东亚砂藓配子体再生体系的建立方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110410347.X	申请日：	2011.12.12
公开号：	CN102511393A	公开日：	2012.06.27
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A01H 4/00申请日:20111212\|\|\|公开
IPC分类号：	A01H4/00	主分类号：	A01H4/00
申请人：	齐齐哈尔大学
发明人：	沙伟; 张梅娟
地址：	161006 黑龙江省齐齐哈尔市建华区文化大街42号
优先权：
专利代理机构：	齐齐哈尔鹤城专利事务所 23207	代理人：	叶仲刚
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内容摘要

本发明公开了一种东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，包括以下顺序步骤：取经过适度培养后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成小段进行表面消毒，接种到常规MS培养基上进行培养，筛选得到无菌外植体；将无菌外植体转移到常规MS+30g/L蔗糖培养基上，诱导配子体产生原丝体；将产生的原丝体转移到扩繁培养基上培养50天，再将原丝体转移到诱导产生配子体的培养基上培养70天。本发明首次建立了东亚砂藓配子体再生体系的方法，方法简单，成本低，可在短时间内实现大量扩繁东亚砂藓配子体的目的，保证了后续实验的成功。

权利要求书

1：一种东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：（1）取适度培养后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成小段进行表面消毒，接种到培养基上进行培养，培养条件为：光照时间 12h，光照度 3000lux，培养温度 20±2℃ ；（2）将步骤（1）得到的无菌外植体转移到诱导配子体产生原丝体的培养基上，培养条件：光照时间 10-14h，光照度 3000-6000lux，培养温度 20±2℃ ；（3）将步骤（2）得到的原丝体转移到原丝体扩繁培养基上，培养 50 天，培养条件为：光照时间 12h，光照度 3000 lux，培养温度 15-28℃ ；（4）将步骤（3）得到的原丝体转移到诱导配子体产生的培养基上，培养 70 天，培养条件为：光照时间 12h，光照度 3000 lux，培养温度 20±2℃。2：根据权利要求 1 所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（1）、（2）、（3）、（4）全部采用，或部分步骤单独采用常规 MS + 0-40g/L 蔗糖作为培养基。3：根据权利要求 1 所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（1）、（3）、（4）全部采用，或者部分步骤单独采用改良 Beneck + 0-40g/L 蔗糖作为培养基；其中的改良 Beneck 培养基成分为： NH4NO3 200 mg/L， KH2PO4 100 mg/L， MgSO4·7H2O100 mg/L， FeSO4·7H2O 微量。4：根据权利要求 1 所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（1）、（3）、（4）全部采用或者部分步骤单独采用常规 MS 培养基 +30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6- 苄基氨基嘌呤作为培养基。5：根据权利要求 1 所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（1）（2）、全部采用或某一步骤单独采用改良 Knop + 0-40g/L 蔗糖作为培养基；其中的改良 Knop 培养基成分为： Ca(NO3)2·4H2O 1000mg/L， KH2PO4 250mg/L， MgSO4·7H2O 250mg/L， KCl 250mg/L， FeSO4·7H2O 12.5mg/L。6：根据权利要求 1 所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（2）、（3）全部采用或者某一步骤单独采用常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸作为培养基。7：根据权利要求 1 所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述述步骤（3）（、4）全部采用或者某一步骤单独采用常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/ L 6- 糖基氨基嘌呤作为培养基。8：根据权利要求 1 所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的原丝体扩繁培养基为：常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 萘乙酸。9：根据权利要求 1 所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的诱导配子体产生培养基为：改良 Beneck 培养基 + 0.1-1.5mg/L 6- 苄基氨基嘌呤；其中改良 Beneck 培养基与权利要求 3 中的相同。10：根据权利要求 1 所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的诱导配子体产生培养基为：改良 Beneck 培养基 + 0.1-1.5mg/L 6- 糖基氨基嘌呤；其中改良 Beneck 培养基与权利要求 3 中的相同。

说明书

东亚砂藓配子体再生体系的建立方法
    【技术领域】
     本发明涉及一种东亚砂藓配子体再生体系的建立方法。背景技术东亚砂藓（Racomitrium japonicum ）属紫萼藓科（Grimmiace）砂藓属（Racomitrium ），生于低海拔地区的岩面、岩面薄土和沙土上。广泛分布于中国的黑龙江、吉林、辽宁、河南、江西等南北各省，日本、朝鲜、俄罗斯（西伯利亚东南）、越南、澳大利亚等地也有分布。在长期的生物进化历程中，紫萼藓科中的大多数种类在群落、茎叶以及假根结构和生理上都产生了对旱生环境适应的特征。目前，在国外，苔藓植物中的小立碗藓已成为研究植物分子生物学的理想实验材料，是研究基因功能的模式植物；土生墙藓也已成为研究耐旱藓类生理生态和抗旱机理的研究模型。而有关于紫萼藓科植物的研究报道在国内外却少之又少。若能从该科植物中找到抗旱相关基因，对于研究其耐旱机制、培育耐旱新品种，在理论和实践上都具有重要价值。东亚砂藓为紫萼藓科中的典型的小型耐旱藓类，久旱而不丧失生活力，是较好的抗旱基因的资源。野外生长的材料是否来源于同一母本不能确定，为了获得均一、优质化的材料，更好的研究其耐旱机制，建立东亚砂藓配子体的再生体系具有重大意义，而且目前国内还没有通过组织培养成功获得东亚砂藓配子体的报道。
     发明内容
     本发明要解决的技术问题在于提供一种东亚砂藓配子体再生体系的建立方法，实现为苔藓植物抗旱基因的筛选提供均一材料的目的。该方法不仅操作程序简单，而且培养成本也很低。
     本发明采用的技术方案如下：（1）取适度培养后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成小段进行表面消毒，接种到培养基上进行培养，培养条件为：光照时间 12h，光照度 3000lux，培养温度 20±2℃ ；（2）将步骤（1）得到的无菌外植体转移到诱导配子体产生原丝体的培养基上，培养条件：光照时间 10-14h，光照度 3000-6000lux，培养温度 20±2℃ ；（3）将步骤（2）得到的原丝体转移到原丝体扩繁培养基上，培养 50 天，培养条件为：光照时间 12h，光照度 3000 lux，培养温度 15-28℃ ；（4）将步骤（3）得到的原丝体转移到诱导配子体产生的培养基上，培养 70 天，培养条件为：光照时间 12h，光照度 3000 lux，培养温度 20±2℃。
     上述步骤（1）（2）、（3）、（4）、可以全部采用，或部分步骤单独采用常规 MS + 0-40g/ L 蔗糖作为培养基。
     上述步骤（1）、（3）、（4）可以全部采用，或者部分步骤单独采用改良 Beneck + 0-40g/L 蔗糖作为培养基。
     上述步骤（1）、（3）、（4）可以全部采用或者部分步骤单独采用常规 MS 培养基 +30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6- 苄基氨基嘌呤作为培养基。上述步骤（1）、（2）可以全部采用或某一步骤单独采用改良 Knop + 0-40g/L 蔗糖作为培养基。
     上述步骤（2）、（3）可以全部采用或者某一步骤单独采用常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸作为培养基。
     上述步骤（3）、（4）可以全部采用或者某一步骤单独采用常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6- 糖基氨基嘌呤作为培养基。
     上述步骤（3）中的原丝体扩繁培养基还可以为：常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 萘乙酸。
     上述步骤（4）中的诱导配子体产生培养基还可以为：改良 Beneck 培养基 + 0.1-1.5mg/L 6- 苄基氨基嘌呤。
     上述步骤（4）中的诱导配子体产生培养基还可以为：改良 Beneck 培养基 + 0.1-1.5mg/L 6- 糖基氨基嘌呤。
     上述的常规 MS 培养基成分为： KNO3 1900mg/L， NH4NO3 1650 mg/L， MgSO4·7H2O 370mg/L， KH2PO4 170 mg/L， CaCl2·2H2O 440 mg/L， MnSO4·4H2O 22.30 mg/L， ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L， H3BO3 6.2 mg/L， KI 0.83 mg/L， Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L， CuSO4·5H2O 0.025 mg/L， CoCl2· 6H2O 0.025 mg/L， Na2-EDTA 37.25 mg/L， FeSO4· 7H2O 27.85 mg/L，甘氨酸 2.0 mg/L，盐酸硫胺素 0.4mg/L，盐酸吡哆醇 0.5mg/L，烟酸 0.4mg/L，肌醇 100mg/L。
     上述的改良 Knop 培养基成分为： Ca(NO3)2·4H2O 1000mg/L， KH2PO4 250mg/L， MgSO4·7H2O 250mg/L， KCl 250mg/L， FeSO4·7H2O 12.5mg/L。
     上述的改良 Knop 培养基成分为： Ca(NO3)2·4H2O 1000mg/L， KH2PO4 250mg/L， MgSO4·7H2O 250mg/L， KCl 250mg/L， FeSO4·7H2O 12.5mg/L。
     本发明的优点是：方法简单，成本低，可在短时间内实现大量扩繁东亚砂藓配子体的目的，保证了后续实验的成功。通过本方法能够获得遗传特性相同的材料，用于抗旱基因的筛选，为研究苔藓植物抗旱分子机理奠定基础。因而具有十分重要的意义。具体实施方式
     实施例 1 取培养一段时间后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成 0.5-1cm 的小段，用 2% 洗洁精溶液浸泡 10min 后，用 0.02% 的升汞处理 45s，进行表面消毒；消毒后接种到常规 MS + 0-40 g/L 蔗糖、改良 Beneck + 0-40 g/L 蔗糖、改良 Knop + 0-40 g/L 蔗糖培养基上，分别进行培养，培养条件为：光照时间 12h，光照度 3000lux，培养温度 20±2℃。
     培养结果如下：改良 Beneck + 0-40 g/L 蔗糖、改良 Knop + 0-40 g/L 蔗糖这几种培养基上，配子体染菌率特别高，主要是青霉和根霉，在此基础上加大消毒液的浓度和消毒时间，也得到同样结果，若消毒时间和浓度太高则配子体基本死亡，故以改良 Beneck、 Knop 为基础的无机盐培养基不适合东亚砂藓无菌配子体的筛选。对于常规培养基 MS 而言， MS 培养基 + 0-40 g/ L 蔗糖上染菌率低，含有 40g/L 蔗糖的培养基上配子体开始褐化，其余情况对配子体生长影响不大。故最终选择常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖作为无菌外植体筛选的最佳培养基。
     实施例 2将实例 1 筛选得到的无菌外植体转移到诱导配子体产生原丝体的培养基上进行培养 20 天左右，培养条件为：光照时间 12h，光照度 3000lux，培养温度 20±2℃。
     制备诱导配子体产生原丝体的培养基，配方组成为以下 3 种： ① 常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖； ② 常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6- 苄基氨基嘌呤； ③ 常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸。
     常规 MS 培养基成分为： KNO3 1900mg/L， NH4NO3 1650 mg/L， MgSO4·7H2O 370mg/L， KH2PO4 170 mg/L， CaCl2·2H2O 440 mg/L， MnSO4·4H2O 22.30 mg/L， ZnSO4·7H2O 8.6 mg/ L， H3BO3 6.2 mg/L， KI 0.83 mg/L， Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L， CuSO4·5H2O 0.025 mg/L， CoCl2·6H2O 0.025 mg/L， Na2-EDTA 37.25 mg/L， FeSO4·7H2O 27.85 mg/L，甘氨酸 2.0 mg/ L，盐酸硫胺素 0.4mg/L，盐酸吡哆醇 0.5mg/L，烟酸 0.4mg/L，肌醇 100mg/L 结果如下： ① 常规 MS + 30 g/L 蔗糖培养基中， 90% 的配子体在刀切处会产生大量鲜绿色原丝体，向四周呈匍匐状生长，接近为圆形，平均直径为 0.94cm，平均长度为 0.66cm。
     ② 常规 MS + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6- 苄基氨基嘌呤培养基中，在刀切处会产生很多量的鲜绿色原丝体，向四周呈匍匐状生长，接近为圆形，浓度为 1.5mg/L 时长势最好，平均直径为 0.81cm，平均长度为 0.54cm ；在部分叶腋处会产生新的芽体，随着 6- 苄基氨基嘌呤浓度的增加产生新芽体数量增加，但总体来说量较少，长势较弱。
     ③ 常规 MS + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸培养基中，在刀切处会产生大量鲜绿色原丝体，向四周呈匍匐状生长，接近为圆形，浓度为 1.0mg/L 时长势最好，平均直径为 0.96cm，平均长度为 0.71cm。
     比较上述结果可以看出，常规 MS 培养基中不添加激素也能诱导配子体产生原丝体，长势较好；添加不同浓度 6- 苄基氨基嘌呤的培养基中虽也能诱导形成原丝体，但长势并不如常规 MS 培养基；添加不同浓度 2,4- 二氯苯氧乙酸的培养基中也能诱导形成原丝体，长势与常规 MS 培养基中的差不多，但最终确定常规 MS + 30 g/L 蔗糖培养基为诱导配子体产生原丝体的最佳培养基。
     实施例 3 将实施例 1 筛选得到的无菌外植体转移到诱导配子体产生原丝体的常规 MS + 30 g/L 蔗糖培养基上，按照以下 4 种培养条件进行培养： ① 培养温度 20±2℃，光照强度 3000 lux，光照时间 10h ； ② 培养温度 20±2℃，光照强度 3000 lux，光照时间 12h ； ③ 培养温度 20±2℃，光照强度 3000 lux，光照时间 14h ； ④ 培养温度 20±2℃，光照强度 6000 lux，光照时间 12h。
     结果如下：在这 4 种培养条件下，接种在常规 MS + 30 g/L 蔗糖培养基上的无菌外植体所产生的原丝体在平均直径、平均长度上差别不大，说明光照强度、光照时间对诱导配子体产生原丝体影响很小。故最终确定诱导配子体产生原丝体的最佳培养条件为：培养温度 20±2℃，光照强度 3000 lux，光照时间 12h。
     实施例 4将实施例 2、 3 得到的原丝体转移到原丝体扩繁培养基上进行培养 50 天左右，培养条件为：光照时间 12h，光照度 3000lux，培养温度（20-26） ±2℃。
     制备原丝体扩繁培养的培养基，配方组成为以下 7 种： ① 改良 Knop 培养基 + 0、 30 g/L 蔗糖； ② 改良 Beneck 培养基 + 0、 30 g/L 蔗糖； ③ 常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖； ④ 常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 1.5mg/L 6- 苄基氨基嘌呤； ⑤ 常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 1.0mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸； ⑥ 常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6- 糖基氨基嘌呤； ⑦ 常规 MS 培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 萘乙酸。
     结果如下： ① 改良 Knop 培养基上原丝体生长缓慢，一段时间后开始发黄、逐渐褐变死亡，故其不适合于原丝体的生长。
     ② 改良 Beneck 培养基上原丝体成团生长，生长较快，颜色鲜绿，培养 50 天左右，平均直径为 1.71cm。
     ③ 常规 MS + 30 g/L 蔗糖培养基上原丝体生长旺盛，较快，颜色鲜绿，培养 50 天左右，平均直径为 2.38cm。若培养时间过长，原丝体慢慢变黄，继代培养发现会长出鲜绿的新鲜原丝体。
     ④ 常规 MS + 30 g/L 蔗糖 + 1.5mg/L 6- 苄基氨基嘌呤培养基上，原丝体生长稍慢，颜色鲜绿， 50 天左右平均直径为 1.85cm，但能分化出大量小的芽体，生长 50 天左右芽体数量增加。
     ⑤ 常规 MS + 30 g/L 蔗糖 + 1.0mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸培养基上，原丝体成团生长，生长较快，颜色鲜绿，培养 50 天左右，平均直径为 2.96cm。当培养时间过长时，原丝体也会慢慢变黄，继代培养会长出鲜绿的新鲜原丝体。
     ⑥ 常规 MS + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6- 糖基氨基嘌呤培养基上，原丝体长势与添加 6- 苄基氨基嘌呤的培养基上差不多，在浓度为 1.5mg/L 时分化出的芽体数量非常多。
     ⑦ 常规 MS + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 萘乙酸培养基上，培养 20 天左右发现原丝体顶端变为红黄色，长势较慢，继续培养慢慢褐化死亡。
     比较以上结果发现，在常规 MS +30 g/L 蔗糖培养基上，添加激素种类对原丝体生长有一定的影响，当 2,4- 二氯苯氧乙酸为 1.0mg/L 有助于原丝体的生长，故最终将常规 MS + 30 g/L 蔗糖 + 1.0mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸培养基作为原丝体扩繁培养的最佳培养基。
     实施例 5 实施例 2、 3 得到的原丝体转移到原丝体扩繁培养基常规 MS 基 + 30g/L 蔗糖 + 1.0mg/ L 2,4- 二氯苯氧乙酸上，按照以下 4 种培养条件进行培养： ① 培养温度 17±2℃，光照强度 3000 lux，光照时间 12h ； ② 培养温度 20±2℃，光照强度 3000 lux，光照时间 12h ； ③ 培养温度 23±2℃，光照强度 3000 lux，光照时间 12h ； ④ 培养温度 26±2℃，光照强度 3000 lux，光照时间 12h。结果如下：在这 4 种培养条件下，当温度为 26±2℃时，原丝体团从外围开始褐化，生长处于停滞状态，培养一段时间基本死亡；当温度为 23±2℃时，原丝体团小部分开始从外围褐化，部分进行正常生长，但是缓慢，培养 50 天后平均直径为 1.98cm ；当温度为 20±2℃时，原丝体无褐化现象，长势较好，培养 50 天后平均直径为 2.96cm ；当温度为 17±2℃时，原丝体无褐化现象，生长缓慢，培养 50 天后平均直径为 2.22cm。可见，温度对原丝体的生长影响较大，高温不适合于东亚砂藓原丝体的生长。故最终确定培养温度 20±2℃，光照强度 3000lux，光照时间 12h 为其最佳培养条件。
     实施例 6 将实施例 4、 5 得到的原丝体转移到诱导配子体产生的培养基上进行培养，培养条件为：光照时间 12h，光照度 3000 lux，培养温度 20±2℃。
     制备诱导原丝体产生配子体的培养基，配方组成为以下 6 种： ① 改良 Beneck 培养基 + 0-30g/L 蔗糖； ② 常规 MS 培养基 + 0、 30g/L 蔗糖； ③ 改良 Beneck 培养基 + 0.1-1.5mg/L 6- 苄基氨基嘌呤； ④ 改良 Beneck 培养基 + 0.1-1.5mg/L 6- 糖基氨基嘌呤； ⑤ 常规 MS 培养基 + 0.1-1.5mg/L 6- 苄基氨基嘌呤； ⑥ 常规 MS 培养基 + 0.1-1.5mg/L 6- 糖基氨基嘌呤。结果如下： ① 改良 Beneck 培养基上原丝体经过 30 天左右的时间能分化出小的芽体，芽体继续生长 40 天左右能长成平均长度为 2.15cm 的配子体。配子体在部分叶腋处会继续分化出新的配子体，最终成簇生长，较粗壮。在 Beneck 培养基上添加不同浓度的蔗糖发现，原丝体只进行营养生殖。分析可能原因是在无机盐培养基中蔗糖对芽体的生长有抑制作用。
     ② 在添加 30g/L 蔗糖蔗糖和不添加蔗糖的常规 MS 培养基中，原丝体一直保持营养生殖，经过大约 6 个月的生长，部分能分化出小的芽体，将芽体继代培养，约 20 天左右能长成配子体，生长周期较长。
     ③ 在添加激素的 MS 和 Beneck 培养基中，大约 60 天后 6-BA 和 KT 能诱导原丝体分化出小的芽体（浓度为 1.5mg/L 时所产生的芽体最多），将芽体继代培养，约 20 天左右能长成平均长度为 2.10cm 配子体，但所长配子体与不添加激素的 Beneck 培养基上生长的配子体相比较细弱。
     比较上述结果可以看出，不添加任何激素和蔗糖的改良 Beneck 培养基在短时间内就能诱导处较长较粗壮的配子体，故最终将改良 Beneck 培养基作为诱导原丝体产生配子体的最佳培养基。最佳培养条件为：培养温度 20±2 ℃，光照强度 3000 lux，光照时间 12h。
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1、(10)申请公布号 CN 102511393 A (43)申请公布日 2012.06.27 C N 1 0 2 5 1 1 3 9 3 A *CN102511393A* (21)申请号 201110410347.X (22)申请日 2011.12.12 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人齐齐哈尔大学地址 161006 黑龙江省齐齐哈尔市建华区文化大街42号 (72)发明人沙伟张梅娟 (74)专利代理机构齐齐哈尔鹤城专利事务所 23207 代理人叶仲刚 (54) 发明名称东亚砂藓配子体再生体系的建立方法 (57) 摘要本发明公开了一种东亚砂藓配子体再生体系建立的方法。

2、，包括以下顺序步骤：取经过适度培养后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成小段进行表面消毒，接种到常规MS培养基上进行培养，筛选得到无菌外植体；将无菌外植体转移到常规 MS+30g/L蔗糖培养基上，诱导配子体产生原丝体；将产生的原丝体转移到扩繁培养基上培养50 天，再将原丝体转移到诱导产生配子体的培养基上培养70天。本发明首次建立了东亚砂藓配子体再生体系的方法，方法简单，成本低，可在短时间内实现大量扩繁东亚砂藓配子体的目的，保证了后续实验的成功。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页说明书5页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书。

3、5 页 1/1页 2 1.一种东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：（1）取适度培养后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成小段进行表面消毒，接种到培养基上进行培养，培养条件为：光照时间12h，光照度3000lux，培养温度202；（2）将步骤（1）得到的无菌外植体转移到诱导配子体产生原丝体的培养基上，培养条件：光照时间10-14h，光照度3000-6000lux，培养温度202；（3）将步骤（2）得到的原丝体转移到原丝体扩繁培养基上，培养50天，培养条件为：光照时间12h，光照度3000 lux，培养温度15-28；（4）将步骤（3）得到的原丝体转移到诱导配。

4、子体产生的培养基上，培养70天，培养条件为：光照时间12h，光照度3000 lux，培养温度202。 2.根据权利要求1所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（1）、（2）、（3）、（4）全部采用，或部分步骤单独采用常规MS + 0-40g/L蔗糖作为培养基。 3.根据权利要求1所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（1）、（3）、（4）全部采用，或者部分步骤单独采用改良Beneck + 0-40g/L蔗糖作为培养基；其中的改良Beneck培养基成分为：NH 4 NO 3 200 mg/L，KH 2 PO 4 100 mg/L，MgSO 4 。

5、7H 2 O100 mg/L，FeSO 4 7H 2 O微量。 4.根据权利要求1所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（1）、（3）、（4）全部采用或者部分步骤单独采用常规MS培养基+30 g/L蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤作为培养基。 5.根据权利要求1所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（1）、（2）全部采用或某一步骤单独采用改良Knop + 0-40g/L蔗糖作为培养基；其中的改良Knop培养基成分为：Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O 1000mg/L，KH 2 PO 4 250mg/L，MgSO 4 7H 。

6、2 O 250mg/L， KCl 250mg/L，FeSO 4 7H 2 O 12.5mg/L。 6.根据权利要求1所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（2）、（3）全部采用或者某一步骤单独采用常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖+ 0.1-1.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸作为培养基。 7.根据权利要求1所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述述步骤（3）、（4）全部采用或者某一步骤单独采用常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖 + 0.1-1.5mg/ L 6-糖基氨基嘌呤作为培养基。 8.根据权利要求1所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其。

7、特征在于：所述步骤（3）中的原丝体扩繁培养基为：常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖 + 0 .1-1.5mg/L萘乙酸。 9.根据权利要求1所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的诱导配子体产生培养基为：改良Beneck培养基 + 0.1-1.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤；其中改良Beneck培养基与权利要求3中的相同。 10.根据权利要求1所述的东亚砂藓配子体再生体系建立的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的诱导配子体产生培养基为：改良Beneck培养基 + 0.1-1.5mg/L 6-糖基氨基嘌呤；其中改良Beneck培养基与权利要求3中的相同。。

8、权利要求书CN 102511393 A 1/5页 3 东亚砂藓配子体再生体系的建立方法技术领域 0001 本发明涉及一种东亚砂藓配子体再生体系的建立方法。背景技术 0002 东亚砂藓（Racomitrium japonicum）属紫萼藓科（Grimmiace）砂藓属（Racomitrium），生于低海拔地区的岩面、岩面薄土和沙土上。广泛分布于中国的黑龙江、吉林、辽宁、河南、江西等南北各省，日本、朝鲜、俄罗斯（西伯利亚东南）、越南、澳大利亚等地也有分布。在长期的生物进化历程中，紫萼藓科中的大多数种类在群落、茎叶以及假根结构和生理上都产生了对旱生环境适应的特征。目前，在国外，苔。

9、藓植物中的小立碗藓已成为研究植物分子生物学的理想实验材料，是研究基因功能的模式植物；土生墙藓也已成为研究耐旱藓类生理生态和抗旱机理的研究模型。而有关于紫萼藓科植物的研究报道在国内外却少之又少。若能从该科植物中找到抗旱相关基因，对于研究其耐旱机制、培育耐旱新品种，在理论和实践上都具有重要价值。东亚砂藓为紫萼藓科中的典型的小型耐旱藓类，久旱而不丧失生活力，是较好的抗旱基因的资源。野外生长的材料是否来源于同一母本不能确定，为了获得均一、优质化的材料，更好的研究其耐旱机制，建立东亚砂藓配子体的再生体系具有重大意义，而且目前国内还没有通过组织培养成功获得东亚砂藓配子体的报道。发明内容 0。

10、003 本发明要解决的技术问题在于提供一种东亚砂藓配子体再生体系的建立方法，实现为苔藓植物抗旱基因的筛选提供均一材料的目的。该方法不仅操作程序简单，而且培养成本也很低。 0004 本发明采用的技术方案如下：（1）取适度培养后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成小段进行表面消毒，接种到培养基上进行培养，培养条件为：光照时间12h，光照度3000lux，培养温度202；（2）将步骤（1）得到的无菌外植体转移到诱导配子体产生原丝体的培养基上，培养条件：光照时间10-14h，光照度3000-6000lux，培养温度202；（3）将步骤（2）得到的原丝体转移到原丝体扩繁培养基上，培养50天，培养。

11、条件为：光照时间12h，光照度3000 lux，培养温度15-28；（4）将步骤（3）得到的原丝体转移到诱导配子体产生的培养基上，培养70天，培养条件为：光照时间12h，光照度3000 lux，培养温度202。 0005 上述步骤（1）、（2）、（3）、（4）可以全部采用，或部分步骤单独采用常规MS + 0-40g/ L蔗糖作为培养基。 0006 上述步骤（1）、（3）、（4）可以全部采用，或者部分步骤单独采用改良Beneck + 0-40g/L蔗糖作为培养基。 0007 上述步骤（1）、（3）、（4）可以全部采用或者部分步骤单独采用常规MS培养基+30 g/L蔗糖 + 0.1-1.5m。

12、g/L 6-苄基氨基嘌呤作为培养基。说明书CN 102511393 A 2/5页 4 0008 上述步骤（1）、（2）可以全部采用或某一步骤单独采用改良Knop + 0-40g/L蔗糖作为培养基。 0009 上述步骤（2）、（3）可以全部采用或者某一步骤单独采用常规MS培养基 + 30 g/L 蔗糖+ 0.1-1.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸作为培养基。 0010 上述步骤（3）、（4）可以全部采用或者某一步骤单独采用常规MS培养基 + 30 g/L 蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6-糖基氨基嘌呤作为培养基。 0011 上述步骤（3）中的原丝体扩繁培养基还可以为：常规MS培养基。

13、 + 30 g/L蔗糖 + 0.1-1.5mg/L萘乙酸。 0012 上述步骤（4）中的诱导配子体产生培养基还可以为：改良Beneck培养基 + 0.1-1.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤。 0013 上述步骤（4）中的诱导配子体产生培养基还可以为：改良Beneck培养基 + 0.1-1.5mg/L 6-糖基氨基嘌呤。 0014 上述的常规MS培养基成分为：KNO 3 1900mg/L，NH 4 NO 3 1650 mg/L，MgSO 4 7H 2 O 370mg/L，KH 2 PO 4 170 mg/L，CaCl 2 2H 2 O 440 mg/L，MnSO 4 4H 2 O 22.30 mg。

14、/L，ZnSO 4 7H 2 O 8.6 mg/L，H 3 BO 3 6.2 mg/L，KI 0.83 mg/L，Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.25 mg/L，CuSO 4 5H 2 O 0.025 mg/L，CoCl 2 6H 2 O 0.025 mg/L，Na 2 -EDTA 37.25 mg/L，FeSO 4 7H 2 O 27.85 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.4mg/L，肌醇100mg/L。 0015 上述的改良Knop培养基成分为：Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O 1000mg/L，KH 2 PO 4 。

15、250mg/L， MgSO 4 7H 2 O 250mg/L，KCl 250mg/L，FeSO 4 7H 2 O 12.5mg/L。 0016 上述的改良Knop培养基成分为：Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O 1000mg/L，KH 2 PO 4 250mg/L， MgSO 4 7H 2 O 250mg/L，KCl 250mg/L，FeSO 4 7H 2 O 12.5mg/L。 0017 本发明的优点是：方法简单，成本低，可在短时间内实现大量扩繁东亚砂藓配子体的目的，保证了后续实验的成功。通过本方法能够获得遗传特性相同的材料，用于抗旱基因的筛选，为研究苔藓植物抗旱分子机理奠定基础。因而。

16、具有十分重要的意义。具体实施方式 0018 实施例1 取培养一段时间后的东亚砂藓，自顶端往下依次剪成0.5-1cm的小段，用2%洗洁精溶液浸泡10min后，用0.02%的升汞处理45s，进行表面消毒；消毒后接种到常规MS + 0-40 g/L蔗糖、改良Beneck + 0-40 g/L蔗糖、改良Knop + 0-40 g/L蔗糖培养基上，分别进行培养，培养条件为：光照时间12h，光照度3000lux，培养温度202。 0019 培养结果如下：改良Beneck + 0-40 g/L蔗糖、改良Knop + 0-40 g/L蔗糖这几种培养基上，配子体染菌率特别高，主要是青霉和根霉，在此基础。

17、上加大消毒液的浓度和消毒时间，也得到同样结果，若消毒时间和浓度太高则配子体基本死亡，故以改良Beneck、Knop为基础的无机盐培养基不适合东亚砂藓无菌配子体的筛选。对于常规培养基MS而言，MS培养基 + 0-40 g/ L蔗糖上染菌率低，含有40g/L蔗糖的培养基上配子体开始褐化，其余情况对配子体生长影响不大。故最终选择常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖作为无菌外植体筛选的最佳培养基。 0020 实施例2 说明书CN 102511393 A 3/5页 5 将实例1筛选得到的无菌外植体转移到诱导配子体产生原丝体的培养基上进行培养 20天左右，培养条件为：光照时间12h，光照度300。

18、0lux，培养温度202。 0021 制备诱导配子体产生原丝体的培养基，配方组成为以下3种：常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖；常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤；常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸。 0022 常规MS培养基成分为：KNO 3 1900mg/L，NH 4 NO 3 1650 mg/L，MgSO 4 7H 2 O 370mg/L， KH 2 PO 4 170 mg/L，CaCl 2 2H 2 O 440 mg/L，MnSO 4 4H 2 O 22.30 mg/L，ZnSO。

19、 4 7H 2 O 8.6 mg/ L，H 3 BO 3 6.2 mg/L，KI 0.83 mg/L，Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.25 mg/L，CuSO 4 5H 2 O 0.025 mg/L， CoCl 2 6H 2 O 0.025 mg/L，Na 2 -EDTA 37.25 mg/L，FeSO 4 7H 2 O 27.85 mg/L，甘氨酸2.0 mg/ L，盐酸硫胺素0.4mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.4mg/L，肌醇100mg/L 结果如下：常规MS + 30 g/L蔗糖培养基中，90%的配子体在刀切处会产生大量鲜绿色原丝体，向四周呈匍匐状生长，接近为圆。

20、形，平均直径为0.94cm，平均长度为0.66cm。 0023 常规MS + 30 g/L蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤培养基中，在刀切处会产生很多量的鲜绿色原丝体，向四周呈匍匐状生长，接近为圆形，浓度为1.5mg/L时长势最好，平均直径为0.81cm，平均长度为0.54cm；在部分叶腋处会产生新的芽体，随着6-苄基氨基嘌呤浓度的增加产生新芽体数量增加，但总体来说量较少，长势较弱。 0024 常规MS + 30 g/L蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸培养基中，在刀切处会产生大量鲜绿色原丝体，向四周呈匍匐状生长，接近为圆形，浓度为1.0mg/L时。

21、长势最好，平均直径为0.96cm，平均长度为0.71cm。 0025 比较上述结果可以看出，常规MS培养基中不添加激素也能诱导配子体产生原丝体，长势较好；添加不同浓度6-苄基氨基嘌呤的培养基中虽也能诱导形成原丝体，但长势并不如常规MS培养基；添加不同浓度2,4-二氯苯氧乙酸的培养基中也能诱导形成原丝体，长势与常规MS培养基中的差不多，但最终确定常规MS + 30 g/L蔗糖培养基为诱导配子体产生原丝体的最佳培养基。 0026 实施例3 将实施例1筛选得到的无菌外植体转移到诱导配子体产生原丝体的常规MS + 30 g/L 蔗糖培养基上，按照以下4种培养条件进行培养：培养温度202，光。

22、照强度3000 lux，光照时间10h；培养温度202，光照强度3000 lux，光照时间12h；培养温度202，光照强度3000 lux，光照时间14h；培养温度202，光照强度6000 lux，光照时间12h。 0027 结果如下：在这4种培养条件下，接种在常规MS + 30 g/L蔗糖培养基上的无菌外植体所产生的原丝体在平均直径、平均长度上差别不大，说明光照强度、光照时间对诱导配子体产生原丝体影响很小。故最终确定诱导配子体产生原丝体的最佳培养条件为：培养温度202，光照强度3000 lux，光照时间12h。 0028 实施例4 说明书CN 102511393 A 4/5。

23、页 6 将实施例2、3得到的原丝体转移到原丝体扩繁培养基上进行培养50天左右，培养条件为：光照时间12h，光照度3000lux，培养温度（20-26）2。 0029 制备原丝体扩繁培养的培养基，配方组成为以下7种：改良Knop培养基 + 0、30 g/L蔗糖；改良Beneck培养基 + 0、30 g/L蔗糖；常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖；常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖 + 1.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤；常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖 + 1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸；常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6-糖基氨基嘌呤。

24、；常规MS培养基 + 30 g/L蔗糖 + 0.1-1.5mg/L萘乙酸。 0030 结果如下：改良Knop培养基上原丝体生长缓慢，一段时间后开始发黄、逐渐褐变死亡，故其不适合于原丝体的生长。 0031 改良Beneck培养基上原丝体成团生长，生长较快，颜色鲜绿，培养50天左右，平均直径为1.71cm。 0032 常规MS + 30 g/L蔗糖培养基上原丝体生长旺盛，较快，颜色鲜绿，培养50天左右，平均直径为2.38cm。若培养时间过长，原丝体慢慢变黄，继代培养发现会长出鲜绿的新鲜原丝体。 0033 常规MS + 30 g/L蔗糖 + 1.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤培养基上，原丝。

25、体生长稍慢，颜色鲜绿，50天左右平均直径为1.85cm，但能分化出大量小的芽体，生长50天左右芽体数量增加。 0034 常规MS + 30 g/L蔗糖 + 1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸培养基上，原丝体成团生长，生长较快，颜色鲜绿，培养50天左右，平均直径为2.96cm。当培养时间过长时，原丝体也会慢慢变黄，继代培养会长出鲜绿的新鲜原丝体。 0035 常规MS + 30 g/L蔗糖 + 0.1-1.5mg/L 6-糖基氨基嘌呤培养基上，原丝体长势与添加6-苄基氨基嘌呤的培养基上差不多，在浓度为1.5mg/L时分化出的芽体数量非常多。 0036 常规MS + 30 g/L蔗糖。

26、+ 0.1-1.5mg/L萘乙酸培养基上，培养20天左右发现原丝体顶端变为红黄色，长势较慢，继续培养慢慢褐化死亡。 0037 比较以上结果发现，在常规MS +30 g/L蔗糖培养基上，添加激素种类对原丝体生长有一定的影响，当2,4-二氯苯氧乙酸为1.0mg/L有助于原丝体的生长，故最终将常规MS + 30 g/L蔗糖 + 1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸培养基作为原丝体扩繁培养的最佳培养基。 0038 实施例5 实施例2、3得到的原丝体转移到原丝体扩繁培养基常规MS基 + 30g/L蔗糖 + 1.0mg/ L 2,4-二氯苯氧乙酸上，按照以下4种培养条件进行培养：培养温度172，光照。

27、强度3000 lux，光照时间12h；培养温度202，光照强度3000 lux，光照时间12h；培养温度232，光照强度3000 lux，光照时间12h；培养温度262，光照强度3000 lux，光照时间12h。说明书CN 102511393 A 5/5页 7 0039 结果如下：在这4种培养条件下，当温度为262时，原丝体团从外围开始褐化，生长处于停滞状态，培养一段时间基本死亡；当温度为232时，原丝体团小部分开始从外围褐化，部分进行正常生长，但是缓慢，培养50天后平均直径为1.98cm；当温度为202时，原丝体无褐化现象，长势较好，培养50天后平均直径为2.96cm；当。

28、温度为172时，原丝体无褐化现象，生长缓慢，培养50天后平均直径为2.22cm。可见，温度对原丝体的生长影响较大，高温不适合于东亚砂藓原丝体的生长。故最终确定培养温度202，光照强度3000lux，光照时间12h为其最佳培养条件。 0040 实施例6 将实施例4、5得到的原丝体转移到诱导配子体产生的培养基上进行培养，培养条件为：光照时间12h，光照度3000 lux，培养温度202。 0041 制备诱导原丝体产生配子体的培养基，配方组成为以下6种：改良Beneck培养基 + 0-30g/L蔗糖；常规MS培养基 + 0、30g/L蔗糖；改良Beneck培养基 + 0.1-1.5mg。

29、/L 6-苄基氨基嘌呤；改良Beneck培养基 + 0.1-1.5mg/L 6-糖基氨基嘌呤；常规MS培养基 + 0.1-1.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤；常规MS培养基 + 0.1-1.5mg/L 6-糖基氨基嘌呤。 0042 结果如下：改良Beneck培养基上原丝体经过30天左右的时间能分化出小的芽体，芽体继续生长40天左右能长成平均长度为2.15cm的配子体。配子体在部分叶腋处会继续分化出新的配子体，最终成簇生长，较粗壮。在Beneck培养基上添加不同浓度的蔗糖发现，原丝体只进行营养生殖。分析可能原因是在无机盐培养基中蔗糖对芽体的生长有抑制作用。 0043 在添加30g/L。

30、蔗糖蔗糖和不添加蔗糖的常规MS培养基中，原丝体一直保持营养生殖，经过大约6个月的生长，部分能分化出小的芽体，将芽体继代培养，约20天左右能长成配子体，生长周期较长。 0044 在添加激素的MS和Beneck培养基中，大约60天后6-BA和KT能诱导原丝体分化出小的芽体（浓度为1.5mg/L时所产生的芽体最多），将芽体继代培养，约20天左右能长成平均长度为2.10cm配子体，但所长配子体与不添加激素的Beneck培养基上生长的配子体相比较细弱。 0045 比较上述结果可以看出，不添加任何激素和蔗糖的改良Beneck培养基在短时间内就能诱导处较长较粗壮的配子体，故最终将改良Beneck培养基作为诱导原丝体产生配子体的最佳培养基。最佳培养条件为：培养温度202，光照强度3000 lux，光照时间 12h。说明书CN 102511393 A 。

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