量， 计算为 993.18(+Na).
图 7.5’ → 3’ RNA 合成和进行 3’ - 修饰的图示表示。
图 8. 偶合效率三苯基柱状图 (21 个单体的 RNA 合成 ) ： 偶合效率 ( 按照碱基水平 计算的每步收率 ) ： 99.6％ ； 最终的收率 ( 按照移动平均 ) ： 100％ ； 对于单体 G 的逐步收率 ： 100％， 对于单体 A 的逐步收率 ： 99.2％ ； 对于单体 C 的逐步收率 ： 99.6％ ； 对于单体 U 的逐步收率 ： 100％。
图 9. 按照传统方法 (3’ → 5’ 方向 ) 制备的粗品寡聚核苷酸 SEQ ID No ： 1 的电 泳图 ；
图 9a. 按照传统方法 (3’ → 5’ 方向 ) 制备的粗品寡聚核苷酸 SEQ ID No ： 1 的电 泳图 ； 加速模型 (Expedite Model)8909-1 微摩尔规模 ； 粗品纯度为 90.78％。
图 10. 按照反方向 (5’ → 3’ 方向 ) 合成 RNA 的方法制备的粗品 21 单体 RNA 的电 泳图 ； 加速模型 8909-1 微摩尔规模 ； 粗品纯度为 78.55％。注 ： M+1 看起来在反方向合成中 不存在。
图 11. 按照传统方法 (3’ → 5’ 方向 ) 制备的粗品寡聚核苷酸 SEQ ID No ： 2 的电 泳图 ； 加速模型 8909-1 微摩尔规模 ； 粗品纯度为 82.83％。注 ： 顶点在右侧出现， 很可能归 因于 M+1 类。
图 12. 按照反方向 (5’ → 3’ 方向 ) 合成 RNA 的方法制备的粗品寡聚核苷酸 SEQ ID No ： 2 的电泳图 ； 加速模型 8909-1 微摩尔规模 ； 粗品纯度为 85.76％ ； 注： M+1 看起来在 反方向合成中不存在。
图 13. 具有胆固醇 -TEG 连接体的 21 个单体的 RNA。反向 (5’ → 3’ ) 的合成和 HPLC 纯化 ； 1 微摩尔的规模 ； 纯度为 99.9％。 图 14. 按照反向 RNA 合成制备的粗品聚核苷酸 SEQ ID No ： 4 的电泳图， 粗品纯度 为 56.60％。
图 15. 按照反方向 (5’ → 3’ ) 合成的 21 个单体的 RNA， 随后进行 HEG( 六甘醇 ) 结合。在 HPLC 纯化之后， 纯度 94.39。
图 16. 按 照 反 方 向 合 成 制 备 的 粗 品 聚 核 苷 酸 SEQ ID No ： 3 的电泳图 ； 使用 3’ -PEG( 聚乙二醇， MW ： 2000) 合成的 21 个单体的 RNA ； 加速模型 8909-1 微摩尔规模 ； 粗品 纯度为 91.87％， 存在干净地分离的宽峰。
图 17. 按 照 反 向 合 成 制 备 的 粗 品 聚 核 苷 酸 SEQ ID No ： 4 的电泳图 ； 使用 3’ -PEG( 聚乙二醇， MW ： 2000) 合成的 21 个单体的 RNA ； 加速模型 8909-1 微摩尔规模 ； 粗品 纯度为 100％。
图 18. 使用 3’ -PEG2000 连接体合成的 21 个单体的 RNA， 经纯化的 RNA 的 ESI 质谱 分析示于图 17。合成通过反向进行 (5’ → 3’ ) 方向 ； PEG 在最后的步骤通过相应的亚磷酰 胺结合， ChemGenes 索引号 ： CLP-3119， 计算的分子量 8684.1， 观察到的分子量 8681.1 ； 注： 在按照 PEG2000 计算的分子量的两侧的 RNA 有至少 14 个 PEG 种类。因此， 存在 8417.1 至 8945.3 的种类， 各种类具有一个葡萄糖单元分子量的差 (+/-44)。
发明详述
在一个实施方案中， 本发明涉及式 (1) 的新亚磷酰胺，
其中
Y 为氧或者硫 ；
W 为氧、 氮和氟 ；
R4 选自叔丁基二甲基甲硅烷基 (TBDMS)、 三异丙基甲硅烷基氧亚甲基、 芴基甲基氧 羰基 (Fmoc)、 烷基、 芳基和乙酰基 ；
Z 为由二甲氧基三苯基 (DMT)、 一甲氧基三苯基 (MMT) 和三甲氧基三苯基 (TMT) 组 成的保护基 ；
R1 为烷基或者芳基 ；
R2 为烷基或者芳基 ； R3 为氰乙基， 烷基或者芳基 ； 并且 B 为氢或者任选地在各个伯胺上使用胺保护基官能化的核苷碱基。 在另一个实施方案中， 本发明涉及式 1 的亚磷酰胺 ：其中，
Y 为氧或者硫 ；
W 为硫 ；
R4 为苯甲酰基， 乙酰基或者二硫化物 ；
Z 为由二甲氧基三苯基 (DMT)、 一甲氧基三苯基 (MMT) 和三甲氧基三苯基 (TMT) 组 成的保护基 ；
R1 为烷基或者芳基 ；
R2 为烷基或者芳基 ；
R3 为氰乙基， 烷基或者芳基 ； 并且
B 为氢或者任选地在各个伯胺上使用胺保护基官能化的核苷碱基。
本发明还涉及通过在 5’ - 至 3’ - 方向上形成键来制备寡核苷酸的方法， 所述方法 用于合成选自下式的 RNA 寡聚物 ：
所述方法包括将化合物其中 ；
B 为氢或者任选地在各个伯胺上使用胺保护基官能化的核苷碱基 ；
n 为 0 至 98 ；
Y 为氧或者硫 ；
W 为氧、 氮、 硫和氟 ；
当 W 不为硫时， R4 为甲硅烷基醚如 TBDMS、 三异丙基甲硅烷基氧亚甲基、 Fmoc、 烷 基、 芳基或者乙酰基 ； 而当 W 为硫时， R4 为苯甲酰基， 乙酰基或者二硫化物 ；
Z 为 DMT、 MMT、 TMT 保护基 ；
R1 和 R2 独立地选自烷基或者芳基基团 ；
R3 为氰乙基、 烷基或者芳基 ； 并且
M 为氢自由基或者 Y-CO- ； 其中 Y 是适用于结合至固体载体的连接体。
术语 “烷基” ， 单独使用或作为一个较大的部分的一部分来使用， 如 “芳基烷基” 或 “环烷基烷基” 指的是直链或支链的烃基， 其有 1-10 个碳原子， 并包括， 例如甲基、 乙基、 丙 基、 异丙基、 正丁基、 仲丁基、 异丁基、 叔丁基、 正戊基、 异戊基、 正己基、 正庚基、 正辛基、 正壬 基、 正癸基等等。
术语 “环烷基” 是指单环， 双环或三环的饱和烃环， 其具有 3-12 个碳原子并包括， 例如环丙基、 环丁基、 环戊基、 环己基、 环庚基、 环辛基、 双环 [2.2.2] 辛基、 双环 [2.2.1] 庚 基、 螺环 [4.4] 壬基、 金刚烷基等等。
“芳基” ， 单独使用或如在 “芳基烷基” 中作为一个较大部分的一部分使用， 是指 6-10 个碳的芳香单环或多环体系。实例包括苯基和萘基。术语 “芳基” 还包括稠合到非芳
香碳环或杂环基团的苯环。术语 “芳基” 可以与如 “芳香基团” 、 “芳环” 、 “芳香环” 、 “芳基团” 和 “芳香基团” 之类术语交换使用。
“杂” 是指环系统中至少一个碳原子被替换成至少一个选自 N、 S 和 O 的杂原子。杂 环中可以有 1， 2， 3 或者 4 个碳原子被杂原子取代。
“杂环基” 指 3 至 20 个原子、 3 至 12 个原子或 3 至 8 个原子的饱和的或者不饱和 的、 非芳香的、 单环或者多环体系， 其包含一至四个选自 O、 N 和 S 的杂环原子。示例性的杂 环基包括吡咯、 吡咯烷 -2- 酮， 1- 甲基吡咯烷 -2- 酮、 哌啶、 哌啶 -2- 酮、 2- 吡啶酮、 4- 吡啶 酮、 哌嗪、 1-(2， 2， 2- 三氟乙基 ) 哌嗪、 哌嗪 -2- 酮、 5， 6- 二氢嘧啶 -4- 酮、 嘧啶 -4- 酮、 四 氢呋喃、 四氢吡喃、 四氢噻吩、 四氢硫代吡喃、 异噁唑烷、 1， 3- 二氧戊环、 1， 3- 二硫戊环、 1， 3- 二 环、 1， 4- 二 环、 1， 3- 二噻烷、 1， 4- 二噻烷、 恶唑烷 -2- 酮、 咪唑烷 -2- 酮、 咪唑 啉 -2， 4- 二酮、 四氢嘧啶 -2(1H)- 酮、 吗啉、 N- 甲基吗啉、 吗啉 -3- 酮、 1， 3- 噁嗪 -2- 酮、 硫 代吗啉、 硫代吗啉 1， 1- 二氧化物、 四氢 -1， 2， 5- 氧噻唑 -1， 1- 二氧化物、 四氢 -2H-1， 2- 噻 嗪 -1， 1- 二氧化物、 六氢 -1， 2， 6- 噻二嗪 -1， 1- 二氧化物、 四氢 -1， 2， 5- 噻二唑 -1， 1- 二氧 化物和异噻唑烷 -1， 1- 二氧化物。
“杂环基” 还包括杂芳基。术语 “杂芳基” 指 5-10 元环的单价杂芳单环和多环基， 其含有 1 至 4 个杂原子， 所述杂原子独立地选自 N、 O 和 S。术语 “杂芳基” 还包括与非芳 香的碳环或者杂环稠合的单环杂芳环。杂芳环包括呋喃基、 噻吩基、 苯硫基、 吡咯基、 恶唑 基、 噻唑基、 咪唑基、 吡唑基、 异恶唑基、 异噻唑基、 噁二唑基、 三唑基、 噻二唑基、 吡啶基、 吡 啶 -N- 氧化物、 哒嗪基、 嘧啶基、 吡嗪基、 吲哚嗪基、 吲哚基、 异吲哚基、 苯并呋喃基、 苯并噻 吩基、 吲唑基、 苯并咪唑基、 苯并噻唑基、 嘌呤基、 4H- 喹嗪基、 喹啉基、 异喹啉基、 喹唑啉基、 苯并噻吩基、 苯并呋喃基、 2， 3- 二氢苯并呋喃基、 苯并二茂、 苯并咪唑、 吲唑基、 苯异氧唑、 苯 并恶唑基、 苯并噻唑基、 噌嗪、 酞嗪基、 喹喔啉基、 1， 8- 萘啶基、 1， 2， 3 三唑基、 1， 2， 4 三唑基、 1， 3， 4- 恶唑基、 1， 2， 5- 噻二唑基、 1， 2， 5- 噻二唑基 -1- 氧化物、 1， 3， 4- 噻二唑基、 1， 2， 4- 三 吖嗪基、 1， 3， 5- 三吖嗪基、 四唑基和蝶啶基。术语 “杂芳基” 、 “杂芳环” 和 “杂芳基团” 在此 可以互换使用。
B 是氢， 天然的或者非天然的核苷碱基， 保护的核苷碱基， 保护的天然的或者非 天然的核苷碱基， 杂芳环或者保护的杂芳环。例如， 核苷碱基可以任选地在各个伯胺处使 用胺保护基官能化， 所述保护基包括但不限于在实例中列举的， 以及 A(N-Bz)、 A(N-Ac)、 A(N-tBPac)、 A(N-Pac)、 C(N-Bz)、 C(N-Ac)、 C(N-tBPac)、 C(N-Pac)、 G(N-iBu)、 G(N-Ac)、 G(N-tBPac)、 G(N-Pac)、 I、 或者 U。 对于本领域技术人员而言已知的是， 适用于固相合成的任意固体载体都可以用于 本发明。适合的固体载体的实例包括具有可控孔的玻璃、 聚苯乙烯、 微孔聚酰胺如聚 ( 二甲 基甲酰胺 ) 以及涂布了聚乙烯的聚苯乙烯。在此还考虑用适合的连接体将本发明的化合物 结合到固体载体上。连接体是对于本领域技术人员而言公知的。
胺、 羟基和硫代的保护基对于本领域的技术人员是已知的。胺保护基的实例参见 Greene 等人， rotective Groups in Organic Synthesis(1991)， John Wiley & Sons， Inc.， 第 309-405 页， 其教导在此以其全文包括作为参考。优选地， 将胺作为酰胺或者氨基甲酸酯 来保护。羟基保护基的实例参见 Id.， 第 0-142 页， 其教导在此以其全文包括作为参考。依 赖酸的保护基可以通过将所述基团与布鲁斯特酸或者路易斯酸接触来将保护基去除。 依赖
酸的基团对于本领域的技术人员是已知的。 一般的依赖酸的保护基包括取代的或者非取代 的三苯基基团 (Id.， 第 60-62 页 )、 取代的或者非取代的四氢吡喃基 (Id.， 第 31-34 页 )、 取代的或者非取代的四氢呋喃基 (Id.， 第 36-37 页 ) 或者 pixyl 基团 ((Id.， 第 65 页 )。 优选的对依赖酸的基团是取代的或者非取代的三苯基， 如 4， 4′ - 二甲氧基三苯基 ( 此后 称作″ DMT″ )。三苯基基团优选地被给电子取代基取代， 如烷氧基团。核苷碱基包括天 然产生的碱基 ： 如腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胞嘧啶、 胸腺嘧啶和脲嘧啶， 如 7- 去氮杂鸟嘌呤、 7- 去 氮 -8- 杂鸟嘌呤、 5- 丙炔基胞嘧啶、 5- 丙炔基脲嘧啶、 7- 去氮腺嘌呤、 7- 去氮 -8- 氮腺嘌呤、 7- 去氮 -6- 氧嘌呤、 6- 氧嘌呤、 3- 去氮腺苷、 2- 氧 -5- 甲基嘧啶， 2- 氧 -4- 甲基硫代 -5- 甲 基嘧啶、 2- 硫代羰基 -4- 氧 -5- 甲基嘧啶、 4- 氧 -5- 甲基嘧啶、 2- 氨基嘌呤、 5- 氟尿嘧啶、 2， 6- 二氨基嘌呤、 8- 氨基嘌呤， 4- 三唑 -5- 甲基胸腺嘧啶以及 4- 三唑 -5- 甲基尿嘧啶。保护 的核苷碱基， 其中对碱基的反应性官能团进行保护。类似地， 保护的杂环， 其中对杂环的反 应性取代基进行保护。 一般地， 核苷碱基或者杂环具有可以用胺保护基保护的胺基团， 如酰 胺和氨基甲酸酯。 例如， 腺嘌呤和胞嘧啶的胺基团一般地使用苯甲酰基保护基来进行保护， 并且鸟嘌呤的胺基团一般地由异丁酰基基团、 乙酰基团或者叔丁基苯氧乙酰基基团进行保 护。然而， 也使用其它的保护方案。例如， 为了快速去除保护， 用苯氧基乙酰基团对腺嘌呤 和脲嘧啶的胺基团进行保护， 并且用异丁酰基基团或者乙酰基基团对胞嘧啶的胺基团进行 保护。去除核苷碱基或者杂环的保护基的条件取决于所使用的保护基。当使用酰胺保护基 时， 其可以通过将寡聚核苷酸使用碱溶液处理来去除， 所述碱溶液如浓氨水溶液、 正甲基胺 溶液或者叔丁基胺的氨水溶液。
本发明方法的显著特征于下文描述， 其来自讨论、 实验数据和图 9-18， 包括以下的 观点 ：
I. 与反向 (5’ -3’ 方向 )RNA 合成相比， 在传统的方法 (3’ -5’ 方向 ) 中， 粗品 RNA 具有更紧密的杂质 (N-1)。因此在纯化之后， 通过反向 RNA 合成的 RNA 更纯。
II. 如上所述的特征在将胆固醇结合到 DNA 的 3’ - 末端的合成中更为直观 ( 参见 图 11 与图 12 相对比 )。因此， 纯化通过反向合成的在 3’ - 末端具有胆固醇的 RNA 更为容 易。
III.M+1 杂质在通过反向合成 RNA 的方法中根本上是不存在的。
在寡聚核苷酸的偶合的步骤中， 在寡聚核苷酸链延长的偶合时间内， 假设在分子 核苷 -3’ -DMT-2’ -tBD 甲硅烷基 -5’ - 亚磷酰胺中， 3’ -DMT 未经 5- 乙基 硫代四唑或者类 似的活化剂切割。
IV. 在 3’ - 末端含有大分子的 RNA 通过常规方法 (3’ → 5’ ) 是不可达到的， 通过 反向 (5’ → 3’ )RNA 合成是很容易的。可以生产这样的高纯度的 RNA。
V. 合成了 3’ -PEG RNA(21 个单体 )， 并且在纯化之后基本上为 100％纯 ( 参见图 16、 17 和 18)。
在本发明中， 这些反向 RNA 单体亚磷酰胺在核苷中携带 3’ -DMT 基团， 所述基团携 带 2’ -tBD 甲硅烷基 (tBDSi)-5’ - 氰乙基亚磷酰胺 (CED)( 结构 16)、 3’ -DMT-2’ -tBD 甲硅 烷基 -5’ - 琥珀酰基 -Icaa CPG- 正 - 保护的核苷 ( 结构 17) 或者 3’ -DMT-2’ - 三异丙基硅 烷氧基甲基 (TOM)-5’ -CED 亚磷酰胺基团 ( 结构 18)。
其中 B ＝ A(N-Bz)， C(N-Bz)， C(N-Ac)， G(N-iBu)， A(N-tBPac)， C(N-tBPac)， C(N-tBPac)， G(N-tBPac)， A(N-Pac)， C(N-Pac)， C(N-Pac)， G(N-Pac)， U. 结构 (16).3’ -DMT-2’ -tBD 甲硅烷基 -5’ -amidite ( 反向的 RNA-tBD 甲硅烷基 -amidite)
其中 B ＝ A(N-Bz)， C(N-Bz)， C(N-Ac)， G(N-iBu)， A(N-tBPac)， C(N-tBPac)， C(N-tBPac)， G(N-tBPac)， A(N-Pac)， C(N-Pac)， C(N-Pac)， G(N-Pac)， U. 结构 (17).3’ -DMT-2’ -tBD 甲硅烷基 -5’ -CPG ( 反向的 RNA-tBD 甲硅烷基 -5’ -Icaa CPG)结构 (18).3’ -DMT-2’ -TOM( 三异丙基甲硅烷基氧亚甲基 )-5’ -amidite
( 反向的 RNA-TOM-5’ -amidite)
本发明还教导了用于制备所公开的组合物的方法。开始， 碱保护的核苷 19 提供由 异亚丙基保护的核苷 20。进行苯甲酰基化后除去异亚丙基基团， 生成 5’ - 苯甲酰基化的核 苷 22。随后在吡啶中与 TBDMS 氯的连续甲硅烷化反应生成 2’ 和 3’ -TBDMS 保护的核苷 (23 和 24)， 比例相应地为 3 ∶ 2。在柱层析之后， 异构体以％的收率再溶解并分离。异构体 23 的进一步反应生成 3’ -DMT-2’ -TBDMS 保护的核苷 26。
因此， 在随后 3’ - 羟基的官能化过程中， 可以想象到 2’ -tBd 甲硅烷基有显著的迁 移
方案 (1)
在 3’ - 羟基基团使用 DMT-(4， 4- 二甲氧基三苯甲基 ) 的官能化过程中， 没有观 察到显著的迁移的发生。此外， 和异构体 23 与 DMT 氯在吡啶中一样， 3’ -TBDMS 保护的异 构体 24 也牵涉到同一三苯基化反应中， 然而在那个反应中， 没有观察到核苷 25。因此， 在 2’ -TBDMS 保护的核苷 23 被其异构体 24 污染的情况下， 在三苯基化的条件下不能形成不想 要的异构体 25， 并且可以以高纯度分离出想要的核苷 26。3’ -TBDMS 保护的核苷 24 可以被 用于
希望产物的合成中， 并且依据方案 1 中所示的异构化过程转化为 23。
在甲醇中使用氢氧化钠去除 5’ - 苯甲酰基基团之后， 使用 CEDP 和 DIPA 四氮唑的 磷化反应来提供最终反向的亚磷酰胺 16。
四氮唑的磷化反应来提供最终反向的亚磷酰胺 16。
其中 B ＝ a)A(N-Bz)， b)C(N-Bz)， c)C(N-Ac)， d)G(N-iBu) e)A(N-tBPac)， f) C(N-tBPac)， g)G(N-tBPac)， h)A(N-Pac)， i)C(N-Pac)， j)G(N-Pac)， k)U。 方案 (2) 在 5’ → 3’ 方向上， 使用反向亚磷酰胺进行寡核苷酸的合成。随后给出的实施例进一步地说明本发明 ； 这些实施例仅是说明性的， 并不以任何 方式解释来限制本发明的范围。具体地， 以下的实施例阐释了用于获得本发明化合物的合 成方法。制备本发明化合物及其中间体的有用的起始材料是商业上可获得的， 或者可以通 过商业上可获得的材料并使用已知的合成方法和试剂来制备。 所有的寡核苷酸序列按照从 左侧的 5’ - 末端到右侧的 3’ - 末端的方式来书写。3’ -DMT-5’ -CED 亚磷酰胺的偶合效率显 示出每步的偶合超过 99％， 生成高纯度的 RNA。使用这些单体磷酰胺 (phosphoramidfite) 合成了大量的均聚物以及 20-21 个单体的寡核苷酸。通常的数据示于图 (8) 中。
我们的数据显示， 与标准的 3’ -CED 亚磷酰胺相比， 在 3’ → 5’ 方向上合成相比， 使 用反向 RNA 单体 ( 用于 5’ → 3’ 方向 ) 在偶合效率上没有区别 ( 参见图 9 和 10)。
在本发明的另一个实施方案中， 提供了用于合成在寡核苷酸的 3’ - 末端具有修饰 或者标记的核苷酸寡聚物的合成方法。需要脂类的、 长链的配体或者发色团荧光团或者淬 灭团的 3’ - 末端修饰的 RNA 的合成可以使用相应的亚磷酰胺进行操作。如图 11 和 12 所 示， 我们的数据显示出 5’ → 3’ 方向上的合成远胜过传统方法。
除此之外， 在诸如 HEG 或者 PEG-2000 之类的固体载体上不可用的 3’ 修饰可以通 过使用 5’ → 3’ 方向的合成来轻松引入， 并通过反相 HPLC 来纯化。通过 RP HPLC 纯化了寡 核苷酸 SEQ ID No 4 提供了 95-98％纯度的产物 ( 参见图 15)。 实施例 1
如方案 2 所示的 N2- 异丁酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 鸟苷 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚磷酰胺 (16d) 的合成
N2- 异丁酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT-5’ -O- 苯甲酰基 - 鸟苷 (26d) ： 在室温下在 48 小时内， 一次性向 60mL 的 4g(7.0mmol) 化合物 23d 的吡啶溶液中加入 9.5g(28.0mmol) 的 DMT 氯化物。将反应混合物使用 2mL 的冷乙醇冷却， 随后将一半溶剂在减压下去除， 并与 20mL 的氯仿混合， 使用 50mL 的饱和碳酸氢钠和 50mL 的盐水洗涤。将有机层分离 并在无水的 Na2SO4 上干燥。使用 5 ∶ 2 ∶ 3 的氯仿 / 己烷 / 丙酮进行快速层析， 得到 1.7g(27.8％ ) 的化合物 26d。TLC 系统 ： 5 ∶ 2 ∶ 3 氯仿 / 己烷 / 丙酮， Rf ＝ 0.42。ESMS + 896.1[C48H55N5O9Si(M+Na) 要求 896.1]。
N2- 异丁酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 鸟苷 (27d) ： 在 0-5 ℃的温度下在 25 分 钟时间内， 在搅拌下向 14g(16.0mmol) 的化合物 26d 的 196mL 吡啶和 21mL 的甲醇混合物 的溶液中逐滴加入 16mL 的 2M 的氢氧化钠水溶液。将反应混合物用 25mL 的 2M HCl 中和。 将溶剂在减压下去除， 并将剩余的使用 25mL 氯仿萃取两次。将有机层合并， 使用 50mL 的 盐水洗涤并在无水的 Na2SO4 上干燥。使用 5 ∶ 2 ∶ 3 的氯仿 / 己烷 / 丙酮进行快速层析， 得到 10.4g(84.3 ％ ) 的化合物 26d。1H NMR(CDCl3/D2O)-0.54(s， 3H)， 0.01(s， 3H)， 088(s， 9H)， 1.21(d， 3H， J ＝ 7.0Hz)， 1.23(d， 3H， J ＝ 7.0)， 2.66(qq， 1H， J ＝ 7.0)， 2.89(d， 1H， J＝ 12Hz)， 3.28(s， 1H)， 3.37(dd， 1H， J5a， J5， 6H)， 4.24(d， 1H， J＝ 5b ＝ 15Hz， 4 ＝ 2.5Hz)3.80(s， 5Hz)， 4.83(dd， 1H， J2， J2， 5.97(d， 1H， J ＝ 8Hz)， 6.84(dd， 4H， J ＝ 9Hz， J＝ 1 ＝ 8Hz， 3 ＝ 5Hz)， 2Hz)， 7.23(t， 1H， J ＝ 7.5Hz)， 7.30(t， 2H， J ＝ 7Hz)， 7.45(m， 4H)， 7.59(d， 2H， J ＝ 7.5Hz)， + 7.77(s， 1H)。ESMS 792.8[C41H51N5O8Si(M+Na) 要求 792.9]。
N2- 异丁酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 鸟苷 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚磷 酰胺 (16d) ： 在室温下且在氩气中， 向 10.4g(13.5mmol) 的化合物 27， 3.4g(26.12mmol) 的
乙基硫代四唑、 4.7mL(27mmol) 的 DIPEA 和 1.08mL(13.5mmol) 的 N- 甲基咪唑在 104mL 乙 腈溶液中边搅拌边逐滴加入 8.4mL(26.12mmol) 的 2- 氰乙基 -N， N， N， N- 四异丙基膦。在 3 小时后， 将反应混合物用 100mL 乙酸乙酯稀释， 并使用 200mL 的饱和碳酸氢钠和 200mL 盐 水洗涤。将有机层分离， 并用 2g 的无水 Na2SO4 干燥。使用 7 ∶ 2 ∶ 1 的氯仿 / 己烷 / 丙酮 进行快速层析， 得到 12g(92.1％ ) 的化合物 16d。31P NMR(CDCl3)149.05 和 149.73。ESMS 993.3[C50H68N7O9PSi(M+Na)+ 要求 993.2]。
实施例 2
N4- 乙酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 胞啶 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚磷酰 胺 (16c) 的合成
N4- 乙酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 胞啶 (27c) ： 在 0-5 ℃的温度下， 在 25 分钟 内， 向 5g(6.2mmol) 的化合物 26c 的 54mL 吡啶和 6mL 甲醇的混合物的溶液中， 边搅拌边逐 滴加入 6.2mL 的 2M 的氢氧化钠水溶液 (12.4mmol)。将反应混合物使用 6mL 的 2M HCl 中 和。将溶剂在减压下去除， 并将残余使用 15mL 的氯仿萃取两次。将有机层合并， 用 50mL 盐水洗涤并在无水 Na2SO4 上干燥。使用 5 ∶ 2 ∶ 3 的氯仿 / 己烷 / 丙酮进行快速层析， 得到 1.7g(27.8 ％ ) 的化合物 27c。1H NMR(CDCl3/D2O)， 0.07(s， 3H)， 0.16(s， 3H)， 0.97(s， 9H)， 2.24(s， 3H)， 3.16(br.d， 1H， J5a， 3.55(br.d， 1H， J5a， 5b ＝ 12Hz)， 5b ＝ 12Hz)3.79(s， 6H)， 4.08(t， 1H， J ＝ 4.5Hz)， 4.44(b r.s.， 1H)， 4.78(br.s.， 1H)， 5.61(d， 1H， J ＝ 4.1)， 6.80(dd， 4H， J ＝ 7Hz， J ＝ 3Hz)， 7.22(t， 1H， J ＝ 7.5Hz)， 7.27(t， 2H， J ＝ 7Hz)， 7.38(m， 4H)， + 7.52(d， 2H， J ＝ 7.3Hz)， 8.08(br.s， 1H).ESMS 724.8[C38H47N3O8Si(M+Na) 要求 724.3]。 4
N - 乙酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 胞啶 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚 磷酰 2 胺 (16c) ： 与 N - 异丁酰基 -2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 鸟苷 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚 31 磷酰胺 (16d) 的制备类似。收率为 62.6％。 P NMR(CDCl3) 的 δ 为 149.1 和 149.5。ESMS 925.0[C47H64N5O9PSi(M+Na)+ 要求 924.4]。
实施例 3
2’ O-TBDMS-3’ -O-DMT- 尿苷 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚磷酰胺 (16k) 的合 成
2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 尿 苷 (27k) ： 在 0-5 ℃ 的 温 度 下， 在 25 分 钟 内， 向 30g(39.3mmol) 的化合物 26k 在 450mL 吡啶和 45mL 甲醇混合物的溶液中逐滴加入 40mL 的 2M 氢氧化钠水溶液 (80.0mmol)。 将反应混合物使用 40mL 的 2M HCl 中和。 将溶剂在减压下 去除， 并将残余使用 50mL 的氯仿萃取两次。将有机层合并， 使用 50mL 的盐水洗涤并在无水 Na2SO4 上干燥。使用 6.5 ∶ 2 ∶ 1.5 的氯仿 / 己烷 / 丙酮进行快速层析， 得到 24g(92.5％ ) 1 的 化 合 物 9k。 H NMR(CDCl3)， 0.06(s， 3H)， 0.14(s， 3H)， 0.97(s， 9H)， 2.12(br.d， 1H， J＝ 4Hz)， 3.16(br.dd， 1H， J5a， J5a4 ＝ 7.6Hz)， 3.55(br.d， 1H， J5a， 5b ＝ 12.7Hz， 5b ＝ 12.7Hz J5b4 ＝ 4.3Hz)3.65-3-64(m， 1H)3.79(s， 6H)， 4.07(t， 1H， J ＝ 4.3Hz)， 4.28(t， 1H， J ＝ 4.3Hz)， 5.66(d， 1H， J ＝ 4.9Hz)， 5.69(d， 1H， J ＝ 8.1Hz)， 6.82(dd， 4H， J ＝ 7Hz， J ＝ 3Hz)， 7.22(t， 1H， J ＝ 7.5Hz)， 7.28(t， 2H， J ＝ 7Hz)， 7.38(d， 4H， J ＝ 8.9Hz)， 7.54(d， 2H， J ＝ 8.8Hz)， + 7.68(d， 1H， J ＝ 8.2)， 8.74(br.s， 1H)。ESMS[C36H44N2O8Si(M+Na) 要求 683.3]。
2’ O-TBDMS-3’ -O-DMT- 尿核苷 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚磷酰胺 (16k) ： 向 24.0g(36.4mmol) 的化合物 27k， 24mL(182mmol) 的三甲基吡啶， 2.88mL of N- 甲基咪唑在 190mL THF 的溶液中在氩气保护下， 室温搅拌下逐滴加入 16.22mL(72.8mmol) 的 2- 氰乙 基 -N， N， 二异丙基膦酰胺氯。1.25 小时之后， 将反应混合物使用 100mL 乙酸乙酯稀释， 并使 用 200mL 的饱和碳酸氢钠以及 200mL 食盐水洗涤。将有机层分离并在 20g 无水 Na2SO4 上干 燥。使用 5 ∶ 4 ∶ 1 的乙酸乙酯 / 己烷 / 三乙胺进行快速层析， 得到 18g(80％ ) 的化合物 31 16k。 P NMR(CDCl3)148.9 和 149.6。ESMS 884.1[C45H61N4O9PSi(M+Na)+ 要求 884.0]。
实施例 4
N4- 苯甲酰基 -2’ O-TBDMS-3’ -O-DMT- 腺苷 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚磷 酰胺 (16a) 的合成
在 0-5℃的温度下， 在 25 分钟内， 向 14g(15.7mmol) 化合物 26a 的 189mL 的吡啶和 21mL 甲醇的混合物溶液中， 边搅拌边逐滴加入 15.7mL 的 2M 的氢氧化钠水溶液。将所述反 应混合物使用 12mL 的 2MHCl 中和。将溶剂在减压下去除， 并将残余使用 25mL 的氯仿萃取 两次。将有机层合并， 使用 50mL 的盐水洗涤并在无水 Na2SO4 上干燥。使用 6.5 ∶ 2 ∶ 1.5 的氯仿 / 己烷 / 丙酮进行快速层析， 得到 11.0g(88.9％ ) 的化合物 27a。收率以％计。1H NMR(CDCl3/H2O)δ-0.75(s， 3H)， -0.01(s， 3H)， 0.86(s， 9H)， 3.03(t， 1H， J5a， 5b ＝ 12.8Hz)， 3.29(s， 1H)， 3.47(br.d， 1H， J5a， 6H)， 4.35(d， 1H， J ＝ 4.9Hz)， 5.17(dd， 5b ＝ 12.8Hz)3.80(s， 1H， J ＝ 8Hz， J ＝ 5Hz)， 5.93(dd， 1H， J ＝ 12Hz， J ＝ 2Hz)， 6.15(d， 1H， J ＝ 8Hz)， 6.85(dd， 4H， J ＝ 7Hz， J ＝ 3Hz)， 7.23(t， 1H， J ＝ 7.5Hz)， 7.30(t， 2H， J ＝ 7Hz)， 7.48(m， 4H)， 7.52(t， 2H， J ＝ 7.3Hz)， 7.62(d， 3H， J ＝ 7.5Hz)， 8.03(d， 2H， J ＝ 7.5Hz)， 8.14(s， 1H)， 8.77(s， 1H)， + 9.07(s， 1H)。ESMS[C44H49N5O7Si(M+Na) 要求 787.3]。
N4- 苯甲酰基 -2’ O-TBDMS-3’ -O-DMT- 腺苷 -5’ - 氰乙基 -N， N- 二异丙基 - 亚磷 酰胺 (16a) ： 在室温下， 在氩气保护下， 向 11.0g(12.0mmol) 的化合物 27a、 9.2mL(60.0mmol) 的 三 甲 基 吡 啶、 1.1mL 的 N- 甲 基 咪 唑 在 88mL 经 蒸 馏 的 THF 中 的 溶 液 中 逐 滴 加 入 6.23mL(24.0mmol) 的 2- 氰乙基 -N， N- 异丙基膦酰胺氯。1.25 小时之后， 将反应混合物 使用 50mL 乙酸乙酯稀释， 并使用 100mL 的饱和碳酸氢钠以及 100mL 盐水洗涤。将有机 层分离并在 10g 无水 Na2SO4 上干燥。使用 5 ∶ 4 ∶ 1 的乙酸乙酯 / 己烷 / 三乙胺进行 快 速 层 析， 得 到 9.0g(77.7 ％ ) 的 化 合 物 16a。31P NMR(CDCl3)143.97and 144.14。ESMS 987.2[C53H66N7O8PSi(M+Na)+ 要求 987.45]。
结 构 3’ -O-DMT-2’ -O-TBDMS 核 苷 27a、 27c、 27d、 27k、 16a、 16c、 16d、 16k 和 1 5’ -O-DMT-2’ -O-TBDMS 核苷 28-31 的 H NMR 数据比较
表 1. 结构 27d、 16d 和结构 28 的 1H NMR 数据比较
表 2. 结构 27c、 16c 和结构 29 的 1H NMR 数据比较
表 3.27k、 16k 和结构 30 的 1H NMR 数据比较
表 4. 结构 27a， 16a 和结构 31 的 1H NMR 数据比较实施例 5
2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 尿苷 -5’ - 琥珀酰 -CPG 的合成
2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 尿苷 -5’ - 琥珀酸酯 ： 在 37 ℃下， 向 2.0g(3.03mmol) 化 合物 27k 和 0.11g(0.91mmol)DMAP 在 20mL 吡啶的溶液中， 边搅拌边加入 0.9g(9.1mmol) 琥 珀酸酐。在 12 小时之后， 将反应混合物使用 30mL 氯仿稀释， 并使用 50mL 盐水洗涤。将有 机层分离并在无水 Na2SO4 上干燥。使用 5 ∶ 3 ∶ 2 ∶ 0.01 ∶ 0.05 的氯仿 / 己烷 / 丙酮 / 吡啶 / 甲醇进行快速层析， 得到 1.8g(75.9％ ) 的 2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 尿苷 -5’ -琥 1 珀酸酯。 H NMR(CDCl3/D2O)， 0.05(s， 3H)， 0.07(s， 3H)， 0.96(s， 9H)， 2.21(dt， 1H， J ＝ 17Hz， J ＝ 6Hz)， 2.40-2.46(m， 1H)， 2.51(dt， 1H， J ＝ 17Hz， J ＝ 6Hz)， 2.60-2.66(m， 1H)， 3.42(t， 1H， J ＝ 3.3Hz)， 3.77(s， 6H)， 3.95-3.98(m， 2H)， 4.11(br.d， 1H， J ＝ 12.8Hz)， 4.16(m， 1H)， 5.72(d， 1H， J ＝ 2.8Hz)， 5.74(d， 1H， J ＝ 8.1Hz)， 6.79(dd， 4H， J ＝ 9Hz， J ＝ 1.9Hz)， 7.21(t， 1H， J ＝ 7Hz)， 7.25(t， 2H， J ＝ 7Hz)， 7.38(d， 4H， J ＝ 8.9Hz)， 7.48(d， 2H， J ＝ 7.2Hz)， 7.61(d， 1H， J ＝ 8.2Hz)， 7.72(t， 1H， J ＝ 5.9Hz)， 8.61(br.d， 1H， J ＝ 4.4Hz).ESMS + 784.2[C40H48N2O11Si(M+Na) 要求 783.9]。
2’ -O-TBDMS-3’ -O-DMT- 尿 苷 -5’ - 琥 珀 酰 -CPG ： 向 18g 的 氨 基 -lcca-CPG 和 3.6mL 的三乙胺在 60mL DMF 中的悬浮液中加入 1.8g(2.3mmol) 的 O-TBDMS-3’ -O-DMT- 尿 苷 -5’ - 琥珀酸酯、 0.408g(3.55mmol)N- 羟基琥珀酰胺和 0.586g(2.76mmol)DCC 在 4mL DMF 中的溶液。将反应混合物温热到 37℃。在 16 个小时后， 将 CPG 过滤， 使用 3x20mL 的乙腈洗 涤， 使用吡啶 /N- 甲基咪唑混合物中的乙酸酐封端， 并使用 3x20mL 的乙腈洗涤。 将固体载体 减压干燥， 并且通过 DMT 去除步骤测量核苷负载， 得到了 18g 的最终产物， 负载为 44.2mol/ g。
实施例 6
寡聚核苷酸的合成 ： 随后的寡核苷酸 ( 表 5) 使用 3’ → 5’ 方向的标准 RNA 亚磷酰 胺化学物， 以 1 微摩尔的规模进行合成。这些合成在 Expedite 8900 合成仪上， 使用标准的 RNA1 微摩尔循环进行。
在合成后， 将具有可控孔玻璃 (CPG) 的固体载体转移到 2mL 的离心管中。将寡核 苷酸从 CPG 上切除并通过在 1ml40％甲胺的水溶液中在 65℃下温育 30 分钟来脱保护。将 上层液体去除， 并将 CPG 使用 1mL 水洗涤 ； 将上清液冷却并干燥。通过使用 250μl 新制的 无水三乙胺 - 三氢氟化物在室温下的超声池中处理 2 小时， 将叔丁基 - 二甲基甲硅烷基保 护基从 RNA 残基上去除。 使用 1.5mL 的正丁醇沉降寡聚核苷酸 ； 将样品在 -70℃下冷却 1 小
时， 随后在 10,000g 下离心 10 分钟。将上清液转移， 将颗粒状物使用正丁醇再次洗涤。
随后利用线性梯度的 0.1M 三乙胺乙酸盐 (TEAA) 中的乙腈 (pH 为 7.2) 通过反相 HPLC 纯化寡核苷酸。 将整个样品装载到 Hamilton PRP-1 柱 (1.0cmx 25cm) 上， 并使用线性 梯度 5％至 50％的乙腈在 40 分钟内进行洗脱。在 260nm 处监控样品， 并采集与期待的寡核 苷酸种类相关的峰， 并收集并冻干。
将寡核苷酸样品溶解于 200ul 的无菌水中， 并通过添加 1ml 的 2％ LiClO4， 进行沉 淀， 随后在 10,000g 下离心 10 分钟。 将上清液转移， 将颗粒状物用 10％的丙酮水溶液洗涤。
使用了与在寡核苷酸合成中适用的固体载体相应的 dT 和胆固醇。
表 5. 通过传统方法合成的寡聚核苷酸序列
SEQ ID No ： 1 SEQ ID No ： 2
rCrArGrGrUrGrCrArGrArGrCrCrUrUrGrCrCrCTT rCrArGrGrUrGrCrArGrArGrCrCrUrUrGrCrCrCTT- 胆固醇随后的寡核苷酸 ( 表 6) 使用反向 5’ → 3’ 方向的亚磷酰胺化学物， 以 1 毫摩尔的 规模进行合成。在标准的过程中， 使用与反向的合成同样的合成周期和辅助试剂。在所有 的寡核苷酸合成中， 都使用反向 rC-lcaa-CPG。通过分别使用胆固醇、 PEG-2000 或 HEG 亚磷 酰胺， 在寡核苷酸 SEQ ID No.2-4 上进行 3’ 修饰。
表 6. 通过方向的方法合成的寡核苷酸序列
SEQ SEQ SEQ SEQ
ID ID ID ID No ： 1 No ： 2 No ： 3 No ： 4 rCrArGrGrUrGrCrArGrArGrCrCrUrUrGrCrCrCTT rCrArGrGrUrGrCrArGrArGrCrCrUrUrGrCrCrCTT- 胆固醇 rCrArGrGrUrGrCrArGrArGrCrCrUrUrGrCrCrCTT-PEG/2000 rCrArGrGrUrGrCrArGrArGrCrCrUrUrGrCrCrCTT-HEG将粗品寡核苷酸通过 CE 和 ESI 质谱进行分析。 由于容易在寡核苷酸的 3’ - 末端进行结合， 多种应用成为可能。一些实例在图 7中列出。 1. 用于在 RNA 的 3’ - 末端结合大的分子， 如胆固醇， 长链的脂肪族链如 C-18， 三甘 醇、 六甘醇。使用这些的 amidite 能够容易地实现直接的偶合。
2. 将聚乙二醇如 PEG 2000amidite 和 PEG 4000amidite 结合至 RNA 分子的 3’ -末 端。
3. 用于 3’ - 硫醇修饰的容易结合。从很容易得到的 amidite 得到 3’ - 二硫化物， 如 C-3 二硫化物、 C-6 二硫化物。
4. 通过生物素 adimite 一步结合 3’ - 生物素， 并避免为此目的使用生物素 CPG。
5. 在 siRNA 的有义链进行 3’ - 末端的修饰。希望对 siRNA 有义链的游离部分的 修饰 (3’ - 末端 ) 不影响到对靶 mRNA 的识别， 因为反义 siRNA 链引导靶识别。可以容易地 设计对于改善 siRNA 的输运有用的修饰。
表 3. 结构 27k、 28k 和式 8 的 1H NMR 数据比较
我们在随后的备注中总结了本发明中不同的新观念、 优点和可能性， 以及一些产 品和方法的细节。这个列表用作方便和说明性的总结， 并不是完整的、 全面的或者限制性 的。
●通式 1 的衍生的核苷和亚磷酰胺 ：
其中
Y 为氧或者硫 ；
W 为氧、 氮、 硫或氟 ；
当 W 不为硫时， R4 为甲硅烷基醚如 TBDMS， 三异丙基甲硅烷基氧亚甲基， Fmoc， 烷 基， 芳基或者乙酰基 ； 而当 W 为硫时， R4 为苯甲酰基、 乙酰基或者二硫化物
Z 为 DMT、 MMT、 TMT 保护基 ；
R1 和 R2 独立地选自烷基或者芳基基团 ；
R3 为氰乙基、 烷基或者芳基。
●通式 2 衍生的核苷结合至固体载体 ：
其中
M 为氢自由基或者 Y-CO- ；
Y 为长度为从 2 至 20 的原子链， 其基本上任选地由一个或者多个杂原子取代的烃 链组成， 所述杂原子选自氧、 氮和硫， 或者任何适用于将其连接至固体载体的连接体， 所述 固体载体如 CPG、 聚苯乙烯或者任何其它适用于寡核苷酸合成的固体载体 ；
W 为氧、 氮、 硫或者氟 ；
当 W 不为硫时， R 为甲硅烷基醚如 TBDMS， 异丙基甲硅烷基氧亚甲基， Fmoc， 烷基， 芳 基， 氨基或者乙酰基 ； 而当 W 为硫时， R 为苯甲酰基、 乙酰基或者二硫化物 ；
Z 为 DMT、 MMT、 TMT 保护基。
在合成的 RNA 寡聚物中， 用于反向， 通过寡核苷酸键形成的 5’ 至 3’ 方向的方法， 所述键形成显示于式 10。RNA 可以由天然的和修饰的核苷碱基、 间隔基团 (gapmers)、 磷酸 二酯、 硫代磷酸、 磷酸硒组成。合成可以在自动的、 半自动的 DNA/RNA 或者其它合成仪上进 行或者人工进行。该合成可以在毫克至千克的规模上进行。
使用相应的亚磷酰胺 ( 式 11) 将修饰结合至 RNA 分子的 3’ - 末端的方法其中 L 为 如生物素或者胆固醇之类的修饰， 或者选自荧光团、 淬灭染料、聚乙二醇和肽。
使用反向 (5’ → 3’ )RNA 合成来进行自动高纯度 RNA 合成， 得到高纯度的 RNA。 具有大分子的 RNA 3’ - 偶联物， 所述大分子如胆固醇、 六甘醇 (HEG) 和聚乙二醇(PEG)。 在反向 (5’ → 3’ ) 上的自动 RNA 的合成的应用， 导致不存在 M+1 寡核苷酸杂质。
通过上述方法引入的经修饰的核苷可以由一个或多个嘌呤或者嘧啶的修饰组成， 例如但不限于， 5- 氟 -U、 5- 氟 dU、 5- 氟 -dC、 5- 氟 -rC、 假尿苷、 5- 甲基 -dU、 5- 甲基 -rU、 5- 甲 基 -dC、 5- 甲 基 -rC、 5- 溴 -dU、 5- 溴 -rU、 5- 溴 -dC、 5- 溴 -rC、 5- 碘 -dU、 5- 碘 -rU、 5- 乙烯基 -dU、 5- 乙烯基 -rU、 5- 乙烯基胸苷、 N-3 甲基脱氧尿核苷、 N-3 甲基尿核苷、 N-3 甲 基胸苷、 4- 硫代尿苷、 4- 硫代 -2’ - 脱氧尿苷、 2， 6- 二氨基嘌呤脱氧核苷、 N-3 甲基胸苷、 2， 6- 二氨基嘌呤核苷、 8- 溴 -2’ - 脱氧腺苷、 8- 溴 -r- 腺苷、 8- 氧 - 脱氧腺苷、 8- 氧 - 核糖腺 苷、 8- 氧 -2’ - 脱氧 - 腺苷、 8- 氧 - 核糖腺苷、 8- 氧 - 脱氧肌苷、 8- 氧 - 核糖肌苷、 8- 溴 - 脱 氧肌苷、 8- 溴 - 核糖肌苷、 N-1 甲基 - 核糖腺苷、 N-1 甲基 -2’ - 脱氧腺苷、 N-1 甲基 2’ -脱 氧肌苷、 N-1 甲基核糖腺苷、 N-1 甲基脱氧鸟苷、 N-1- 甲基 - 核糖鸟苷、 亚乙烯基腺苷、 亚乙烯 基 2’ - 脱氧腺苷、 嘌呤 2’ - 脱氧核苷、 嘌呤 - 核糖核苷、 2- 氨基嘌呤 -2’ - 脱氧核苷、 2- 氨 基嘌呤 - 核糖核苷。
通过这种方法合成的 RNA 在内部位置的标记可以通过发色团来实现， 所述发色 团， 例如但不限于， 荧光团 -C-5dT、 Dabcyl-C-5 胸苷、 内部的羧基基团 5-dU- 甲基丙烯酸酯、 生物素 dT( 生物素通过间隔结合至 dU 的 C-5)、 氨基 -dT( 端氨基通过 C-6 间隔结合至 dU 的 C-5)。
经修饰的核苷的糖修饰可以由位于按本发明的方法合成的 RNA 或者 DNA 序列的 一个或者多个位置上的 2’ - 脱氧 -2’ - 氟核糖核苷 (2’ -F-ANA)， 如 A、 C、 G、 U、 肌苷和含有 2’ - 氟的修饰的核苷组成。
经修饰的核苷的糖修饰可以由位于按本发明的方法合成的 RNA 或者 DNA 序列的一 个或者多个位置上的 2’ - 脱氧 -2’ - 甲氧基核糖核苷 (2’ -OMe-) 如 A、 C、 G、 U、 肌苷和含有 2’ - 甲氧基的修饰的核苷组成。
经修饰的核苷的糖修饰可以由位于按本发明的方法合成的 RNA 或者 DNA 序列的 一个或者多个位置上的 2’ - 脱氧 -2’ - 氨基核糖核苷 (2’ -NH2) 如 A、 C、 G、 U、 肌苷和含有 2’ - 氨基的修饰的核苷组成。
经修饰的核苷的糖修饰可以由位于按本发明的方法合成的 RNA 或者 DNA 序列的一 个或者多个位置上的 2’ - 脱氧 -2’ - 末端氨基核糖核苷 (2’ - 末端 NH2) 如 A、 C、 G、 U、 肌苷 和含有 2’ - 末端氨基的修饰的核苷组成。
经修饰的核苷的糖修饰可以由位于按本发明的方法合成的 RNA 或者 DNA 序列的一 个或者多个位置上的 2’ - 脱氧 -2’ - 甲氧基乙氧基核苷 (2’ -MOE) 如 A、 C、 G、 U、 肌苷和含 有 2’ -MOE 的修饰的核苷组成。
经修饰的核苷的糖修饰可以由位于按本发明的方法合成的 RNA 或者 DNA 序列的一 个或者多个位置上的其它的 2’ -O- 烷基基团， 如 2’ - 脱氧 -2’ - 乙氧基、 炔丙基、 丁炔核糖 核苷 (2’ -OEt、 O- 炔丙基、 2’ -O- 丁炔 )， 如 A、 C、 G、 U、 肌苷和含有 2’ -2’ -OEt、 O- 炔丙基、 2’ -O- 丁炔修饰的核苷组成。
经修饰的核苷的糖修饰可以由位于按本发明的方法合成的 RNA 或者 DNA 序列的一 个或者多个位置上的其它的 2’ - 脱氧 -2’ - 氟阿拉伯糖核苷 (2’ -F-ANA)， 如 A、 C、 G、 U、 肌 苷和含有 2’ -F-ANA 的修饰核苷组成。 经修饰的核苷的糖修饰可以由位于按本发明的方法合成的 RNA 或者 DNA 序列的一 个或者多个位置上的其它的 2’ - 脱氧 -2’ - 氟 -4’ - 硫代阿拉伯糖核苷 (4’ -S-FANA)， 如 A、 C、 G、 U、 肌苷和含有 4’ -S-FANA 的修饰核苷。
所述 RNA 可以在序列中具有一个或者多个的 2’ -5’ 连接体， 所述连接体位于序列 的 3’ - 末端或者 5’ - 末端。
含有 3’ - 末端的 RNA 可以通过本发明的方法合成， 所述 RNA 包含通过其 3’ - 羟基 官能团结合来反向结合的脱氧核苷如 dT、 dC、 dG、 胸苷。
含有 3’ - 末端的 RNA 可以通过本发明的方法合成， 所述 RNA 包含通过其 2’ 或 3’ -羟 基官能团结合来反向结合的脱氧核苷如 rA、 rC、 rG、 rU。
反向的 RNA 合成可以由含 2’ - 三异丙基甲硅烷氧基甲基 (TOM) 保护基的形式来实 现。
反向的 RNA 合成可以由含 2’ - 叔丁基二硫代甲基 (DTM) 保护基的形式来实现。
反向的 RNA 合成可以由含修饰的碱基的形式实现， 所述修饰的碱基包含 2’ -脱 氧 -2’ - 氟 -β-D- 阿拉伯树胶酸核酸 (FANA)。
反向的 RNA 合成可以由含修饰的碱基的形式实现， 所述修饰的碱基包含 4’ -硫 代 -2’ - 脱氧 -2’ - 氟 -β-D- 阿拉伯树胶酸核酸 (4’ - 硫代 -FANA)。
反向的 RNA 合成可以由含通过 2’ -O 甲基修饰的经修饰的糖形式来实现。
反向的 RNA 合成可以通过使用双环锁定的核酸 (LNA) 来实现。
反向的 RNA 合成可以使用包含经寡核苷酸 (ANA) 修饰的阿卓糖的经修饰的糖。
反向的 RNA 合成可以包括以下步骤 ： 通过疏水性基团上的 amidite 官能团或者通 过在具有末端氨基基团的反向合成的寡核苷酸的 3’ - 末端氨基连接体来在 3’ - 末端将亲 脂性或疏水性基团偶联。后述的合成包含在寡核苷酸的 3’ - 末端的氨基与亲脂性部分的羧 基官能团之间的偶联步骤。 所述亲脂性部分由多种二醇和脂类组成， 所述二醇如三甘醇、 六
甘醇、 聚乙二醇。
反向的 RNA 合成可以包括肽偶联的步骤。所述肽如细胞渗透性的肽 (CPP) 或者膜 通透性的肽 (MPP)， 其中使用这样的肽的游离胺官能团和反向合成的 RNA 的 3’ - 末端羧基 官能团。可以将具有合适的羧基官能团的 CPP 和 MPP 偶联到反向合成的 RNA 的 3’ - 末端的 游离氨基官能团上。
反向的 RNA 合成在序列中， 在序列的 3’ - 末端或者 5’ - 末端上包含 2’ -5’ - 连接 的 DNA 单元或者 2’ -5’ - 连接的 RNA 单元。
本领域技术人员仅仅使用了常规的实验就会认识到或者能够确定本文所描述本 发明的具体实施方案的各种等同方式。这样的等同方式意在被随后的权利要求所覆盖。在 从属权利要求中所公开的实施方案的任意组合也期待被包含在本发明的范围内。