单酯型乌头碱半抗原化合物及其多抗、试剂盒与应用技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种半抗原化合物及其多克隆抗体、
试剂盒与应用。
背景技术
乌头类药材乌头碱类化合物为二萜型生物碱，依据其结构母核上取代基的不同划
分为三类：单酯型，双酯型和无酯型。单酯型生物碱包括苯甲酰乌头碱，苯甲酰中乌头碱，苯
甲酰次乌头碱等，为乌头类药材的主要药效成分之一，其药理作用主要有抗炎镇痛，抗心律
不齐及抗癫痫等。
乌头类药材在临床应用及其广泛，用于祛风散寒、化瘀止血、止痛消肿、温补肾阳
等，是多种复方药如云南白药、小活络丸，万通筋骨片、附子理中丸、附桂地黄丸等的主要成
分。为确保用药安全，临床上多采用乌头类药材的炮制品。但由于炮制方式和程度的不同会
使药材中单酯型乌头碱含量有较大的差距，且单酯型乌头碱在药材中的含量极低，以至于
其质量控制较难掌控。同时作为主要的药效成分，单酯型乌头碱的药代动力学的研究对于
其体内毒性和药效的评价也很必要。因此一种能够简单快速检测单酯型乌头碱的方法对人
工在线检测药材质量或药效评价是至关重要的。
据报道，现在主要能够检测乌头碱的方法有HPLC，GC和LC-MS。其中，HPLC无法检测
含量极低的单酯型乌头碱，而GC，LC-MS需要及其复杂的预处理过程，无法做到简单快速的
现场检测。基于以上原因，本发明人曾开发了一种检测双酯型乌头碱的酶联免疫检测试剂
盒，能够简单快速的测定不同样品中双酯型乌头碱的含量，与HPLC的检测结果进行对比后
发现:检测结果相似度极高，而且酶联免疫法的检测限更低，灵敏度更好，说明此种方法的
可行性极高。
酶联免疫法具有无法比拟的技术优势：样品的预处理简单、准确度极高、灵敏度
高，检测限度可达ng甚至pg级，适合大批量样品的快速分析。此方法不仅可以开展对微量痕
量中药成分的定性定量分析，而且能够为中药成分的体内药代动力学研究提供简单有效的
检测方法。此种方法开发的基础是特异性抗体的制备，此种抗体研发先期投入较大技术要
求较高，但一旦研发成功，可形成特征性抗体的工程菌株，可成为专有技术，不仅寻求专利
保护，而且还可以由此开发出如酶联免疫检测试剂盒等市场应用型的产品，因而具有良好
的应用前景和市场开发价值。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种能够特异性识别单酯型乌头碱的多克隆抗体及其试
剂盒与应用。
具体地说，本发明的第一方面是提供了一种半抗原化合物3-戊二酰基苯甲酰新乌
头碱，其特征在于，它具有如下结构式(Ⅰ)：
本发明的第二方面是提供了一种单酯型乌头碱的多克隆抗体，由半抗原与牛血清
白蛋白的偶联物免疫新西兰兔后获得，其特征在于，所述半抗原为具有如下结构式(Ⅰ)的3-
戊二酰基苯甲酰新乌头碱：
在一优选例中，所述3-戊二酰基新乌头碱可经由以下方法制得：
(1)取苯甲酰新乌头原碱76.8mg与戊二酸酐135.0mg(摩尔比为1:9.1)，吡啶2mL室
温反应10h，6ml冰水终止反应后，用24ml乙酸乙酯萃取3次，减压蒸干。取水层60℃旋干，得
77.7mg无色膜状产物。
本发明的第二方面是提供了上述多克隆抗体在检测单酯型乌头碱中的应用。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述单酯型乌头碱的多克隆抗体。
本发明的单酯型乌头碱多克隆抗体，具有如下优点：
1.本发明的单酯型乌头碱多抗可以稀释320000倍使用，从而降低了成本；
2.本发明的单酯型乌头碱多抗的检测限为1.15ng，灵敏度较高；
3.本发明的单酯型乌头碱多抗特异性强，与双酯型乌头碱的交叉反应均小于2％，
而与乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱无交叉反应。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求
的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1为半抗原(AC-GS)的ESI-MS图谱。
图2为半抗原(AC-GS)的1H-NMR图谱。
图3为半抗原(AC-GS)的HMBC二维谱。
图4为半抗原(AC-GS)的HSQC二维谱。
图5为半抗原(AC-GS)的13C-NMR图谱。
图6牛血清白蛋白的MALDI-TOFMS图谱(分子量66431.1Da)。
图7乌头碱免疫抗原的MALDI-TOFMS图谱(分子量79724.3Da)。
图8单酯型乌头碱检测试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明
而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条
件或按照制造厂商所建议的条件(其中，乌头碱对照品购自成都曼斯特生物公司；N,N’-二
环乙基碳化亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、TMB、牛
血清白蛋白(BSA)以及卵清白蛋白OVA等均购自美国Sigma公司；其他化学试剂均符合分析
标准；新西兰大白兔2只，雄性，每只体重2.5kg)。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、
比例、或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意
义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中
所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭
示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相
同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似
特征的一般性例子。
实施例1 半抗原—3-戊二酰基新乌头碱(AC-GS)的制备及鉴定
1.取苯甲酰新乌头原碱76.8mg(0.130mmol)与戊二酸酐135.0mg(1.184mmol，摩尔
比为1:9.1)，吡啶2mL室温反应10h，6ml冰水终止反应后，用24ml乙酸乙酯萃取3次，减压蒸
干。取水层60℃旋干，得77.7mg无色膜状产物。
2.经过ESI-MS、13C-NMR、1H-NMR、HMBC、HSQC二维谱鉴定式Ⅰ化合物化学结构。ESI-
MS测定仪器：MSD-Trap-XCT，Q-Tof micro(ESI-MS)型质谱仪(Agilent公司)，1H-NMR、13C-
NMR及HMBC、HSQC测定均采用AVANCE III-400核磁共振仪(Bruker公司)
3.1.从ESI-MS看出，式Ⅰ化合物分子离子峰m/z信号为704[M]+，说明反应产物相对
分子质量为703，与乌头碱相对分子质量相比增加114，这与乌头碱与一分子戊二酸酐单酯
化后的产物增加的相对分子质量正好一致，说明戊二酸酸酐已经与乌头碱产生了酯化反应
(图1)。
3.2.1H-NMR谱(图2)中出现δH＝4.98的H，且HMBC谱(图3)中δH 4.94的H与C＝O上的
C有相关性即是发生反应的C上的H，HSQC二维谱(图4)中δH＝4.98对应的δC＝71.84，且δH＝
4.94的H与C4和C19相关，推断戊二酸连接在C3位置上，即式Ⅰ结构为3-戊二酰基乌头碱。
1H-NMR谱(图2)和13C-NMR谱(图5)的具体解析结果如表1所示：
表1 H/C谱解析结果
实施例2 免疫抗原(AC-GS-BSA)和包被抗原(AC-GS-OVA)的制备
1.准确称取3-戊二酰基乌头碱42.5mg、N-羟基琥珀酰亚胺17.4mg、N,N′-二环乙基
碳化亚胺27.0mg添加至2mL DMF中，置磁力搅拌器上避光室温搅拌4h。将90.9mg BSA溶于
2mL 0.01mol·L-1PBS(pH7.4)中,然后在搅拌下逐滴加入到上述反应液中，于4℃搅拌反应
过夜。
2.反应完毕后将反应物用双蒸水透析72h，冷冻干燥得白色粉末，-20℃保存。
3.采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)鉴定免疫原偶联物
(AC-GS-BSA)的偶联情况：
MALDI-TOFMs可以直接显示免疫操作的半抗原数(Hapten Number)，方法简洁快
速。
图6为BSA的MALDI-TOFMS图谱，由该图可知BSA的分子量为66431.1Da。
图7为AC-BSA复合物的MALDI-TOFMS图谱，AC-BSA的主峰出现于m/z 75862.0Da附
近。
己知BMC-GS的分子量是703，可计算得到AC-BSA的偶联率为13。
计算公式＝(AC-GS-BSA--BSA)/BMC-GS＝(79724.3/80348.5-66431.1)/703。
4.用相同方法制备包被抗原即3-戊二酰基乌头碱与鸡血清白蛋白的偶联物(AC-
GS-OVA)。
实施例3 用免疫抗原免疫新西兰兔获得单酯型乌头碱多抗
一、免疫抗原的配置：BMC-GS-BSA溶液加入弗氏完全佐剂形成白色油包水型的乳
浊液。加强免疫时，将相同浓度的BMC-GS-BSA加入等体积的弗氏不完全佐剂。
二、免疫动物：兔子在免疫前单笼饲养7-10天，观察健康状况后进行免疫。在免疫
前耳缘静脉取血1.5-2mL作为阴性血清。首次免疫时，每只兔子于脊柱两侧分6点皮下注射，
每隔14天进行1次加强免疫。末次免疫后第7天，兔颈动脉取血，分离多克隆抗体血清。
三、免疫监控：以免疫前兔血清为阴性对照，每次加强免疫后7d从兔耳缘静脉取血
1mL，按血清效价测定方法进行效价测定。
采用间接ELISA方法测定：
(1)将浓度为10μg/ml的包被抗原(BMC-GS-OVA，按实施例2的方法制备)包被酶标
板，4℃过夜；
(2)采用洗液洗板后用封闭液进行封闭，150μL/孔，37℃孵育1h；
(3)洗液洗板后，每孔加入100μL从1:1000开始倍比稀释的抗体血清，另用空白血
清作阴性对照，于37℃孵育2h。
(4)洗液洗板，每孔加入稀释20000的HRP标记山羊抗鼠酶标二抗100μL，37℃孵育
1h；
(5)洗液洗板，每孔加入显色液100μL，37℃温箱孵育20min后每孔加入50μL终止液
后在酶标仪上测定各孔OD450nm值。阴性对照OD450值为N，阳性对照OD450值为P。若P/N≥2.1且
P-N＞0.2即为阳性，若1.5＜P/N＜2.1为可疑，P/N≤1.5为阴性。
四、血清处理方法：免疫结束后兔颈动脉取血，室温静置1h，4℃静置过夜，待其凝
固，略有上清析出时，3000rpm离心10min，取出上层抗血清。与等量甘油混合后-20℃冰箱保
存。
实施例4 单酯型乌头碱多抗的纯化
1.用50％饱和硫酸铵沉淀：
(1)逐滴加入饱和硫酸铵5ml，前期要等出现的沉淀溶解后再继续，直至不再溶解，
继续加完至50％，放入冰箱，4℃下静置2h；
(2)将所得血清沉淀物转入离心管中，4℃下10 000r/min离心30min，将上清液弃
去，取沉淀物溶于2ml PBS。
2.用33％饱和硫酸铵沉淀：
取上述含沉淀的PBS溶液，逐滴加入1.2ml的饱和硫酸铵至33％，4℃静置2h，同样
条件下离心，取沉淀物，用1mLPBS溶解沉淀。
实施例5 单酯型乌头碱多抗的特性鉴定
一.单酯型乌头碱多抗的鉴定
(1)蛋白含量测定：取4ul蛋白标品与样品加入到96孔板的各孔中；每孔加入200ul
的BCA工作液，摇晃混匀30s，在37℃孵育30min；冷却至室温，使用酶标仪在562nm检测吸光
值；以BSA浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。在标准曲线的线性范围内，根
据各蛋白试样的校正吸光值，以及样品稀释度，计算出样品的蛋白浓度为14.98mg/ml。
(2)单酯型乌头碱抗体的特异性鉴定：系列稀释乌头碱,中乌头碱,次乌头碱，苯甲
酰乌头碱,苯甲酰中乌头碱,苯甲酰次乌头碱，乌头原碱，中乌头原碱，次乌头原碱，用间接
竞争ELISA方法检测多抗与其的交叉反应：取出2.5μg/ml的包被抗原包被好的酶标板，洗液
洗板后，加入封闭剂37℃封闭1小时；洗液洗板后，每孔加入50μL的竞争药物和50μL稀释到
最适浓度的抗体溶液进行竞争反应，37℃孵育2小时；洗液洗板后，加入HRP标记羊抗鼠酶标
二抗，100μL/孔，37℃孵育；洗液洗板后，加底物显色，100μL/孔，37℃显色后直接加入2M
H2SO4，50μl/孔；用酶标仪测定终止反应后的酶标板在450nm处的吸光值。交叉反应计算公
式如下：
交叉反应(％)＝[IC50(半抗原)/IC50(竞争药物)]×100％
结果表明(表3)：苯甲酰新乌头碱(BMC)与单酯型乌头碱类化合物苯甲酰乌头碱
(BAC)、苯甲酰次乌头碱(BHC)的交叉反应分别为70.28％、143.39％，与双酯型乌头碱类化
合物乌头碱(AC)、新乌头碱(MC)、次乌头碱(HC)的交叉反应为1.19％、1.69％、0.95％，而与
乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱无交叉反应。
表3 与其他化合物的交叉反应表
实施例6单酯型乌头碱酶联免疫检测试剂盒的制备及其应用
一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成：
(1)预包被抗原的酶标板：用包被缓冲液将包被抗原稀释成2.5μg/ml，每孔加入
100μl，4℃过夜，次日倾去包被液，用稀释好的洗液洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入150μl
封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝箔袋密封保存。
(2)单酯型乌头碱对照标准品和阴性对照标准品。
(3)单酯型乌头碱多抗
(4)辣根过氧化物酶标记的兔二抗。
(5)抗体稀释液：0.01M PBS，pH 7.6。
(6)10×浓缩洗液：含有0.5％吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
(7)显色液A液，显色液B液。使用前将A液与B液等体积混合。
(8)终止液：2M硫酸溶液。
二、试剂盒的应用
(一)检测方法
1.样品前处理
取生附子粉末2.0g，精密称定，置于塞锥形瓶中，加氨试液3ml，精密加入异丙醇-
乙酸乙酯(1:1)混合溶液50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙
酸乙酯(1:1)混合溶液补足减少的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，40℃下减压回收
溶剂至干，残渣精密加入乙醇混合溶液3ml溶解，滤过即得。用乙醇稀释成10-50倍的溶液。
将上述溶液用PBS稀释成含10％乙醇的待测样品溶液。
2.单酯型乌头碱标准溶液配制
将苯甲酰新乌头原碱标准品用乙醇配制500000-5ng/mL的不同浓度溶液，将上述
溶液用PBS稀释成含10％乙醇的标准溶液。
3.用试剂盒检测
(1)检测步骤
取出所需数量的微孔和所有试剂常温下放置10min。先分别加50μL各浓度的单酯
型标准液以及待测样品加到微孔中，再加入50μL的单酯型乌头碱多抗稀释液(1：20000)，阳
性对照孔为50μL多抗稀释液加50μL含10％乙醇的PBS，空白孔为50μL PBS加50μL含10％乙
醇的PBS，37℃，孵育120min。倒去孔内液体，加入400μl洗液到每个微孔内，轻轻晃动数秒，
快速翻转将微孔内液体倒尽，向一叠干净的吸水纸拍几下，如此重复操作共洗板3次。加入
100μl酶标二抗工作液，37℃，孵育60min。倒去孔内液体并洗板3次。将显色A液和显色B液等
量混合配成底物显色液。每个微孔加入100μl的底物显色液，室温避光显色15-20min。加入
终止液50μl，用酶标仪于450nm下测定吸光度值。
(2)试剂盒重复性和稳定性测试以及结果计算
板内精密度测试：取同一块酶标板上的6个微孔，用待测样品进行测试，实验重复3
次。
板间精密度测试：取同一批次的3块酶标板，用待测样品进行测试，实验重复3次。
变异系数的计算方法：变异系数(CV)＝测定结果的标准差与其平均值的百分比。
结果计算：以加入双酯型乌头碱标准品时的吸光值为B，不加标准品时的吸光值为
B0，B/B0为纵坐标，lg(标准品，ng/mL)为横坐标；以ln((B/B0)/(1-B/B0))为纵坐标，lg(标
准品，ng/mL)为横坐标，如图8所示，线性方程为Y＝-0.7445x+1.9274，R2＝0.9975。线性范
围为5ng/ml～50μg/ml，检测限为1.15ng，灵敏度较高，计算出生附子药材中单酯型乌头碱
含量为0.372mg/g(表4和表5)。
表4 板内重复性测试结果
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神
之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请
所附权利要求的覆盖范围。