一种动态调控苏氨酸外排转运蛋白基因表达生产L苏氨酸的方法.pdf

本发明公开了一种动态调控苏氨酸外排转运蛋白基因表达生产L-苏氨酸的方法，本发明提供了一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：将突变苏氨酸操纵子thrAC1034TBC表达元件、阻遏蛋白基因表达元件和苏氨酸外排基因表达元件导入目的菌中，得到重组菌；所述苏氨酸外排基因表达元件包括苏氨酸外排基因、驱动该基因表达的诱导型启动子和位于二者之间的调控元件Ocmt。本发明的有益效果在于，根据基因表达对发酵对数期和稳定期苏氨酸生产的具体作用，有针对性的提出了苏氨酸外排转运蛋白基因的表达控制策略，开辟并且实践证明了新的提高苏氨酸的发酵量的方式，从而在实践上可用于细菌发酵生产苏氨酸，便于推广应用。

1.  一种构建重组菌的方法，为如下A或B：
A所示的方法包括如下步骤：将阻遏蛋白基因表达元件和苏氨酸外排基因表达元件导入出发细菌中，得到重组菌；
B所示的方法包括如下步骤：将阻遏蛋白基因表达元件、苏氨酸外排基因表达元件和突变苏氨酸操纵子表达元件导入出发细菌中，得到重组菌；
所述苏氨酸外排基因表达元件包括苏氨酸外排基因、驱动苏氨酸外排基因表达的诱导型启动子和位于二者之间的调控区；
所述阻遏蛋白基因表达元件包括阻遏蛋白基因及驱动阻遏蛋白基因表达的启动子；
所述突变苏氨酸操纵子表达元件包括突变苏氨酸操纵子和驱动突变苏氨酸操纵子表达的启动子。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
B所示的方法中，所述导入方式为如下1）或2）：
1）将所述阻遏蛋白基因表达元件、所述苏氨酸外排基因表达元件和所述突变苏氨酸操纵子表达元件通过重组载体A导入出发细菌中，得到重组菌；
2）将所述阻遏蛋白基因表达元件和所述苏氨酸外排基因表达元件通过重组载体B导入出发细菌中，且将所述突变苏氨酸操纵子表达元件通过同源重组导入所述出发细菌中，得到重组菌。

3.  根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
1）中，所述重组载体A为将所述阻遏蛋白基因表达元件、所述苏氨酸外排基因表达元件和所述突变苏氨酸操纵子表达元件插入表达载体中得到的载体；
2）中，所述重组载体B为将所述阻遏蛋白基因表达元件和所述苏氨酸外排基因表达元件插入表达载体中得到的载体；
所述同源重组为将突变苏氨酸操纵子表达元件以含有突变苏氨酸操纵子表达元件的片段的形式同源重组到所述出发细菌中。

4.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述苏氨酸外排基因为rhtC或rhtC和rhtB或rhtC、rhtB和rhtA；
所述驱动苏氨酸外排基因表达的诱导型启动子为P_T5；
所述调控区为Ocmt；
所述驱动阻遏蛋白基因表达的启动子为P_km；
所述突变苏氨酸操纵子为突变苏氨酸操纵子thrA^C1034TBC；
所述驱动突变苏氨酸操纵子表达的启动子为P_PL。

5.  根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述启动子P_T5的核苷酸序列为序列表中的序列3或4或5自5’末端第1-59位核苷酸；
所述苏氨酸外排基因rhtC的核苷酸序列为序列表中的序列3自5’末端第92-835位核苷酸或序列表中的序列4自5’末端第92-733位核苷酸或序列表中的序列5自5’末端第92-733位核苷酸；
所述苏氨酸外排基因rhtA的核苷酸序列为序列表中的序列4自5’末端第734-1706位核苷酸或序列表中的序列5自5’末端第734-1637位核苷酸；
所述苏氨酸外排基因rhtB的核苷酸序列为序列表中的序列5自5’末端第1638-2342位核苷酸；
所述Ocmt的核苷酸序列为序列表中的序列3或4或5自5’末端第60-91位核苷酸；
所述启动子P_km的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第1-144位核苷酸；
所述阻遏蛋白基因的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第145-917位核苷酸；
所述突变苏氨酸操纵子thrA^C1034TBC的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第688-5654位核苷酸；
所述启动子P_PL的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第520-687位核苷酸。

6.  根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：
所述阻遏蛋白基因表达元件的核苷酸序列为序列表中的序列2；
所述苏氨酸外排基因表达元件的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4或序列5；
所述突变苏氨酸操纵子表达元件的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第520-5654位核苷酸；
所述含有突变苏氨酸操纵子表达元件的片段的核苷酸序列为序列表中的序列1。

7.  根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述出发细菌为敲除细菌中编码高丝氨酸琥珀酰转移酶的metA基因、编码苏氨酸脱氨酶的ilvA基因、编码DAP脱羧酶的lysA基因、编码苏氨酸脱水酶的tdh基因、编码苏氨酸吸收转运蛋白的tdcC基因和编码苏氨酸吸收转运蛋白的sstT基因共6种基因得到的菌；
所述细菌具体为埃希氏菌属细菌，尤其具体为大肠杆菌。

8.  由权利要求1-7任一所述方法制备的重组菌。

9.  一种生成苏氨酸的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求8所述的重组菌，且在所述重组菌的第二生长阶段进行对异丙基苯甲酸诱导，收集发酵产物的上清液，得到苏氨酸；
所述第二生长阶段为指数生长后期、稳定期或衰亡期；
所述对异丙基苯甲酸诱导为向发酵体系中添加终浓度具体为5—1000μmol/L对异丙基苯甲酸；
所述对异丙基苯甲酸诱导尤其具体为向发酵体系中添加终浓度为5—500μmol/L对异丙基苯甲酸。

10.  一种重组载体，为权利要求1-7任一所述方法中的重组载体。

一种动态调控苏氨酸外排转运蛋白基因表达生产L-苏氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，属于氨基酸发酵领域，具体涉及一种动态调控苏氨酸外排转运蛋白基因表达生产L-苏氨酸的方法。
背景技术
L-苏氨酸是一种人体必需氨基酸，广泛应用于医药、食品、动物饲料等方面。近年来，国内外市场对L-苏氨酸的需求量逐年增长。
发酵法是目前工业化生产L-苏氨酸的主要方法，而高生产性能菌种的构建是发酵生产苏氨酸的关键。在菌种构建的过程中，普遍采用过表达苏氨酸操纵子的方法增强苏氨酸的合成途径。当胞内苏氨酸产量积累到一定浓度时，胞内高浓度的苏氨酸会反馈阻遏和抑制苏氨酸合成途径的关键酶，甚至激活苏氨酸的降解途径。苏氨酸外排则成为限制苏氨酸高效合成的步骤，因此需要加速苏氨酸向胞外转运，进一步提高菌种的苏氨酸生产性能。在公开的文献中已经鉴定出多种苏氨酸外排转运蛋白基因，如大肠杆菌的苏氨酸外排蛋白基因rhtA、rhtB和rhtC，谷氨酸棒杆菌的thrE基因等。在已公开的苏氨酸发酵生产技术中，通过简单的过表达上述苏氨酸外排转运蛋白基因可以提高苏氨酸的产量。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种构建重组菌的方法。
本发明提供的方法，为如下A或B：
A所示的方法包括如下步骤：将阻遏蛋白基因表达元件和苏氨酸外排基因表达元件导入出发细菌中，得到重组菌；
B所示的方法包括如下步骤：将阻遏蛋白基因表达元件、苏氨酸外排基因表达元件和突变苏氨酸操纵子表达元件导入出发细菌中，得到重组菌；
所述苏氨酸外排基因表达元件包括苏氨酸外排基因、驱动苏氨酸外排基因表达的诱导型启动子和位于二者之间的调控区；
所述阻遏蛋白基因表达元件包括阻遏蛋白基因及驱动阻遏蛋白基因表达的启动子；
所述突变苏氨酸操纵子表达元件包括突变苏氨酸操纵子和驱动突变苏氨酸操纵子表达的启动子。
上述方法中，
B所示的方法中，所述导入方式为如下1）或2）：
1）将所述阻遏蛋白基因表达元件、所述苏氨酸外排基因表达元件和所述突变苏氨酸操纵子表达元件通过重组载体A导入出发细菌中，得到重组菌；
2）将所述阻遏蛋白基因表达元件和所述苏氨酸外排基因表达元件通过重组载体B导入出发细菌中，且将所述突变苏氨酸操纵子表达元件通过同源重组导入所述出发细菌中，得到重组菌。
上述方法中，1）中，所述重组载体A为将所述阻遏蛋白基因表达元件、所述苏氨酸外排基因表达元件和所述突变苏氨酸操纵子表达元件插入表达载体中得到的载体；
2）中，所述重组载体B为将所述阻遏蛋白基因表达元件和所述苏氨酸外排基因表达元件插入表达载体中得到的载体；
所述同源重组为将突变苏氨酸操纵子表达元件以含有突变苏氨酸操纵子表达元件的片 段的形式同源重组到所述出发细菌中。
上述方法中，所述苏氨酸外排基因为rhtC或rhtC和rhtB或rhtC、rhtB和rhtA；
所述驱动苏氨酸外排基因表达的诱导型启动子为P_T5；
所述调控区为Ocmt；
所述驱动阻遏蛋白基因表达的启动子为P_km；
所述突变苏氨酸操纵子为突变苏氨酸操纵子thrA^C1034TBC
所述驱动突变苏氨酸操纵子表达的启动子为P_PL。
上述方法中，所述启动子P_T5的核苷酸序列为序列表中的序列3或4或5自5’末端第1-59位核苷酸；
所述苏氨酸外排基因rhtC的核苷酸序列为序列表中的序列3自5’末端第92-835位核苷酸或序列表中的序列4自5’末端第92-733位核苷酸或序列表中的序列5自5’末端第92-733位核苷酸；
所述苏氨酸外排基因rhtA的核苷酸序列为序列表中的序列4自5’末端第734-1706位核苷酸或序列表中的序列5自5’末端第734-1637位核苷酸；
所述苏氨酸外排基因rhtB的核苷酸序列为序列表中的序列5自5’末端第1638-2342位核苷酸；
所述Ocmt的核苷酸序列为序列表中的序列3或4或5自5’末端第60-91位核苷酸；
所述启动子P_km的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第1-144位核苷酸；
所述阻遏蛋白基因的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第145-917位核苷酸；
所述突变苏氨酸操纵子thrA^C1034TBC的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第688-5654位核苷酸；
所述启动子P_PL的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第520-687位核苷酸。
上述方法中，所述阻遏蛋白基因表达元件的核苷酸序列为序列表中的序列2；
所述苏氨酸外排基因表达元件的核苷酸序列为序列表中的序列3或序列4或序列5；
所述突变苏氨酸操纵子表达元件的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第520-5654位核苷酸；
所述含有突变苏氨酸操纵子表达元件的片段的核苷酸序列为序列表中的序列1。
上述方法中，所述出发细菌为敲除细菌中编码高丝氨酸琥珀酰转移酶（homoserine O-succinyltransferase）的metA基因、编码苏氨酸脱氨酶（threonine deaminase）的ilvA基因、编码DAP脱羧酶（diaminopimelate decarboxylase）的lysA基因、编码苏氨酸脱水酶（threonine dehydrogenase）的tdh基因、编码苏氨酸吸收转运蛋白（也可以称为serine/threonine:H⁺symporter）的tdcC基因和编码苏氨酸吸收转运蛋白（也可以称为serine/threonine:Na⁺symporter）的sstT基因共6种基因得到的菌。
在本发明的实施例中，所述出发细菌为依次敲除metA基因、ilvA基因、lysA基因、tdh基因、tdcC基因和sstT基因共6种基因得到的菌。
上述细菌为埃希氏菌属细菌，更优选是大肠杆菌，如大肠杆菌K-12菌株的后续菌株，包括W3110衍生的菌株。由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种生成苏氨酸的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵培养上述的重组菌，且在所述重组菌的第二生长阶段进行对异丙基苯甲酸诱导，收集发酵产物的上清液，得到苏氨酸；
所述第二生长阶段为指数生长后期、稳定期或衰亡期。
所述指数生长后期为自发酵培养起第13-15小时；
所述稳定期为自发酵培养起第16-50小时；
所述衰亡期为自发酵培养起第50-96小时。
上述方法中，所述对异丙基苯甲酸诱导为向发酵体系中添加终浓度为5—1000μmol/L对异丙基苯甲酸；
所述对异丙基苯甲酸诱导具体为向发酵体系中添加终浓度为5—500μmol/L对异丙基苯甲酸。
所述方法还包括如下步骤：在所述发酵培养中补加葡萄糖，使葡萄糖在发酵体系中的浓度维持在10±5g/L；且在所述发酵培养中按照质量比为0.6：1.0：1.3补加蛋氨酸、异亮氨酸和赖氨酸，使菌体比生长速率维持在0.12-0.2h^-1。
在本发明的实施例中，在所述重组菌的稳定期进行对异丙基苯甲酸诱导，即在自发酵培养起第16小时发酵体系中添加终浓度为100μmol/L对异丙基苯甲酸进行诱导。
或一种重组载体，为上述方法中的重组载体。
在本发明中，发酵方式可以使分批发酵、补料分批发酵、半连续发酵或连续发酵（微生物工程工艺原理，姚汝华周世水），优选为补料分批发酵。在理想状态下，微生物在液体发酵培养基中的典型发酵曲线包括延滞期、指数期、稳定期和衰亡期（微生物学教程，周德庆；微生物学，I.E.阿克莫著）。在实际的发酵过程中，在指数期和稳定期之间存在菌体缓慢生长的阶段，称为指数生长后期。在本发明中，术语“发酵过程的第二阶段”包括指数生长后期、稳定期和衰亡期，而术语“发酵过程的第一阶段”是指“发酵过程的第二阶段”之前的时间段，包含延滞期和指数生长期。本发明中“使改造获得的细菌的苏氨酸外排转运蛋白基因在发酵过程的第一阶段不表达或低量表达”是通过在发酵过程的第一阶段的任意一个或多个时间点不添加或添加低量诱导剂实现的；“在发酵过程的第二阶大量表达”是通过在发酵过程的第二阶段的任意一个或多个时间点添加高浓度的诱导剂实现的。
本发明的实验证明，本发明采用枯茗酸（对异丙基苯甲酸）诱导表达元件调控苏氨酸外排基因的表达，该诱导表达元件调控系统的基本原理是：恶臭假单胞杆菌F1的cymR基因编码的阻遏蛋白与cmt操纵子的调控基因Ocmt相互作用，阻止RNA聚合酶的转录作用。当胞内存在枯茗酸时，阻遏蛋白与枯茗酸结合后便失去与Ocmt序列的结合的能力，使RNA聚合酶转录继续进行。枯茗酸作为诱导物调控该转录单位的表达。使用大肠杆菌的弱启动子P_Km控制cymR基因表达，防止胞内合成高浓度的阻遏蛋白对宿主菌产生毒性（Choi,Y.J.,et al.Applied and Environmental Microbiology,2010.76(15):5058-5066.）。使用大肠杆菌的强启动子PT5与调控序列Ocmt连接，进一步在调控序列之后连接苏氨酸外排蛋白基因rhtA，rhtB和rhtC，使这三个基因的表达受枯茗酸诱导调控。
本发明采用枯茗酸（对异丙基苯甲酸）诱导表达元件与IPTG诱导的表达系统相比具有以下优点：不需要对宿主菌进行特定的遗传改造，本底表达水平低控制效果更加严谨，能够进行基因表达水平的定量调节，对大肠杆菌没有毒性，并且诱导剂价格低廉，适用于工业化生产。
本发明的有益效果在于，向敲除metA基因、ilvA基因、lysA基因、tdh基因、tdcC基因和sstT基因的出发菌中导入阻遏蛋白基因表达元件、苏氨酸外排基因表达元件和突变苏氨酸操纵子表达元件，得到的重组菌，可以在发酵对数期或稳定期对苏氨酸生产进行对异丙基 苯甲酸诱导，提高苏氨酸的产量，通过对异丙基苯甲酸诱导表达元件添加诱导剂控制苏氨酸外排蛋白基因表达的发酵过程，可使苏氨酸的生产强度提高10%—100%，糖酸转化率提高5%—50%，产量提高10%—150%，苏氨酸产量可提高至70g/L—150g/L。因此在实践上可用于细菌发酵生产苏氨酸，便于推广应用，具备重要的工业应用价值。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
附图说明
图1为苏氨酸外排蛋白基因动态表达载体pWY2167、pWY2168和pWY2169的构建
图2为重组质粒的双酶切验证
图3为动态控制rhtC、rhtCA和rhtCAB表达的工程菌的苏氨酸发酵过程曲线
图4为染色体突变thrA^C1034TBC的枯茗酸诱导型工程菌生成苏氨酸
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1、相关菌株和相关质粒的获得
1、底盘工程菌E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT的构建
在E.coli K12W3110的基础上依次累积敲除metA、ilvA、lysA、tdh、tdcC、sstT基因，用于基因敲除的引物序列如表1所示，最终获得底盘工程菌E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT。
1）metA基因敲除
以E.coli K12W3110菌株（可购自日本技术评价研究所生物资源中心(NITE Biological Resource Center,NBRC)）的基因组DNA为模板，分别以WY569和WY570、WY571和WY572为引物进行PCR扩增，得到503bpmetA上游区域和473bp metA下游区域两条ＤＮＡ片段，再以这两条ＤＮＡ片段混合为模板，以WY569和WY572为引物，通过Overlap PCR扩增，得到976bp Overlap PCR连接片段；再将Overlap PCR连接片段和pKOV质粒（可购自Addgene公司）连接，得到重组质粒，转入待敲除菌株E.coli K12W3110中，得到metA基因敲除的菌株E.coli K12W3110△metA；
使用metA基因外侧序列引物WY583和WY584菌落PCR验证基因敲除，1375bp为阳性。
具体方法如下：以抽提的野生型大肠杆菌E.coli K12W3110菌株基因组DNA为模板，分别以WY569和WY570、WY571和WY572为引物，使用EX Taq聚合酶进行PCR扩增，PCR按如下方式进行：94℃变性30s（秒），54℃退火30s（秒），以及72℃延伸30s（秒）（30个循环）。将PCR获得的两条ＤＮＡ片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以这两条ＤＮＡ片段混合为模板，以WY569和WY572为引物，通过Overlap PCR扩增的方法连接这两条片段。其中，PCR按如下方式进行：94℃变性30s（秒），54℃退火30s（秒），以及72℃延伸60s（秒）（30个循环）。将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的Overlap PCR连接片段和pKOV质 粒分别用Bam HI/Not I进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连使用T4连接酶连接，连接产物转化至E.coli DH5α化转感受态，挑选阳性克隆提质粒并测序验证，将验证正确连接Overlap PCR片段的pKOV质粒保存备用。将上述构建好的载体分别电转化入低产E.coli K12W3110感受态中，于30℃、100rpm，在LB培养基中复苏2h后，根据Addgene公司的pKOV质粒的商品指南，挑选出同源重组阳性的单克隆，使用metA基因外侧序列引物WY583和WY584菌落PCR验证基因敲除，并进一步通过测序确认其染色体上的metA基因序列敲除。
2）ilvA基因敲除
以E.coli K12W3110菌株的基因组DNA为模板，分别以WY577和WY578、WY579和WY580为引物进行PCR扩增，得到498bp和530bp两条ＤＮＡ片段，再以这两条ＤＮＡ片段混合为模板，以WY577和WY580为引物，通过Overlap PCR扩增，得到1028bp Overlap PCR连接片段；再将Overlap PCR连接片段和pKOV质粒连接，得到重组质粒，转入待敲除菌株E.coli K12W3110△metA中，得到ilvA基因敲除的菌株E.coli K-12W3110△metA△ilvA；
使用引物WY587和WY588菌落PCR验证基因敲除，1344bp为阳性。
3）lysA基因敲除
以E.coli K12W3110菌株的基因组DNA为模板，分别以WY573和WY574、WY575和WY576为引物进行PCR扩增，得到507bp和544bp两条ＤＮＡ片段，再以这两条ＤＮＡ片段混合为模板，以WY573和WY576为引物，通过Overlap PCR扩增，得到1051bp Overlap PCR连接片段；再将Overlap PCR连接片段和pKOV质粒连接，得到重组质粒，转入待敲除菌株E.coli K12W3110△metA△ilvA中，得到lysA基因敲除的菌株E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA；
使用引物WY585和WY586菌落PCR验证基因敲除，1302bp为阳性。
4）tdh基因敲除
以E.coli K12W3110菌株的基因组DNA为模板，分别以WY598和WY599、WY600和WY601为引物进行PCR扩增，得到526bp和632bp两条ＤＮＡ片段，再以这两条ＤＮＡ片段混合为模板，以WY598和WY601为引物，通过Overlap PCR扩增，得到1158bp Overlap PCR连接片段；再将Overlap PCR连接片段和pKOV质粒连接，得到重组质粒，转入待敲除菌株E.coli K12W3110△metA△ilvA△lysA中，得到tdh基因敲除的菌株E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh；
使用引物WY602和WY603菌落PCR验证基因敲除，1796bp为阳性。
5）tdcC基因敲除
以E.coli K12W3110菌株的基因组DNA为模板，分别以WY476和WY477、WY478和WY479为引物进行PCR扩增，得到525bp和536bp两条ＤＮＡ片段，再以这两条ＤＮＡ片段混合为模板，以WY476和WY479为引物，通过Overlap PCR扩增，得到1061bp Overlap PCR连接片段；再将Overlap PCR连接片段和pKOV质粒连接，得到重组质粒，转入待敲除菌株E.coli K12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh中，得到tdcC基因敲除的菌株E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC；
使用引物WY497和WY498菌落PCR验证基因敲除，1801bp为阳性。
6）sstT基因敲除
以E.coli K12W3110菌株的基因组DNA为模板，分别以WY947和WY948、WY949和WY950为引物进行PCR扩增，得到683bp和481bp两条ＤＮＡ片段，再以这两条ＤＮＡ片段混合为 模板，以WY947和WY950为引物，通过Overlap PCR扩增，得到1164bp Overlap PCR连接片段；再将Overlap PCR连接片段和pKOV质粒连接，得到重组质粒，转入待敲除菌株E.coli K12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC中，得到sstT基因敲除的菌株E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT；
使用引物WY949和WY950菌落PCR验证基因敲除，1569bp为阳性。
表1.本实施例所用的引物


2、质粒pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC的获得
质粒pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC为将突变苏氨酸操纵子表达元件（P_PL-thrA^C1034TBC，序列1自5’末端第520-5654位核苷酸）插入表达载体pACYC184（购于NEB公司，产品目录号E4152S）的Hind III和EcoR V酶切位点间得到的载体。
突变苏氨酸操纵子表达元件P_PL-thrA^C1034TBC包括突变苏氨酸操纵子thrA^C1034TBC和驱动其表达的启动子P_PL，其中，突变苏氨酸操纵子thrA^C1034TBC为序列表中序列1自5’末端第688-5654位核苷酸；启动子P_PL为序列表中序列1自5’末端第520-687位核苷酸。
具体如下：
以启动子P_PL（序列表中序列1自5’末端第520-687位核苷酸）为模板，以表2中的WY842和WY843为引物，使用Primer Star高保真聚合酶扩增启动子，用凝胶回收试剂盒回收纯化扩增的启动子，备用；
以E.coli W3110基因组为模板，分别以WY914和WY212，WY590和WY213为引物PCR扩增获得thrABC上下游片段，切胶回收thrABC上下游片段并同时以这两条片段为模板，通过overlap PCR的方法（引物为WY914和WY590）获得突变的苏氨酸操纵子thrA^C1034TBC；
用Hind III和EcoR V限制性内切酶分别双酶切pACYC184质粒和切胶回收的thrA^C1034TBC，再次使用凝胶回收试剂盒回收酶切片段；用T4连接酶连接上述双酶切的pACYC184质粒和thrA^C1034TBC基因片段，转化至DH5α感受态细胞，传代培养后筛选阳性转化子，提取质粒双酶切验证后送测序；使用Xba I和Hind III限制性内切酶双酶切pACYC184-thrA^C1034TBC质粒和扩增的启动子片段P_PL，用凝胶回收试剂盒回收酶切后的基因片段。用T4连接酶连接酶切的pACYC184-thrA^C1034TBC质粒和启动子片段P_PL，化转至DH5α感受态细胞，传代培养后筛选阳性转化子，提质粒双酶切验证后送测序获得正确的重组载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC。
表2重组载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC构建引物


3、染色体突变thrA^C1034TBC得到的工程菌E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT::P_PL-thrA^C1034TBC
在E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT工程菌染色体上增加解除反馈抑制点突变并且受强启动子控制表达的P_PL-thrA^C1034TBC，得到P_PL-thrA^C1034TBC整合到染色体lysA位点的重组工程菌。
重组工程菌E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT::P_PL-thrA^C1034TBC，为将含有P_PL-thrA^C1034TBC的片段（序列1）同源重组到底盘工程菌E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT中得到的重组菌。
含有P_PL-thrA^C1034TBC的片段包括lysA上游同源臂（序列1自5’末端第1-519位核苷酸）、P_PL-thrA^C1034TBC（序列1自5’末端第520-5654位核苷酸）和lysA下游同源臂（序列1自5’末端第5655-6210位核苷酸）。
具体方法如下：
以抽提的野生型大肠杆菌E.coli K12W3110菌株基因组染色体为模板，以WY970和WY971为引物，使用EX Taq聚合酶PCR扩增lysA上游同源臂，扩增条件为：94℃变性30s（秒），54℃退火30s（秒），以及72℃延伸30s（秒）（27个循环）。琼脂糖凝胶电泳分离纯化上述PCR扩增获得的大小为543bp条带，用Pst I/Bgl II进行双酶切543bp的上游同源臂和pKOV质粒，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连使用T4连接酶连接，连接产物转化至E.coli DH5α化转感受态，挑选阳性克隆提质粒并测序验证，将验证正确连接pKOV-lysA(上游)质粒保存备用。
以抽提的野生型大肠杆菌E.coli K12W3110菌株基因组染色体为模板，以WY974和WY975为引物，使用EX Taq聚合酶PCR扩增lysA下游同源臂，扩增条件为：94℃变性30s（秒），54℃退火30s（秒），以及72℃延伸30s（秒）（27个循环）。使用Bam HI/Xba I双酶切562bp的lysA下游同源臂和pKOV-lysA（上游）重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连使用T4连接酶连接，连接产物转化至E.coli DH5α化转感受态，挑选阳性克隆提质粒并测序验证，将验证正确连接pKOV-lysA(上游)-lysA(下游)质粒保存备用。
以重组载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC为模板，以引物WY978和WY979进行PCR扩增，获得5135bp的P_PL-thrA^C1034TBC。
使用Bgl II和Bam HI双酶切的P_PL-thrA^C1034TBC，得到的酶切产物与经过同样酶切的重组载体pKOV-lysA(上游)-lysA(下游)8560bp的载体骨架连接，连接产物转化至E.coli DH5α化转感受态，挑选阳性克隆提质粒并测序验证，将验证正确连接的pKOV-lysA(上游)-P_PL-thrA^C1034TBC-lysA(下游)质粒保存备用。
表3染色体lysA位点整合P_PL-thrA^C1034TBC的构建引物


根据Addgene公司的pKOV质粒的商品指南，将构建好的pKOV-lysA(上游)-P_PL-thrA^C1034TBC-lysA(下游)质粒电转化入上述1得到的底盘工程菌E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT中，挑选出同源重组阳性的单克隆，经测序确认其染色体上的lysA位点插入P_PL-thrA^C1034TBC片段，成功获得重组工程菌E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT::P_PL-thrA^C1034TBC。
实施例2、以质粒形式增加thrA^C1034TBC拷贝数的枯茗酸诱导型工程菌的构建
一、枯茗酸诱导表达苏氨酸外排基因的重组载体的构建
1、阻遏蛋白基因表达元件P_km-cymR的获得
以恶臭假单胞杆菌F1（购自DSMZ公司）的基因组DNA（DSM6899）为模板，以WY899与WY902为引物，以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，使用PrimeSTAR聚合酶进行PCR扩增获得cymR基因片段；琼脂糖凝胶回收PCR大小为775bp的cymR条带，继续以该cymR基因片段为模板，以WY900和WY902为引物PCR扩增，引入部分P_km启动子获得P_km1-cymR基因片段；琼脂糖凝胶回收P_km1-cymR PCR条带，继续以P_km1-cymR基因片段为模板，以WY901和WY902为引物，使用PrimeSTAR聚合酶进行PCR扩增，引入完整的P_km启动子序列获得1132bp的阻遏蛋白基因表达元件P_km-cymR，用凝胶回收试剂盒回收纯化，备用。
阻遏蛋白基因表达元件P_km-cymR（序列2）包括阻遏蛋白基因cymR（序列2自5’末端第145-917位核苷酸）及驱动其表达的启动子P_km（序列2自5’末端第1-144位核苷酸）。
2、苏氨酸外排基因表达元件的获得
使用大肠杆菌的强启动子PT5与调控元件Ocmt连接，进一步在调控元件之后连接苏氨酸外排蛋白基因rhtC,rhtA和rhtB，得到苏氨酸外排基因表达元件P_T5-Ocmt-rhtC、P_T5-Ocmt-rhtC-rhtA、P_T5-Ocmt-rhtC-rhtA-rhtB，使这三个基因的表达受枯茗酸诱导调控。
苏氨酸外排基因表达元件P_T5-Ocmt-rhtC（序列3），包括苏氨酸外排基因rhtC（序列3自5’末端第92-835位核苷酸）、驱动该基因表达的启动子P_T5（序列3自5’末端第1-59位核苷酸）和位于二者之间的调控元件Ocmt（序列3自5’末端第60-91位核苷酸）。
苏氨酸外排基因表达元件P_T5-Ocmt-rhtCA（序列4），包括苏氨酸外排基因rhtC（序列4自5’末端第92-733位核苷酸）和rhtA（序列4自5’末端第734-1706位核苷酸）、驱动该基因表达的启动子P_T5（序列4自5’末端第1-59位核苷酸）和位于二者之间的调控元件Ocmt（序列4自5’末端第60-91位核苷酸）。
苏氨酸外排基因表达元件P_T5-Ocmt-rhtCAB（序列5），包括苏氨酸外排基因rhtC（序列5自5’末端第92-733位核苷酸）、rhtA（序列5自5’末端第734-1637位核苷酸）和rhtB（序列5自5’末端第1638-2342位核苷酸）、驱动该基因表达的启动子P_T5（序列5自5’末端第1-59位核苷酸）和位于二者之间的调控元件Ocmt（序列5自5’末端第60-91位核苷酸）。
具体方法如下：
以野生型大肠杆菌E.coli K-12W3110菌株的基因组DNA为模板，以表4中的引物WY847与WY883进行PCR扩增，得到835bp的P_T5-Ocmt-rhtC；
以野生型大肠杆菌E.coli K-12W3110菌株的基因组DNA为模板，以表4中的引物WY848 与WY883进行PCR扩增得到rhtC片段，以引物WY849与WY850进行PCR扩增得到rhtA片段，然后以rhtA片段和rhtC片段为模板，以引物WY883与WY850进行PCR扩增得到1706bp的P_T5-Ocmt-rhtC-rhtA。
以野生型大肠杆菌E.coli K-12W3110菌株的基因组DNA为模板，以表4中的引物WY848与WY883进行PCR扩增得到rhtC片段，以引物WY872与WY873进行PCR扩增得到rhtB片段，以引物WY849与WY871进行PCR扩增得到rhtA片段。以rhtA片段和rhtC片段为模板，以引物WY849与WY873进行PCR扩增得到rhtA-rhtB片段。最后以rhtA-rhtB片段和rhtC片段为模板，以引物WY883与WY873进行PCR扩增得到2342bp的P_T5-Ocmt-rhtC-rhtA-rhtB。
表4、所用的引物序列


3、枯茗酸诱导表达苏氨酸外排基因的重组载体pWY2167、pWY2168、pWY2169的获得
1）连接有苏氨酸外排基因表达元件的中间载体的获得
将上述2得到的P_T5-Ocmt-rhtC、P_T5-Ocmt-rhtC-rhtA和P_T5-Ocmt-rhtC-rhtA-rhtB分别用Eco RV和Eag I双酶切，得到835bp的P_T5-Ocmt-rhtC酶切产物、1706bp P_T5-Ocmt-rhtC-rhtA酶切产物和2342bp的P_T5-Ocmt-rhtC-rhtA-rhtB酶切产物；将上述酶切产物分别与经过同样酶切的由实施例1的2获得的质粒pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC的骨架连接，得到中间载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC、中间载体_pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC-rhtA以及中间载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC-rhtA-rhtB。
将上述中间载体经过Eco RV和Eag I酶切验证，结果如图2A，M：DNA marker；泳道1、3、5、7、9、11：质粒条带（对照）；泳道2和8：通过Eco RV和Eag I双酶切质粒1和7产生的两条条带，其中小条带与目的基因片段P_T5-Ocmt-rhtCAB大小吻合（2342bp），说明该基因片段与质粒pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC连接成功；泳道10：通过EcoRV和EagI双酶切质粒9产生的两条条带，其中小条带与目的基因片段P_T5-Ocmt-rhtCA大小吻合（1706bp），说明该基因片段与质粒pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC连接成功；泳道12：通过EcoRV和EagI双酶切质粒11产生的两条条带，其中小条带与目的基因片段P_T5-Ocmt-rhtC大小吻合（835bp），说明该基因片段与质粒pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC连接成功，分别得到中间载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC、中间载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC-rhtA以及中间载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC-rhtA-rhtB。
2）枯茗酸诱导表达苏氨酸外排基因的重组载体的获得
将重组载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC、重组载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC-rhtA以及重组载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC-rhtA-rhtB分别用Nru I和Bsu36I酶切，得到pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC9205bp的骨架、pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC-rhtA10076bp的骨架和pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_T5-O_cmt-rhtC-rhtA-rhtB10712bp的骨架；将上述3个骨架分别与经过同样酶切的上述1得到的917bp阻遏蛋白基因表达元件P_km-cymR的酶切产物连接，得到重组载体pWY2167：pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_km-cymR-P_T5-O_cmt-rhtC、pWY2168：pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_km-cymR-P_T5-O_cmt-rhtCA和pWY2169：pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC-P_km-cymR-P_T5-O_cmt-rhtCAB（重组载体的结果示意图如图1所示）。
将上述重组载体经过用Nru I和Bsu36I酶切验证，结果如图2B所示；泳道13-15：NruI和Bsu36I双酶切重组质粒pWY2167、pWY2168和pWY2169，均可产生与P_km-cymR大小吻合的条带（1132bp），说明重组质粒构建成功。
重组载体pWY2167为将突变苏氨酸操纵子表达元件（P_PL-thrA^C1034TBC，序列1自5’末端第520-5654位核苷酸）插入表达载体_pACYC184的Hind III和EcoR V酶切位点，且P_T5-O_cmt-rhtC（序列3）插入表达载体pACYC184的Eco RV和Eag I，且将P_km-cymR（序列2）插入表达载体pACYC184的Nru I和Bsu36I酶切位点得到的载体；
重组载体pWY2168为将突变苏氨酸操纵子表达元件（P_PL-thrA^C1034TBC，序列1自5’末端 第520-5654位核苷酸）插入表达载体pACYC184的Hind III和EcoR V酶切位点，且将P_T5-O_cmt-rhtCA（序列4）插入表达载体pACYC184的Eco RV和Eag I，且将P_km-cymR（序列2）插入表达载体pACYC184的Nru I和Bsu36I酶切位点得到的载体；
重组载体pWY2169为将突变苏氨酸操纵子表达元件（P_PL-thrA^C1034TBC，序列1自5’末端第520-5654位核苷酸）插入表达载体pACYC184的Hind III和EcoR V酶切位点，且将P_T5-O_cmt-rhtCAB（序列5）插入表达载体pACYC184的Eco RV和Eag I，且将P_km-cymR（序列2）插入表达载体pACYC184的Nru I和Bsu36I酶切位点得到的载体。
二、增加thrA^C1034TBC拷贝数的枯茗酸诱导型工程菌的构建
将上述一制备得到的重组载体pWY2167、重组载体pWY2168、重组载体pWY2169分别电转化至由实施例1的1获得的底盘工程菌E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT中，分别得到重组菌A、重组菌B、重组菌C。
提取重组菌A的质粒送去测序，该质粒为pWY2167，含有该质粒的重组菌A命名为E.coli△/pWY2167；为增加thrA^C1034TBC拷贝数的枯茗酸诱导型工程菌；
提取重组菌B的质粒送去测序，该质粒为pWY2168，含有该质粒的重组菌B命名为E.coli△/pWY2168；为增加thrA^C1034TBC拷贝数的枯茗酸诱导型工程菌
提取重组菌C的质粒送去测序，该质粒为pWY2169，含有该质粒的重组菌C命名为E.coli△/pWY2169；为增加thrA^C1034TBC拷贝数的枯茗酸诱导型工程菌。
按照同样的方法，将表达载体pACYC184-P_PL-thrA^C1034TBC转入底盘工程菌E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT中，得到对照菌株。
实施例3、染色体突变thrA^C1034TBC的枯茗酸诱导型工程菌的构建
将实施例1的2得到的P_T5-Ocmt-rhtC分别用Eco RV和Eag I双酶切，将上述酶切产物分别与经过同样酶切的pACYC184骨架连接，得到中间载体pACYC184-P_T5-O_cmt-rhtC。
用Nru I和Bsu36I酶切重组载体pACYC184-P_T5-O_cmt-rhtC，得到4326bp的pACYC184-P_T5-O_cmt-rhtC骨架；将该骨架分别与经过同样酶切的上述1得到的917bp阻遏蛋白基因表达元件P_km-cymR的酶切产物连接，得到重组载体pACYC184-P_km-cymR-P_T5-O_cmt-rhtC，经过测序，该重组载体为将P_T5-Ocmt-rhtC（序列3）插入表达载体pACYC184的Eco RV和Eag I，且将P_km-cymR（序列2）插入表达载体pACYC184的Nru I和Bsu36I酶切位点得到的载体。
将pACYC184-P_km-cymR-P_T5-O_cmt-rhtC电转化至由实施例1的3获得的重组工程菌E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT::P_PL-thrA^C1034TBC中，得到重组菌D。
提取重组菌D的质粒送去测序，该质粒为pACYC184-P_km-cymR-P_T5-O_cmt-rhtC，含有该质粒的重组菌D命名为E.coli△/pACYC184-P_km-cymR-P_T5-O_cmt-rhtC（染色体）；为染色体上整合突变thrA^C1034TBC的枯茗酸诱导型工程菌。
实施例4、动态调控枯茗酸诱导型工程菌生产L-苏氨酸
一、增加thrA^C1034TBC拷贝数的枯茗酸诱导型工程菌的生产L-苏氨酸
1、种子液的制备：
将保存在-80℃冻存管的菌种E.coli△/pWY2167、E.coli△/pWY2168、E.coli△/pWY2169分别划线于LB平板，置于37℃培养箱培养12h，挑取菌落接种至含有3mL LB培养基的试管，置于37℃摇床，180rpm培养12h。取培养液按3%接种量接种至含有30mL种子培养基的500mL摇瓶，置于37℃摇床，220rpm培养12h，得到E.coli△/pWY2167种子液、E.coli△/pWY2168种子液、E.coli△/pWY2169种子液。
上述种子培养基由如下终浓度的物质及水组成：葡萄糖40g/L，硫酸铵15g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉2g/L，异亮氨酸0.2g/L，碳酸钙15g/L，微量元素混合液5mL/L，氯霉素34mg/L。
微量元素混合液由如下终浓度的物质及水组成：FeSO₄.7H₂O,10g/L;CaCl₂,1.35g/L;ZnSO₄.7H₂O,2.25g/L;MnSO₄.4H₂O,0.5g/L;CuSO₄.5H₂O,1g/L;(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O,0.106g/L;Na₂B₄O₇.10H₂O,0.23g/L;CoCl₂.6H₂O,0.48g/L;35%HCl,10mL/L。
2、发酵
将上述1制备的各种种子液分别按3%（体积百分含量）接种量接入含有2L发酵培养基的7.5L发酵罐中，发酵培养，在菌株生长稳定期开始时（即发酵培养时间的第16小时）添加诱导剂枯茗酸，使其在发酵体系中的终浓度为100μmol/L；分别得到E.coli△/pWY2167发酵产物、E.coli△/pWY2168发酵产物、E.coli△/pWY2169发酵产物。
发酵罐中通过加热套和冷却水控制发酵液温度维持在37℃；通入空气提供溶氧，必要时按1:1的比例通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧维持在50%；补加25%氨水调控pH维持在6.8左右。
发酵培养基由如下终浓度的物质及水组成：葡萄糖10g/L，硫酸铵10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉2g/L，微量元素混合液5mL/L，氯霉素34mg/L。
上述种子和发酵培养基中，异亮氨酸和氯霉素分别用去离子水和无水乙醇溶解配成10g/L和34g/L的储液，过滤除菌；葡萄糖配成700g/L的储液于115℃高压灭菌15min。其它培养基成分121℃高压蒸汽灭菌，种子培养基灭菌15min，发酵罐培养基灭菌20min，其中硫酸镁单独灭菌，避免产生沉淀。
在发酵培养中，手动设定7.5L115NBS发酵系统内置定速可编程控泵的转速，恒速补加葡萄糖，根据发酵过程的残糖浓度调节葡萄糖储液的恒速补加速率，使发酵体系中的葡萄糖浓度维持在10±5g/L。根据以下指数补料方程，利用BioCommand Plus BioProcessing软件控制发酵罐内置定速可编程控泵，实现指数补料。在菌体生长期（发酵培养第0-15小时）按照0.6：1.0：1.3的质量比例指数补加蛋氨酸（在发酵体系中的总补加量为1g）、异亮氨酸（在发酵体系中的总补加量为1.7g，请提供）和赖氨酸（在发酵体系中的总补加量为2.2g），使菌体比生长速率维持在0.12-0.2h^-1，维持菌体生长。
(/h),V₀和X₀分别表示初始发酵液体积(L)和细胞干重(g/L)；S_i补料储液中磷酸二氢钾或异亮氨酸的浓度(g/L),t表示补料时间，该参数是指数补料方程的唯一变量(h)；Y_X/S生物量的底物得率(g/g).
在不同的发酵时间分别将E.coli△/pWY2167发酵产物、E.coli△/pWY2168发酵产物、E.coli△/pWY2169发酵产物离心取上清液，使用高压液相色谱法（HPLC）检测氨基酸，具体方法参考文献（Liu SW et al.Applied Microbiology and Biotechnology.2013,97(2):573-583.）。
实施例2得到的对照菌株按照上述同样的方法处理。
发酵48h，苏氨酸产量结果如图3所示，在16h添加诱导剂枯茗酸诱导外排蛋白表达，O表示对照菌株，CAB表示工程菌E.coli△/pWY2169，CA表示工程菌E.coli△/pWY2168，C表示工程菌E.coli△/pWY2167。
图3A为菌体生长情况，图3B为苏氨酸产量；可以从图3A看出，在相同条件下，四种工程菌的生长速率基本一致，说明枯茗酸诱导表达系统的微量本底表达所产生的苏氨酸外排蛋白，不抑制菌体生长。
从图3B可以看出，与对照菌株相比，在菌体生长阶段外排蛋白的微量渗漏表达还会提高产酸速率，并且两个（rhtCA）和三个（rhtCAB）外排蛋白渗漏表达比仅有rhtC渗漏表达的工程菌的产酸速率快。而苏氨酸外排蛋白过量表达时，会降低菌体生长阶段的比生长速率和苏氨酸生产强度。枯茗酸诱导，仅过表达rhtC的E.coli△/pWY2167菌株的苏氨酸合成速率迅速提高，并超过过表达rhtC和rhtA的E.coli△/pWY2168和过表达rhtC、rhtA、rhtB的E.coli△/pWY2169的合成速率。
发酵48小时，过表达rhtC的E.coli△/pWY216（C）、过表达rhtC和rhtA的E.coli△/pWY2168（CA）和过表达rhtC、rhtA、rhtB的E.coli△/pWY2169（CAB）的苏氨酸产量分别为74.4g/L、66.0g/L和58.3g/L，分别比对照菌株O（苏氨酸产量为51.3g/L）提高了45.0%、28.7%和13.6%。
二、染色体突变thrA^C1034TBC的枯茗酸诱导型工程菌生成苏氨酸
种子培养方法、接种量与发酵罐发酵条件同上，发酵结果如图4所示，发酵48小时，对照菌株E.coli△/pACYC184-P_km-cymR与工程菌E.coli△/pACYC184-P_km-cymR-P_T5-O_cmt-rhtC分别积累18.5g/L和24.1g/L苏氨酸，通过在稳定期诱导苏氨酸外排蛋白基因表达使苏氨酸产量提高了30.3%。