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1、(10)申请公布号 CN 102796685 A (43)申请公布日 2012.11.28 C N 1 0 2 7 9 6 6 8 5 A *CN102796685A* (21)申请号 201210285075.X (22)申请日 2012.08.10 CGMCC No.6195 2012.06.06 C12N 1/20(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路800号 (72)发明人沈健英 孙秀敏 (74)专利代理机构上海新天专利代理有限公司 31213 代理人祖志翔 (5。
2、4) 发明名称 一株芽孢杆菌Bacillus SSAL-6及其在降解 水华鱼腥藻中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种芽孢杆菌及其在降解水华 鱼腥藻中的应用，所述芽孢杆菌从农业部都市农 业（南方）重点实验室黄化的水华鱼腥藻液中分 离筛选获得，命名为芽孢杆菌Bacillus SSAL-6， 已于2012年6月6日保存在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.6195；在自然条件下，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的降解效果随菌株浓度的 增大而增加，当芽孢杆菌的浓度为35%时，对水华 鱼腥藻叶绿素a的抑制率可高达96%。本发明所 述的芽孢杆菌。
3、Bacillus SSAL-6具有良好的溶藻 效应，能够有效地降解水华鱼腥藻，对水体富营养 化的控制提供了有效手段，为利用微生物治理水 华提供了重要的方法。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图3页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 3 页 1/1页 2 1.芽孢杆菌（Bacillus）SSAL-6，其特征在于：其保藏编号为CGMCCNo.6195。 2.如权利要求1所述的芽孢杆菌（Bacillus）SSAL-6在降解水华鱼腥藻中的应用。 3.如权利要求2所。
4、述的芽孢杆菌（Bacillus）SSAL-6在降解水华鱼腥藻中的应用的方 法，其特征在于：所述的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的浓度为35%。 权 利 要 求 书CN 102796685 A 1/4页 3 一株芽孢杆菌 Bacillus SSAL-6 及其在降解水华鱼腥藻中 的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物，具体涉及一株芽孢杆菌Bacillus SSAL-6及其在降解水 华鱼腥藻中的应用，属于微生物技术领域。 背景技术 0002 水体富营养化已成为困扰世界各国的普遍性环境问题。浮游藻类的大量繁殖导 致水华的频繁爆发，严重影响了人类的生活、生产和身体健康，造成了世界范围内。
5、的生态灾 害，探索控制水华发生的有效途径已迫在眉睫。目前治理水体富营养化主要是采用物理和 化学方法，但这两种方法不仅会消耗大量的财力和物力，而且会在一定程度上破坏生态环 境。溶藻菌作为水华和赤潮的防治生物，日益受到国内外环境工作者的广泛关注。国外 对溶藻菌的研究已有数十年的历史，自Geitler报道一种寄生在刚毛藻上的粘细菌以来， 陆续有溶藻菌的相关报道，研究重点也逐渐从单一溶藻菌的筛选及溶藻特性研究过渡到 菌-藻种群生态学及分子调控机理等方面。目前，国内对溶藻细菌的研究还处于初始阶 段，因此，寻找高效溶藻菌对溶藻菌的深入研究及应用具有重要意义。 0003 水华鱼腥藻（引起水华的常见藻类）是导。
6、致水体富营养化的主要藻种之一，其分布 广，能够产生藻毒素，直接和间接危害人类，然而截止目前，利用微生物方式控制水华鱼腥 藻的研究甚是罕见。为此，探讨溶藻菌株对水华鱼腥藻的生长效应和光合色素的影响，对于 安全、经济、高效地控制水体富营养化、治理水华具有重要的科学实践价值。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一株能够有效降解水华鱼腥藻的芽孢杆菌。 0005 本发明所述的芽孢杆菌从农业部都市农业（南方）重点实验室黄化的水华鱼腥藻 液中分离筛选获得，命名为芽孢杆菌Bacillus SSAL-6，已保存在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏日期。
7、：2012年6月 6日，保藏编号：CGMCC No.6195。 0006 本发明的另一目的是提供一种利用微生物去除水华鱼腥藻的方法，即所述芽孢杆 菌Bacillus SSAL-6应用在降解水华鱼腥藻上，以消除当前水华中水华鱼腥藻的大量繁殖 带来的环境污染问题。 0007 所述的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的浓度为35%。 0008 实验结果表明，在自然条件下，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的降解效 果随菌株浓度的增大而增加，当芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的浓度为35%时，对水华鱼腥藻 叶绿素a的抑制率可高达96%。本发明所述的芽孢杆菌Bacillus S。
8、SAL-6具有良好的溶藻 效应，能够有效地降解水华鱼腥藻，对水体富营养化的控制提供了有效手段，为微生物治理 水华的研究提供了重要基础。 说 明 书CN 102796685 A 2/4页 4 附图说明 0009 图1为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6在1000下的染色显微图。 0010 图2为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻细胞数的影响。 0011 图3为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻干重的影响。 0012 图4为本发明的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响。 0013 图5为本发明的芽孢杆菌Ba。
9、cillus SSAL-6对水华鱼腥藻叶绿素a的影响。 具体实施方式 0014 实施例1、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的分离、纯化及其鉴定 0015 1、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的分离及纯化 0016 以农业部都市农业（南方）重点实验室黄化的水华鱼腥藻液作为溶藻细菌的分离 源，采用涂布平板法及分区划线法多次纯化分离，将分离获得的25株细菌分别置于100mL LB液体培养基中，摇床转速为180rmin -1 ，37下培养24h，然后分别取800L滴加到水 华鱼腥藻固体平板上，通过溶藻斑的大小考察、比较各菌的溶藻效果，最终筛选出具有较高 溶藻效应的菌株SSAL-6。经鉴定为。
10、芽孢杆菌，命名为Bacillus SSAL-6。将其接入斜面培 养基，于冰箱4保存；将扩大培养制成的菌悬液加入到灭菌的甘油中，甘油的最终浓度为 25%，放入-80的冰箱保藏。 0017 所述的LB液体培养基组分及配比为：酵母提取物，5g；胰蛋白胨，10g；NaCl，10g； 蒸馏水1000mL；pH7.0-7.2。 0018 所述的LB固体培养基组分及配比为：酵母提取物，5g；胰蛋白胨，10g；NaCl，10g； 琼脂粉，15g；蒸馏水1000mL；pH7.0-7.2。 0019 所述的水华鱼腥藻固体培养基组分及配比为：磷酸氢二钾(K 2 HPO 4 )，0.075g；硫酸 镁(MgSO 4 。
11、H 2 O)，0.125g；碳酸钙(CaCO 3 )，0.100g；柠檬酸铁(1%水溶液)，0.5mL；柠檬酸 (1%水溶液)，0.5mL；钼酸(1%水溶液)，5滴；氢氧化钠(1%水溶液)，1.5mL；琼脂粉，15g； 蒸馏水，1000mL。 0020 2、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6的生理生化鉴定 0021 该菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，杆状，芽孢为椭圆形，大多中央生菌落呈近橘黄 色。 0022 使用引物7 f ( 5 - C A G A G T T T G A T C C T G G C T - 3 )和 1540r(5AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3)。经序列比对表明，。
12、该菌株为芽孢杆菌，将其命名为 Bacillus SSAL-6。该芽孢杆菌Bacillus SSAL-6已于2012年6月6保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号），保存号为CGMCCNo.6195。 0023 实施例2、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻生长效应和光合色素的影响 0024 1、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻生长效应的影响 0025 水华鱼腥藻培养参照藻类生长抑制实验的标准方法（国家环保部），采用水生111 号无氮培养液培养，pH为7.5。培养温度302，连续24h光照，光照。
13、强度3000200lx， 静置培养，每天定期摇动3次。 0026 在水华鱼腥藻浓度为510 4 110 5 个/mL时，分别向100mL藻液中加入芽孢杆 说 明 书CN 102796685 A 3/4页 5 菌BacillusSSAL-6（菌体浓度约为10 9 个/mL），处理浓度(v/v)梯度为：5%、10%、15%、20%、 25%、30%和35%，每组样设3个重复。制备与实验组相同的一系列不同配比的培养液（LB培 养液：水生111号无氮培养液），分别用于培养芽孢杆菌Bacillus SSAL-6和水华鱼腥藻形 成对照组。以细胞计数法测定藻体细胞数量并测定水华鱼腥藻干重。细胞计数方法：从接。
14、 种计时起，每隔24h取样，用计数框进行细胞计数。用移液器取经过超声波破碎仪打碎过的 藻液0.1mL于计数框中，在低倍镜下观察，放大倍数4010，随机取五个视野，数出所看到 的细胞数，取其平均值。N=10aS 计 /S 视 ，其中，a-每个视野内细胞平均值，S 计 -计数框 面积，S 视 -视野面积，N-每mL中细胞个数。水华鱼腥藻干重测定方法：取定量的藻液，离 心得藻，加入称量皿，在80烘至恒重。 0027 不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的细胞数的影响的测定结果 如图2所示。结果表明，水华鱼腥藻细胞的去除效果与芽孢杆菌Bacillus SSAL-6浓度呈现 出一。
15、定的浓度-相关性，即随着芽孢杆菌Bacillus SSAL-6浓度的增长，对水华鱼腥藻细 胞的去除作用增强。当芽孢杆菌Bacillus SSAL-6菌体浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%和 35%时，培养24h对水华鱼腥藻细胞的去除率分别为3%、7%、12%、16%、19%、22%和25%，培养 168h后分别变为5%、17%、26%、29%、31%、34%和36%，与对照相比，呈现显著差异（P0.05）。 0028 不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻的干重的影响的测定结果如 图3所示。结果表明，纯LB液体培养基的投入对水华鱼腥藻干重亦会产生影响，当L。
16、B液体 培养基浓度依次为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%时，培养168h后的水华鱼腥藻干重相 应增加，分别为15.90、16.40、16.77、17.74、18.11、19.38和22.04mg/mL。通过排除LB液体 培养基本身对水华鱼腥藻生长的影响因素，可见，随着菌体浓度从5%依次升至35%，芽孢杆 菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻干重的抑制率依次为5%、16%、27%、31%、36%、37%和40%。 0029 所述的水华鱼腥藻液体培养基组分及配比为：磷酸氢二钾(K 2 HPO 4 )，0.075g；硫酸 镁(MgSO 4 H 2 O)，0.125g；碳酸。
17、钙(CaCO 3 )，0.100g；柠檬酸铁(1%水溶液)，0.5mL；柠檬酸(1% 水溶液)，0.5mL；钼酸(1%水溶液)，5滴；氢氧化钠(1%水溶液)，1.5mL；蒸馏水，1000mL。 0030 2、芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻光合色素的影响 0031 以Bhandari and Sharma法连续扫描400750nm波长范围内色素吸收光谱，并 对水华鱼腥藻叶绿素a含量进行测定。叶绿素a的提取测定：取水华鱼腥藻藻液10mL过 0.45m的混合纤维素膜，将带藻细胞的膜冷冻过夜，取出后迅速用8mL热乙醇于热水浴中 萃取2min，将萃取液超声破碎5-20min后，于暗处。
18、静置2-6h，离心(5000r/min,4)5min 后取上清液3.5mL置于比色皿中，于665nm和750nm处测吸光值，计算酸化前的光密度值 （E 665b Abs 65b -Abs 750b ），然后滴加200L的1mol/L盐酸酸化，5min后于波长665nm和750nm 处再测吸光值，计算酸化后的光密度值（E 665a Abs 665a -Abs 750a ）。采用热乙醇为萃取溶剂， A=11.5，K=2.43，比色皿光程为1cm 0032 0033 不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响的测定 结果如图4所示。结果表明，不同浓度的芽孢杆菌Ba。
19、cillus SSAL-6作用于水华鱼腥藻时， 其色素光谱吸收曲线变化差异较大。高浓度（25%）处理下光谱吸收曲线已非常不明显， 说 明 书CN 102796685 A 4/4页 6 各处峰值模糊甚微，表明芽孢杆菌Bacillus SSAL-6已大大地抑制了藻体色素的种类和含 量。中低浓度（525%）处理下，随着菌体浓度的增加，各色素光谱吸收峰值均有降低，这与 溶藻菌对藻体细胞数以及干重的影响相一致，谱图充分体现溶藻菌的浓度相关性。 0034 叶绿素a是光能的捕获者，也是叶绿体膜内光传导者，因此叶绿素a含量的多少， 充分反映出藻体光合成能力的强弱。不同浓度的芽孢杆菌Bacillus SSAL-。
20、6对水华鱼腥藻 叶绿素a的影响的测定结果如图5所示（A、B、C、D、E、F、G、H分别代表芽孢杆菌Bacillus SSAL-6浓度为0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%）。结果表明，芽孢杆菌Bacillus SSAL-6 对叶绿素a的抑制作用随着菌体浓度的增加而增强。菌体浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30% 和35%，对芽孢杆菌Bacillus SSAL-6而言，24h对叶绿素a的抑制率分别为8%、14%、21%、 29%、35%、42%和46%，168h后依次升至74%、81%、90%、94%、95%、95%和96%。此外，芽孢杆菌 Bacillus S。
21、SAL-6对叶绿素a的抑制率亦随着时间的延伸而增大，但增势趋缓，如浓度为 35%的芽孢杆菌Bacillus SSAL-6在24120h内对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率由46%逐 渐升至95%，而120168h由95%仅升至96%。 说 明 书CN 102796685 A 1/2页 7 0001 0002 序 列 表CN 102796685 A 2/2页 8 序 列 表CN 102796685 A 1/3页 9 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102796685 A 2/3页 10 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102796685 A 10 3/3页 11 图5 说 明 书 附 图CN 102796685 A 11 。