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1、(10)申请公布号 CN 102487901 A (43)申请公布日 2012.06.13 C N 1 0 2 4 8 7 9 0 1 A *CN102487901A* (21)申请号 201110400373.4 (22)申请日 2011.12.06 A01K 67/033(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (71)申请人华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人谢辉 徐春玲 焦春伟 赵传波 周万琴 王珂 (74)专利代理机构广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人杨晓松 裘晖 (54) 发明名称 利用无外源培养的空。
2、心菜离体根系单异体繁 殖根结线虫的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用无外源培养基培养的 空心菜离体根系单异体繁殖根结线虫的方法，该 方法包括以下步骤：(1)制备空心菜离体根系：将 空心菜种子接种到1水琼脂培养基平板上，待 种子萌发的根系长到3-4cm时，切取根尖，将根尖 接种到无外源离体根系培养基平板上，1520d 长出大量的离体根；(2)根结线虫的接种和培养： 将根结线虫卵囊制备成卵粒悬浮液接种在步骤 (1)的空心菜离体根上，培养5090d即可得到 大量单一的根结线虫。本发明方法繁殖率高、操作 简单、不易污染、应用范围广、实用性强，解决了难 以获得纯化的大量根结线虫的问题，且避免了盆。
3、 栽实生苗接种繁殖根结线虫方法的费时、占据大 量空间、受季节等自然和环境条件限制以及易被 其他生物污染等不足。 (51)Int.Cl. 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 2 页 1/2页 2 1.一种利用无外源培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结线虫的方法，其特征 在于包括以下步骤： (1)制备空心菜离体根系 将空心菜种子消毒、接种到1水琼脂培养基平板上；将1水琼脂培养基平板置于温 度为25、光照/黑暗时间为12h/12h的环境中培养，待种子萌发的根系长到3-4cm时，切 取根尖，将根。
4、尖接种到无外源离体根系培养基平板上，将无外源离体根系培养基平板置于 温度为25的黑暗环境中培养，1520d长出大量的离体根； (2)根结线虫的接种和培养 将根结线虫卵囊13个消毒后，制备成卵粒悬浮液接种在步骤(1)的空心菜离体根 上，将离体根置于温度为25、光照/黑暗时间为12h/12h的环境中培养5090d即可得 到根结线虫； 上述的操作均在无菌条件下进行。 2.根据权利要求1所述的利用无外源培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结 线虫的方法，其特征在于：步骤(1)所述的空心菜种子先要解除休眠；所述的解除休眠是将 空心菜种子用1(体积比)NaClO溶液浸泡5min，用无菌水清洗4-5次，再。
5、用无菌水浸泡 24h。 3.根据权利要求1所述的利用无外源培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结 线虫的方法，其特征在于：步骤(1)所述的将空心菜种子消毒是将解除休眠的种子用1 (体积比)NaClO溶液浸泡812min，然后用无菌水冲洗3-4次，最后将种子放在无菌滤纸 上晾干。 4.根据权利要求1所述的利用无外源培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结 线虫的方法，其特征在于：步骤(1)所述的无外源离体根系培养基其配方和配制方法为：大 量元素母液12.5ml、微量元素母液0.5ml、有机元素母液5ml、铁盐母液10ml、琼脂6-10g、蔗 糖40g，加蒸馏水定容至1L，将pH值调至6.4，1。
6、21下高温灭菌25min。 5.根据权利要求4所述的利用无外源培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结 线虫的方法，其特征在于： 所述的大量元素母液其成分为：KNO 3 19.00g、MgSO 4 7H 2 O 3.70g、NH 4 NO 3 16.50g、 KH 2 PO 4 1.70g、CaCl 2 2H 2 O 4.40g，加蒸馏水定容至1L； 所述的微量元素母液其成分为：MnSO 4 4H 2 O 22.30g、ZnSO 4 4H 2 O 8.60g、H 3 BO 3 6.20g、 KI0.83g、Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.25g、CuSO 4 5H 2 O 0.025g。
7、、CoCl 2 6H 2 O0.025g，加蒸馏水定容至 1L； 所述的有机元素母液其成分为：硫胺素0.005g、吡哆醇0.025g、烟酸0.025g、甘氨酸 0.1g、肌醇2.5g，加蒸馏水定容至1L； 所述的铁盐母液其成分为：Na 2 -EDTA 3.73g、FeSO 4 7H 2 O 2.78g，加蒸馏水定容至1L。 6.根据权利要求1所述的利用无外源培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结 线虫的方法，其特征在于：步骤(2)所述的根结线虫卵囊在接种前先依次用0.2(体积 比)升汞溶液、1.0(体积比)NaClO溶液浸泡消毒。 7.根据权利要求1所述的利用无外源培养基培养的空心菜离体根系。
8、单异体繁殖根结 线虫的方法，其特征在于：步骤(1)所述的1水琼脂培养基，是将1克琼脂粉溶于100毫 权 利 要 求 书CN 102487901 A 2/2页 3 升蒸馏水中，121下灭菌25min后得到。 权 利 要 求 书CN 102487901 A 1/5页 4 利用无外源培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结线虫的 方法 技术领域 0001 本发明涉及根结线虫的人工繁殖方法，具体涉及一种利用无外源培养基培养的空 心菜离体根系单异体繁殖根结线虫的方法。 背景技术 0002 根结线虫(Meloidogyne spp.)是严重危害作物的一类植物寄生线虫，其寄主相当 广泛，据不完全统计，根结线虫寄主。
9、已超过3000种植物，在世界范围内由根结线虫引起的 作物减产为10-20，严重的可达75以上(潘沧桑等，1994；Sasser，1983)。 0003 最常见的4种根结线虫是：南方根结线虫Meloidogyne incognita(Kofoid &White，1919)Chitwood，1949、爪哇根结线虫M.javanica(Treub，1885)Chitwood， 1949、花生根结线虫M.arenaria(Neal，1889)Chitwood，1949和北方根结线虫M.hapla Chitwood，1949。根结线虫不仅自身造成根系形成根结，影响根系的正常发育，还会加重枯 萎病、根腐病。
10、等土传性真菌病害和部分细菌病害的发生。 0004 为了有效地控制根结线虫病的发生和危害，需要全面系统研究根结线虫的生物学 特性、致病性及其与寄主植物的互作关系和遗传学特性，在此基础上进一步研究各种防治 方法，而这些研究都需要大量的、虫态一致的和种群单一的、无外源生物污染的虫源。因此， 建立能获得符合上述条件线虫的根结线虫纯化培养和大量繁殖体系，是开展根结线虫各方 面研究的重要基础。 0005 根结线虫是一类专性的定居型植物内寄生线虫，主要侵染寄主植物的根和块茎等 地下组织，必须在有寄主植物活体组织的情况下才能发育、繁殖和完成生活史，迄今国际上 尚未有根结线虫可以在无寄主植物组织的情况下完成生活。
11、史的公开报道。因此，根结线虫 的培养和繁殖离不开植物组织。 0006 培养繁殖根结线虫的常规方法是在温室栽培的寄主植物根系上接种繁殖根结线 虫，最常用的寄主植物是番茄和马铃薯(Vazquez等，1991；Jassen等，1995；吴庆丽等， 2006)。另外也有报道利用水培的方法培养繁殖根结线虫(Lambert et al.，1992；Snyder et al.，2006)。但盆栽和水培方法所占空间大、管理难、耗时多、工作量大、所获得虫源不 纯。 0007 利用离体植物组织培养根结线虫的方法占用的空间小、节省劳力、不受自然环境 条件的影响；而用无外源培养基培养的离体根系进行单异体培养繁殖的根结。
12、线虫还避免了 外源生物和激素的污染，比较纯净，非常适合进行分子遗传学以及根结线虫与植物互作等 方面的研究。这种单异活体培养方法不仅可以得到纯化的大量无菌根结线虫，直接用于接 种植物和进行其它各类研究，也可以用于根结线虫种质资源的保藏，同时也为研究根结线 虫与寄主植物以及其他根际微生物之间的互作关系提供了新的途径。因此，自上世纪30年 代以来，人们一直在探索研究利用离体植物组织大量繁殖根结线虫的方法。 0008 Tyler(1933)报道了根结线虫可以离体培养，Mountain等(1955)报道根结线虫可 说 明 书CN 102487901 A 2/5页 5 以在多种植物离体根上繁殖，但所报道的。
13、这些方法的繁殖率太低，一直未能在实际研究中 应用。 0009 Verdejo等(1988)和Mitkowski等(2002)利用发根农杆菌(Agrobacteriun rhizogenes)诱导植物发根或用含外源激素的培养基培养的离体根来繁殖根结线虫。上述 离体培养方法虽可以获得一定量的线虫，但仍存在一定的局限性，如操作复杂、成本高并含 有外源生物或激素，试验中会因外源物质的存在而污染培养体系或对试验结果造成干扰。 0010 Hutangura等(1998)和Mitkowski等(2002)分别用无外源生物和无外源激素的 培养基培养的番茄离体根和蒲公英离体根成功的单异体培养了根结线虫，但是繁殖。
14、量仍很 低(分别产生了47个根结和113个卵囊)，难以在实际中应用。 发明内容 0011 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用无外源生物和 激素的培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结线虫的方法，该方法包括配制无外源 生物和激素的培养基、空心菜离体根系的制备和根结线虫的接种培养等步骤，本发明方法 实现了根结线虫的单异体培育保存、快速纯化和大量繁殖等目的。 0012 本发明的目的通过下述技术方案实现： 0013 一种利用无外源培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结线虫的方法，包括 以下步骤： 0014 (1)制备空心菜离体根系 0015 将空心菜种子消毒、接种到1水琼脂。
15、培养基平板上；将1水琼脂培养基平 板置于温度为25、光照/黑暗时间为12h/12h的环境中培养，待种子萌发的根系长到 3-4cm(大约7d)时，切取根尖，将根尖接种到无外源离体根系培养基平板上，将无外源离体 根系培养基平板置于温度为25的黑暗环境中培养，1520d长出大量的离体根； 0016 (2)根结线虫的接种和培养 0017 将根结线虫卵囊13个(进行纯化培养用1个卵囊，进行扩繁和保种培养用2 3个卵囊)消毒后，制备成卵粒悬浮液接种在步骤(1)的空心菜离体根上，将离体根置于温 度为25、光照/黑暗时间为12h/12h的环境中培养5090d即可得到大量单一的根结线 虫； 0018 上述的操作。
16、均在无菌条件下进行。 0019 步骤(1)所述的空心菜种子先要解除休眠；所述的解除休眠是将空心菜种子用 1(体积比)NaClO溶液浸泡5min，用无菌水清洗4-5次，再用无菌水浸泡24h； 0020 步骤(1)所述的将空心菜种子消毒是将解除休眠的种子用1(体积比)NaClO溶 液浸泡812min，然后用无菌水冲洗3-4次，最后将种子放在无菌滤纸上晾干； 0021 步骤(1)所述的1水琼脂培养基，是将1克琼脂粉溶于100毫升蒸馏水中，121 下灭菌25min后得到； 0022 步骤(1)所述的无外源离体根系培养基是指无外源生物和激素的离体根系培养 基，其配方和配制方法为：大量元素母液12.5ml。
17、、微量元素母液0.5ml、有机元素母液5ml、 铁盐母液10ml、琼脂6-10g、蔗糖40g，加蒸馏水定容至1L，将pH值调至6.4，121下高温灭 菌25min； 说 明 书CN 102487901 A 3/5页 6 0023 所述的大量元素母液其成分为：KNO 3 19.00g、MgSO 4 7H 2 O 3.70g、NH 4 NO 3 16.50g、 KH 2 PO 4 1.70g、CaCl 2 2H 2 O 4.40g，加蒸馏水定容至1L； 0024 所述的微量元素母液其成分为：MnSO 4 4H 2 O 22.30g、ZnSO 4 4H 2 O 8.60g、 H 3 BO 3 6.2。
18、0g、KI 0.83g、Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.25g、CuSO 4 5H 2 O 0.025g、CoCl 2 6H 2 O0.025g，加蒸 馏水定容至1L； 0025 所述的有机元素母液其成分为：硫胺素0.005g、吡哆醇0.025g、烟酸0.025g、甘氨 酸0.1g、肌醇2.5g，加蒸馏水定容至1L； 0026 所述的铁盐母液其成分为：Na 2 -EDTA 3.73g、FeSO 4 7H 2 O 2.78g，加蒸馏水定容至 1L。 0027 步骤(2)所述的根结线虫卵囊在接种前先依次用0.2(体积比)升汞溶液、 1.0(体积比)NaClO溶液浸泡消毒。 0028 本发明。
19、相对于现有技术具有如下的优点及效果： 0029 1、本发明方法利用无外源生物和激素的培养基培养的空心菜离体根系单异体繁 殖根结线虫，可以快速纯化并获得大量无菌的根结线虫，该方法避免了盆栽实生苗接种繁 殖根结线虫方法的费时、费力、占据大量空间、繁琐管理、受季节等自然和环境条件限制以 及易被其他生物污染等不足。 0030 2、本发明方法克服了已有离体根系培养方法繁殖根结线虫数量少不能真正满足 研究工作对虫源需求的状况，也避免了其它已有的离体根系培养繁殖根结线虫需要加入发 根农杆菌或促根生长素等其它外源生物或外源激素诱导生根，从而使繁殖的根结线虫自然 性状不受影响；用本发明方法繁殖得到的根结线虫更适。
20、合于根结线虫的生物学、病理学、遗 传学、分子生物学以及与寄主植物互作关系的研究。 0031 3、本发明方法用到的培养基其组分均是常规材料，易获得、成本低、配制过程简 单。 0032 4、本发明提供的根结线虫单异体繁殖方法具有繁殖率高、操作简单、成本低、不易 污染、应用范围广和实用性强等优势，真正实现了根结线虫单异体人工培养纯化和大量繁 殖，解决了根结线虫相关研究中一直存在的难以获得纯化、大量的实验虫源问题。 附图说明 0033 图1是用无外源生物和激素的培养基培养的空心菜离体根系。 0034 图2为显微镜下接种于空心菜离体根上的根结线虫虫卵孵化成二龄幼虫并侵染 空心菜离体根的照片图。 0035。
21、 图3为用无外源生物和激素培养基培养的空心菜离体根接种根结线虫10天后形 成的根结。 0036 图4为用无外源生物和激素培养基培养的空心菜离体根接种根结线虫50天后形 成的大量根结。 具体实施方式 0037 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。 说 明 书CN 102487901 A 4/5页 7 0038 实施例 0039 一种利用无外源培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结线虫的方法，包括 以下步骤： 0040 (1)配制无外源离体根系培养基 0041 量取大量元素母液12.5ml，微量元素母液0.5ml，有机元素母液5ml、铁盐母液 10ml，。
22、称取40g蔗糖，放入容积1000ml的三角瓶中，加入适量蒸馏水，在磁力搅拌器上搅匀， 用10N NaOH将pH值调至6.4，再称取6g琼脂加入其中，最后定容至1000ml。在121下高 温灭菌25min，冷却待不烫手后，在无菌操作台内，按每个培养基(直径9cm)倒25ml培养基 制备平板，冷却凝固，待上盖水分蒸发后使用。 0042 大量元素母液的成分为：KNO 3 19.00g、MgSO 4 7H 2 O 3.70g、NH 4 NO 3 16.50g、 KH 2 PO 4 1.70g、CaCl 2 2H 2 O 4.40g，加蒸馏水定容至1L； 0043 微量元素母液的成分为：MnSO 4 4。
23、H 2 O 22.30g、ZnSO 4 4H 2 O 8.60g、H 3 BO 3 6.20g、KI 0.83g、Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.25g、CuSO 4 5H 2 O 0.025g、CoCl 2 6H 2 O 0.025g，加蒸馏水定容至 1L； 0044 有机元素母液的成分为：硫胺素0.005g、吡哆醇0.025g、烟酸0.025g、甘氨酸 0.1g、肌醇2.5g，加蒸馏水定容至1L； 0045 铁盐母液的成分为：Na 2 -EDTA 3.73g、FeSO 4 7H 2 O 2.78g，加蒸馏水定容至1L。 0046 (2)制备空心菜离体根系 0047 配制1水琼脂培养。
24、基(1克琼脂粉溶于100毫升蒸馏水中)，灭菌(121下湿热 高温灭菌25min)后，待其冷却到不烫手时在无菌操作台内往培养皿(已灭菌)中倒平板。 0048 将空心菜(Ipomoea aquatica)种子(购买于广东省农业科学院蔬菜研究所)用 1(体积比)NaClO溶液浸泡消毒5min，然后用无菌水清洗4-5次，再放在无菌器皿中用无 菌水浸泡24h，解除休眠。 0049 将解除休眠的种子用1(体积比)NaClO溶液浸泡消毒812min，然后用无菌 水冲洗3-4次，最后将种子放在无菌滤纸上晾干。将晾干的种子移入1水琼脂培养基平 板上，将培养皿用封口膜封口，置于温度为25、光照和黑暗时间为12h/。
25、12h的培养箱中培 养。 0050 待1水琼脂培养基平板上的种子萌发的根系长到3-4cm(大约7d)时，在无菌操 作台上，用无菌刀切取根尖，然后将根尖置于步骤(1)的无外源离体根系培养基平板上，将 培养皿用封口膜封口，置于温度为25的培养箱中黑暗培养，大约1520d可以长出大量 的离体根系，如图1所示。 0051 (3)根结线虫的接种培养和繁殖 0052 在体视显微镜下挑取大小均一、颜色淡黄的本实验室温室盆栽番茄保存的南方根 结线虫(M.incognita)或爪哇根结线虫(M.javanica)或花生根结线虫(M.arenaria)的卵 囊，放于1.5ml的无菌离心管中，每管放3个卵囊，用无菌。
26、水冲洗4-5遍，加入0.2(体积 比)升汞溶液浸泡1min，3000r/min离心2min；吸去上清液后加入无菌水清洗，6000r/min 离心2min，重复2次；吸去上清液后加入1.0(体积比)NaClO溶液浸泡1min，6000r/min 离心3min；吸去上清液加入无菌水，以6000r/min离心2min，吸去上清液，重复4次；最后加 入0.4ml无菌水，漩涡振荡得到卵粒悬浮液，备用。 说 明 书CN 102487901 A 5/5页 8 0053 在无菌操作台上，用无菌的吸管吸取卵粒悬浮液接种于步骤(2)的空心菜离体根 系上(每个培养皿中的根系上接种55050个卵粒)。置于培养箱内培养。
27、，培养箱温度为 25，12h/12h光照黑暗交替。 0054 按上述步骤接种3d后，即有卵孵化成二龄幼虫开始侵染空心菜离体根(如图2所 示，箭头所指即为根结线虫的二龄幼虫)，接种10d后，开始有根结出现(如图3所示，箭头 所指即为根结)。 0055 南方根结线虫在接种空心菜离体根并培养50d后，根系上的根结数和线虫数量最 多(如图4所示)，平均每个培养皿中的根系上可以产生191个根结、70个卵囊、3180条二 龄幼虫、107条三龄和四龄幼虫和82个雌成虫。 0056 另外，本发明的空心菜离体根系在接种根结线虫3个月内可以不断产生新的根系 和根结，4个月后根系才出现腐烂症状。 0057 而Hut。
28、angura等(1998)和Mitkowski等(2002)分别用无外源生物和无外源激素 的培养基培养的番茄离体根和蒲公英离体根培养根结线虫，每个培养皿中的根系上分别只 产生了47个根结和113个卵囊。 0058 本发明方法能单异体繁殖出大量的根结线虫，可以用于无外源单异体快速培养纯 化、大量繁殖和定期保存根结线虫，具有实用价值。 0059 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书CN 102487901 A 1/2页 9 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102487901 A 2/2页 10 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102487901 A 10 。