硫醇的制备方法 本发明涉及通过生物转化制备硫醇，特别是天然调味剂硫醇的方法。
硫醇属于含硫的挥发性物质，据认为它可使不同的肉类如鸡肉、牛肉和猪肉具有肉香特征，或者它也是咖啡香料的组分。
肉味香料一般是在高温下，在作为硫来源的含硫化合物(例如半胱氨酸)存在下(在有或没有脂肪存在下)，由还原性糖和氨基酸经一段时间的热反应而制成的。该反应会将芳香族物质的复杂混合物引入肉味香料组合物中。
本发明的目的是提供通过生物转化获得的天然硫醇，它们可以用作食品的调味成分。
从例如US-A-5182194中已知某些不能用于食品的微生物能提供β-C-S裂解酶，该酶可由半胱氨酸S-配合物产生硫醇。
本发明的方法的特征在于：将下式的半胱氨酸S-配合物与可用于食品中地、具有β-C-S-裂解酶类型的酶活性的微生物相接触：其中R1是H、C1-7的直链或支链烷基、苯基、苄基、2-R2-2-R3-乙烯基、5-R2-呋喃-2-基、5-R2-噻吩-2-基，R2和R3可相同或不同，且代表H或CH3，R4是H，或与R1形成2-R5-5-R6-四氢呋喃-3-亚基或2-R5-5-R6-2，3-二氢呋喃-3-亚基基团，其中R5和R6可相同或不同，且代表H或CH3，或者R4是CH(OH)R7基团，并且R7代表H、C1-4的烷基或苯基，R8、R9和R10可相同或不同，且代表H或C1-4的烷基，R11代表H、C1-4的烷基、苯基、C1-4的烷氧基，或C1-4的烷氨基，并且n是0或1。
在本发明的上下文中，具有C1-7的R1基团优选是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、正己基或正庚基。
R8至R10基团优选是H或甲基，并且R11优选是甲基、乙基、苯基、甲氧基、乙氧基、甲氨基或乙氨基。
在β-C-S-裂解酶的作用下，该配位化合物的半胱氨酰基从羧基末端的β位断裂，从而产生相应的硫醇。
当n是0时，通过β-C-S-裂解酶作用形成的化合物是α-巯基醛、α-巯基酮、α-巯基酯或α-巯基酰胺。
当n＝1时，通过β-C-S裂解酶作用形成的化合物是β-巯基醛、β-巯基酮、β-巯基酯或β-巯基酰胺。
经β-C-S-裂解酶作用形成的优选化合物是糠基硫醇(FFT)、苄硫醇、5-甲基糠基硫醇、2-甲基呋喃-3-硫醇、2，5-二甲基呋喃-3-硫醇、2-甲基-四氢呋喃-3-硫醇和3-甲基-2-丁烯-1-硫醇。
这些化合物大大有助于肉味、鸡肉味、牛肉味和猪肉香味的产生，也包括有关呋喃硫醇和3-甲基-2-丁烯-1-硫醇的咖啡香味的产生。
已发现前述的优选化合物可经部分代谢生成糠甲基硫化物(Me-FFT)，S-糠基硫代乙酸酯(Ac-FFT)和二糠基-二硫化物(Di-FFT)。这些代谢产物也具有特征性的肉香，并且也有助于香味的产生。
本发明的微生物包括那些可用于食品中并具有β-C-S裂解酶类酶活性的微生物。
优选的是酵母和丝状真菌或霉菌。酵母中特别涉及发面酵母、啤酒酵母、以及例如酒酵母和假丝酵母(Candida versatilis)、汉森酵母、bayanus酵母和鲁酵母(Saccharomyces rouxii)。丝状真菌中特别涉及例如米曲霉(Aspergill us oryzae)，罗奎福特(roqueforti)青霉和卡门培尔(camemberti)青霉。
可在本发明中用作生物转化基质的半胱氨酸配合物可在室温下，在水-乙醇介质中将半胱氨酸与式R1-CHO或R1，R4-CO的醛或酮，或者式CR8，R9＝(CR10)nCOR11的酮、酯或酰胺或α、β-不饱和化合物(其中R1-R11的定义如前所述)反应而方便地得到。
在可使微生物的C-S-裂解酶活化的条件下进行微生物的培养反应。该反应可在厌氧或有氧条件下进行，优选在厌氧条件下，在温度为20-50℃、优选在约30℃下，pH6-9、优选pH7-8，并在介质经强烈搅拌的条件下反应5-72小时、优选12-48小时。基质的浓度，即培养介质中的配合物浓度为1-100mmol，并优选为20-40mmol。
尤其对于发面酵母，优选在厌氧条件下进行操作，例如在惰性气体如氮气条件下，以使发面酵母本身的代谢物和这些代谢产物的转化(例如氧化)产物减至最低程度，从而直接发酵产生硫醇。
可采用膏状或提取物形式的发面酵母。优选其是新鲜的，特别是在冷藏箱中保存0-18天的，更适用的是保存0-8天的。
可经一次或多次加入基质而进行培养，优选逐步加入基质，考虑到酶反应动力学，采用后一种方式不会抑制酶的活性。基于相同观点，认为增加基质的量和增加由其所产生的挥发性硫醇的提取，可以提高产率和酶解反应的反应率。为此，可将挥发性有机化合物附于载体(如树脂)上，然后再洗脱。也可在培养过程中，采用与水不混溶的溶剂(优选可食用级的，例如戊烷或己烷)在两相介质中提取该化合物。
经培养后，可采用溶剂(优选可食用级的，例如戊烷或己烷)提取硫醇，并且采用本领域技术人员所熟知的常规方法进行纯化。
另一种方式是可将上清液中所形成的硫醇提取和分离，例如经离心，然后可选择性地例如在固体载体(如麦芽糖糊精)存在下经喷雾干燥或冻干进行浓缩和干燥。可在温和条件下进行干燥，例如在真空条件下，温度＜70℃时进行。
本发明也涉及将前述反应所得的含有硫醇和其代谢物的产品用于食品中作调味组合物或增香剂的用途。
该食用香料可加入到人或动物食用的食品中。在本说明书中所述的可用于食品中的微生物应理解为任何可供人或动物食用的可食用级的微生物。
采用下列实施例说明本发明。这些实施例中除非特别指出，百分数和份数以重量计。实施例1-41.1发面酵母膏的制备
将含有22-28％固体(dry)物质的商购的发面酵母、啤酒酵母膏体经离心分离，并除去上清液。将沉淀物与0.1M pH7.5的磷酸盐缓冲水溶液混合。1.2半胱氨酸-糠醛配合物或2-(2-呋喃基)-1，3-噻唑烷-4-羧酸的制备
在反应器中将7.7g(63.6mmol)半胱氨酸溶于200ml 40％的乙醇的水溶液中。然后在搅拌下滴加溶于20ml乙醇的7g(72.9mmol)糠醛的溶液。搅拌该淡黄色溶液，1小时后可观察到出现沉淀。将反应器置于冰浴中1小时后，经过滤分离出沉淀，用2×50ml的乙醇洗涤，并经减压干燥。由此得到10.95g稍带白色的粉末状半胱氨酸—糠醛配合物，产率为86.5％。
经电子碰撞质谱法(MS/EI)和在二甲基亚砜中的质子核磁共振(1H-NMR)测定化合物的结构，结果表明存在比例为1∶2的两种顺/反式非对映异构体。1.3培养
将100ml前述的具有完整发面酵母细胞的膏体置于反应器中，该反应器加装有pH电极、冷凝器和转速为600rpm的磁力搅拌器。将该反应器置于恒温控制在30℃的油浴中。通过向反应器中加入2N的氢氧化钠水溶液以使pH值保持在选定值(6.9或8)。在厌氧试验中，通过冷凝器的出口管向该混悬液充入氮气15分钟，并使培养过程在氮气条件下进行。分别向该试样以及其它培养时间不同的5ml试样中加入0.4g(2mmol)和0.8g(4mmol)2-(2-呋喃基)-1，3-噻唑烷-4-羧酸。1、4生物转化结果分析
用2N盐酸水溶液将试样的pH调节至4，然后加入500微升苄硫醇的戊烷溶液(2000ppm)作内标物。加入3g氯化钠后，用3×15ml乙醚提取该试样，经离心(15分钟，5000rpm)将提取物从反应介质中分离出，合并萃取液加入硫酸钠进行干燥，并采用Vigreux柱将其浓缩至2ml，并将所得的浓缩溶液置于温度为-20℃的冷藏箱中待分析。
采用装有冷却注射器和火焰电离检测器的Carlo ErbaMega 2色谱仪(GC-FID)经气相色谱法进行分析。对硫化合物采用火焰光度检测器(GC-FPD)。毛细管柱为DB-5、DB-1701、DB-Wax和DB-FFAP，30m×0.32mm，膜厚度0.25微米，购自J & W Scientific，Folsom，USA 。用于GC-FID的载气是加有氮气(40KPa)的氦气(65KPa)。采用线性内推法计算保留指数(RI)。
在与操作GC-FID相同的条件下，将气相色谱仪与电子碰撞质谱仪(GC/EI-MS，HP5890/HP5971)相连，通过它们产生的光谱证实所进行的分析。
涉及有氧条件培养的主要的硫化合物的结果见下表11，而涉及无氧条件培养的见表2。
表1 化合物RI(DB-Wax)，FIDRI(DB-Wax)，FPDRI(FFAP)，FPDRI(DB5)，FPDFI(DB-1701)，FPD S-甲基硫代 乙酸酯 1037 1039 1048 - - S-乙基硫代 乙酸酯 1087 1088 1090 - - 硫代乙酸 - 1148 - - 713 二乙基二 硫化物 1208 1192 - - - 2-硫代-1- 乙醇 - 1502 1500 - - S-糠基-硫 代硫代乙 酸酯 2215 2217 - - - FFT 1434 1438 1437 908 1000 Me-FFT 1486 1487 1487 998 1091 Ac-FFT 1768 1769 1770 1159 1276 Di-FFT 2570 2570 2602 1690 1864 化合物RI(DB-Wax)，FIDRI(DB-Wax)，FPDRI(FFAP)，FPDRI(DB5)，FPDRI(DB-1701)，FPD FFT 1435 1440 1438 911 1000 Me-FFT 1487 1487 1487 998 1091 Ac-FFT 1768 1768 1769 1159 1276 Di-FFT - 2570 2600 1689 1864一：未测定
应注意有氧条件培养除产生了意料中的硫化合物(FFT，Me-FFT，Ac-FFT和Di-FFT)外，还产生了其它的硫化合物。这些其它的硫化合物可能是由半胱氨酸代谢得到的。
厌氧条件培养主要产生的是意料中的化合物。
下表3给出了FFT的产率，以初始配合物的百分数计算，以此作为培养条件的函数。实施例1-4中所采用的是保存4天的酵母。
表3实施例 1 2 3 4有氧条件 + - - -厌氧条件 - + + + pH 6.9 6.9 6.9 8基质浓度 (mmol) 20 20 40 20经(天)后FFT的产率 (％) 1 25.4 14 2.2 36.9 2 15 27.8 5 27.5 3 11 26 6 16 4 6 24 5 12 7 2 8 6 8实施例5
在与实施例2相同的条件下进行培养，除所采用的是保存8天的酵母。下表4给出了FFT和其代谢物的总产率及其各自的产率。
表4 产率 1天后 2天后 3天后 4天后 7天后 总值 8.1 16.5 17.4 18.1 16.6 FFT 6.2 15 14 12.5 13.2 Me-FFT - 0.5 0.5 1 0.5 Ac-FFT 1.9 1 1.9 2.6 0.5 Di-FFT - - 1 2 2.4一：未测定实施例6
在与实施例4相同的条件下进行培养，不同的是采用的是保存8天的酵母。下表5给出了FFT和其代谢物的总产率及其各自的产率。
表5 产率 1天后 2天后 3天后 4天后 7天后 总值 41 32 22 17 24 FFT 37 28 17 13 8 Ac-FFT 2 - - - - Di-FFT 2 4 5 4 16一：未测定实施例7
在与实施例2相同的条件下进行培养，不同的是采用了鲜酵母(0天)和保存了18天的酵母。为了对保存18天的酵母进行培养，该酵母应在4℃的冷藏器中保存。直到应用前，经离心除去磷酸盐缓冲溶液，并以相同的体积的新鲜缓冲液置换。下表6给出了FFT的产率：
表6 FFT产率(％) 1天后 2天后 3天后 4天后 7天后鲜酵母 1 16 24 - -保存18天的酵母 13 22 22.5 20 9一：未测定实施例8-10
按照实施例2的方法，培养下列配合物：8. 制得半胱氨酸-苯甲醛并将其生物转化得到苄基硫醇。9. 制得5-甲基-糠基-半胱氨酸并将其生物转化得到5-甲基-糠基硫
醇，和10、2-甲基-四氢呋喃基-半胱氨酸，从而得到2-甲基-四氢呋喃-3
-硫醇。实施例11至13
按照与实施例2中所采用的相同方法，通过培养下列微生物可得到由半胱氨酸-糠醛转化而成的FFT：11、假丝酵母12、汉森酵母13、bayanus酵母。